Методическая статья

Проведение полногеномного скрининга CRISPR in vitro в Т-клетках химерного антигенного рецептора

DOI:

10.3791/67338

⸱

31 января 2025 г.

 ,  , 
1T Cell Engineering, Mayo Clinic, 2Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, 3Department of Molecular Pharmacology and Experimental Therapeutics, Mayo Clinic, 4Center for Regenerative Biotherapeutics, Mayo Clinic, 5Division of Hematology, Mayo Clinic, 6Department of Immunology, Mayo Clinic

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В статье описан протокол применения in vitro модели истощения для завершения полногеномного скрининга нокаута CRISPR в Т-клетках здорового донорского химерного антигенного рецептора.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клеточная терапия химерным антигенным рецептором Т (CART) является инновационной формой таргетной иммунотерапии, которая произвела революцию в лечении рака. Тем не менее, долгосрочная реакция остается ограниченной. Недавние исследования показали, что эпигенетический ландшафт преинфузионных клеточных продуктов CART может влиять на ответ на терапию, и в качестве решения было предложено редактирование генов. Тем не менее, необходимо провести дополнительную работу, чтобы определить оптимальную стратегию редактирования генов. Полногеномный скрининг CRISPR стал популярным инструментом как для исследования механизмов устойчивости, так и для оптимизации стратегий редактирования генов. Тем не менее, их применение к первичным клеткам сопряжено со многими проблемами. Здесь мы описываем метод завершения полногеномного скрининга нокаута CRISPR в клетках CART от здоровых доноров. В качестве экспериментальной модели мы разработали этот метод для исследования развития истощения в клетках CART, нацеленных на антиген CD19. Тем не менее, мы считаем, что этот подход может быть использован для рассмотрения различных механизмов резистентности к терапии в различных конструкциях CAR и моделях опухолей.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клеточная терапия химерным антигенным рецептором Т (CART) показала впечатляющие успехи в лечении злокачественных новообразований В-клеток; Тем не менее, устойчивая реакция ограничена 30-40%1,2,3,4,5. В то время как исследователи разработали и протестировали несколько подходов к устранению механизмов резистентности к клеточной терапии CART, включая оптимизацию дизайна CAR, редактирование генов и комбинированную терапию, развитие резистентности остается в значительной степени неизвестным. В последнее время появляется все больше доказательств того, что исходный профиль экспрессии генов преинфузионных клеточных продуктов CART является важным фактором, определяющим как токсичность, так и эффективность терапии CART 6,7,8,9. Таким образом, редактирование генов во время производства клеток CART стало популярным подходом для повышения успешности клеточной терапии CART.

Например, наша лаборатория ранее показала, что использование кластеризованных регулярно чередующихся коротких палиндромных повторов (CRISPR) технологии Cas9 для нокаутирования гена гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) улучшает активность клеток CART и уменьшает признаки токсичности, связанной с CART 10,11,12. Кроме того, клеточная терапия, разработанная с помощью CRISPR, была протестирована в клинических испытаниях и показала эффективность и безопасность13. В совокупности это указывает на то, что редактирование генов с помощью технологии CRISPR может не только улучшить наше понимание клеточной биологии CART, но и создать транслируемые клеточные продукты CART.

Полногеномные нокаут-скрининги CRISPR становятся все более популярными инструментами в исследованиях биологии рака, позволяющими понять механизмы устойчивости к терапевтическим препаратам. В этом методе десятки тысяч направляющих РНК (гРНК) доставляются в пулы клеток, чтобы стимулировать поступление одной гРНК на клетку14. Затем клетки подвергаются условиям, вызывающим давление, когда клетки, трансдуцированные гРНК, нацеленными на основные гены, умирают, а клетки, трансдуцированные гРНК, нацеленными на ингибирующие гены, выживают и размножаются. Используя секвенирование нового поколения, мы можем определить, как репрезентация гРНК изменяется на протяжении всего скрининга CRISPR14.

Тем не менее, масштаб и время отбора, необходимые для полногеномных возмущений генов, могут быть сложными для достижения в первичных клетках, таких как клетки CART. Таким образом, группы использовали целевые скрининги CRISPR для дальнейшего понимания механизмов терапевтической резистентности15,16. Целевые скрининги часто легче проводить в первичных ячейках, поскольку они имеют меньшие библиотеки, которые требуют меньшего количества ячеек для достижения адекватного представления библиотеки. В то время как эти исследования улучшили наше понимание механизмов устойчивости к клеточной терапии CART, таргетный скрининг вносит смещение из-за ручного выбора генных мишеней. В данной статье предпринята попытка описать метод проведения in vitro полногеномного нокаут-скрининга CRISPR в клетках CART от здоровых доноров. Таким образом, этот высокопроизводительный подход позволяет эффективно, непредвзято идентифицировать ключевые пути и гены, которые могут быть отредактированы для улучшения терапевтических реакций 17,18,19.

В частности, протокол, описанный в этой статье, предназначен для повышения понимания истощения CART-клеток в этой области путем завершения полногеномного скрининга нокаута CRISPR моделью истощения in vitro. Истощение является дисфункциональной судьбой клеток CART, которая связана с отсутствием ответа на клеточную терапию CART 20,21,22. Известно, что эта клеточная судьба эпигенетически регулирована и характеризуется снижением пролиферации CART-клеток, снижением продукции эффекторных цитокинов и увеличением экспрессии тормозных рецепторов23. В предшествующей литературе редактирование генов было способно предотвратить развитие истощения путем повышения или понижения уровня ключевых генов 24,25,26. Учитывая как снижение пролиферативной способности по мере истощения клеток CART, так и доказательства того, что редактирование генов может предотвратить его возникновение, мы смоделировали наш скрининг нокаута CRISPR in vitro на основе этой клеточной судьбы. Тем не менее, в будущем этот протокол может быть изменен для изучения других механизмов резистентности к клеточной терапии CART.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Важно отметить, что протокол, изложенный ниже, соответствует рекомендациям и получил одобрение Институционального наблюдательного совета клиники Майо (IRB 18-005745) и Институционального комитета по биобезопасности (IBC HIP00000252.43). Все работы с клеточными культурами, включая производство лентивирусов, должны проводиться в капюшоне для клеточных культур с соответствующими средствами индивидуальной защиты. В частности, лентивирусная работа должна проводиться в соответствии с мерами предосторожности уровня биобезопасности 2 (BSL-2), включая использование 10% отбеливателя для дезинфекции предметов перед утилизацией.

1. Расширение библиотеки CRISPR

  1. Увеличьте библиотеку CRISPR в соответствии с рекомендациями производителя. Вкратце, электропорируйте библиотеку CRISPR на четыре аликвоты электрокомпетентных ячеек, выполнив следующие действия:
    1. Добавьте 2 мкл плазмиды библиотеки CRISPR 50 нг/мкл к 25 мкл электрокомпетентных элементов в кювете диаметром 1,0 мм.
    2. Электропорировать образцы с использованием следующих настроек: 10 мкФ, 600 Ом, 1 800 вольт и постоянная времени от 3,5 мс до 4,5 мс.
    3. Восстановите в 975 мкл восстановительной среды и переложите в пробирку с дополнительным 1 мл восстановительной среды.
    4. Вращайте все аликвоты со скоростью 250 об/мин в течение 1 часа при 37 °C.
  2. Таблицы преобразований:
    1. Объедините все аликвоты электропорированных ячеек и хорошо перемешайте.
    2. Нанесите 400 μл трансформационной смеси на предварительно подогретые 10-сантиметровые пластины бульона Лурии (LB) с 100 мкг/мл карбенициллина. Поместите планшет в инкубатор при температуре 32 °C на 14 часов.
  3. Сбор урожая в колониях:
    1. Пипеткой нанесите 1 мл LB среды + 100 мкг/мл карбенициллина на каждую пластину. Соскребите колонии с каждой пластины и соберите их в коническую пробирку объемом 50 мл.
    2. Добавьте еще 1 мл LB среды + 100 мкг/мл карбенициллина на каждую пластину для мытья и обеспечения полного восстановления.
    3. Выполните maxi-prep, следуя инструкциям набора maxi-prep.
    4. Объедините полученную плазмидную ДНК.

2. Секвенирование нового поколения для проверки представления исходной гРНК в библиотеке CRISPR

ПРИМЕЧАНИЕ: Праймеры NGS для этой библиотеки CRISPR были разработаны в предыдущей публикации27. Использование разного обратного праймера для каждого образца позволит штрих-кодировать каждый образец и обеспечить объединение образцов во время секвенирования.

  1. Подготовить образцы для ПЦР с помощью следующей реакционной смеси (общий объем = 50 μл): мастер-смесь для ПЦР высокой точности, 2x: 25 μL; объединенная матричная ДНК, 0,5 мкг: 1 мкл; Прямой праймер библиотеки NGS, 10 мкМ: 1,25 мкл; обратный праймер библиотеки NGS, 10 мкМ: 1,25 мкл; Вода без ДНКазы: 21,5 мкл.
  2. Проводят ПЦР со следующими условиями цикла: цикл 1: денатурация при 98 °С в течение 3 мин; циклы 2-23: денатурация при 98°С в течение 10 с, отжиг при 63°С в течение 10 с, удлинение при 72°С в течение 25 с; цикл 24: продлить при температуре 72 °C в течение 2 минут.
  3. Очистите реакцию ПЦР путем объединения реакций ПЦР для каждого образца и очистки продукта ПЦР с помощью набора для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями производителя.
  4. Внесите 3 мкг продукта ПЦР для каждого образца на 2% (по мас./об.) агарозном геле.
  5. Удалите продукт ПЦР (~260-270.н.) из геля, экстрагировав ДНК из геля с помощью набора для экстракции геля в соответствии с инструкциями производителя. Стремитесь к содержанию не менее 500 нг ДНК.
  6. Извлеченные образцы хранить при температуре -20 °C.
  7. Выполните секвенирование нового поколения (NGS) с образцами и стремитесь к 100 чтениям на27 гРНК.
  8. Проанализируйте результаты секвенирования с помощью конвейера MAGeCK-VISPR и убедитесь, что более 99,5% гРНК в библиотеке представлены28.

3. Производство библиотеки CRISPR и CAR-экспрессии лентивирусов

  1. Готовят лентивирус так, как описано ранее10,29.
    1. День 1: Начните с колб T175 с 80-90% конфлюентными 293T-клетками, которые росли в среде D10, состоящей из 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (v/v), 1% пенициллин-стрептомицин-глутамина (PSG) (v/v) и модифицированной среды Dulbecco. Перед началом нагрейте реагенты для трансфекции и ДНК до комнатной температуры и количественно оцените ДНК.
    2. Для каждой колбы 293T наклейте этикетку на две конические пробирки объемом 50 мл A и B. Добавьте 4,5 мл восстановленной сывороточной среды в пробирку А и в пробирку В.
    3. В стерильной микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл смешайте следующую ДНК и оставьте на 1 минуту: 18 г pCMVR8.74 (gag, pol, tat и rev), 7 μг pMD2.G (VSV-G) и 15 μг вектора экспрессии лентивируса (векторы библиотеки CRISPR A или CAR19-28ζ).
    4. Добавьте 129 мкл трансфекционного реагента в пробирку А. Хорошо перемешайте пробирку А с помощью пальцевого вортекса.
    5. Добавьте смесь ДНК в пробирку В. Хорошо перемешайте трубку В с помощью пальцевого вортекса.
    6. Добавьте 111 μл нейтрального со-липидного реагента в пробирку В. Хорошо перемешайте трубку В с помощью пальцевого вортекса.
    7. Добавьте содержимое тюбика А в тубу Б и хорошо перемешайте, перемешивая пальцами. Инкубируйте пробирку В в течение 30 минут при комнатной температуре.
    8. К концу 30-минутного инкубационного периода подготовьте клетки 293T путем аспирации существующей среды. Добавьте 16 мл среды R10, состоящей из 10% FBS (v/v), 1% PSG (v/v) и Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640.
    9. По истечении 30-минутного инкубационного периода добавьте содержимое пробирки B (примерно 9 мл) по каплям в колбу с 293T-клетками. Положите колбу вниз и осторожно поверните ее перед инкубацией при 37 °C, 5% CO2.
    10. На 2-й день (примерно через 24 ч после трансфекции) соберите лентивирус следующим образом:
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно охладите все оборудование и материалы и выполните следующие действия на льду, чтобы сохранить вирусную надосадочную жидкость в холоде.
      1. Перенесите надосадочную жидкость из трансфицированных колб 293T в предварительно охлажденные конические пробирки объемом 50 мл.
      2. Добавьте 30 мл предварительно подогретого фильтрующего материала R10 в колбы 293T.
      3. Гранулированный клеточный мусор путем центрифугирования конических пробирок объемом 50 мл при давлении 900 × г в течение 10 мин при 4 °C в закрытых роторах.
      4. После центрифугирования отфильтровать надосадочную жидкость с помощью фильтра 0,45 мкм. Вращайте фильтрат в ультрацентрифуге при давлении 112 700 × г при 4 °C в течение 2 ч.
      5. После 2-часового вращения аспирируйте надосадочную жидкость до тех пор, пока не останется примерно 5 мл. Ресуспендируйте вирусные частицы, аккуратно пипетируя вверх и вниз 10 раз. Храните вирусную суспензию при температуре 4 °C в течение ночи.
    11. На 3-й день собирают и хранят лентивирус следующим образом:
      1. Перенесите надосадочную жидкость из трансфицированных колб 293T в предварительно охлажденные конические пробирки объемом 50 мл.
      2. Добавьте 30 мл 10% отбеливателя в колбы 293T.
      3. Гранулировать клеточный мусор в надосадочной жидкости путем центрифугирования конических пробирок объемом 50 мл при давлении 900 × г в течение 10 мин при 4 °C в закрытых роторах.
      4. После центрифугирования отфильтровать надосадочную жидкость с помощью фильтра 0,45 мкм. Вращайте фильтрат в ультрацентрифуге при давлении 112 700 × г при 4 °C в течение 2 ч.
      5. После 2-часовой центрифуги аспирируйте надосадочную жидкость до тех пор, пока не останется примерно 2 мл, и повторно суспендируйте, осторожно пипетируя вверх и вниз 10 раз. Храните вирусную надосадочную жидкость в аликвотах объемом 300-500 μл и храните при -80 °C.

4. Расчет титра вируса для CAR-экспрессирующего лентивируса

ПРИМЕЧАНИЕ: Лентивирус CAR титрировался так, как описано ранее 10,12.

  1. В 1-й день активируйте и планшетируйте Т-клетки.
    1. Выделите 1 × 106 Т-клеток от здоровых донорских PBMC с помощью набора для отрицательного отбора.
    2. Посчитайте Т-клетки.
    3. Промойте достаточное количество гранул CD3+/CD28+ , чтобы стимулировать Т-клетки в соотношении 3:1. Например, чтобы стимулировать 1 × 106 Т-клеток, промыть 3 × 106 бусин. Для этого вымойте бусины, выполнив следующие 3 раза:
      1. Используйте магнитную сепарацию, чтобы извлечь бусины из суспензии.
      2. Удалите надосадочную жидкость.
      3. Добавьте 1000 мкл Т-клеточной среды (ТКМ), состоящей из 10% сыворотки крови человека (v/v), 1% PSG (v/v) и среды гемопоэтических клеток.
        ПРИМЕЧАНИЕ: ТКМ следует стерилизовать перед использованием путем фильтрации стерильным вакуумным фильтром 0,45 мкм, а затем стерильным вакуумным фильтром 0,22 мкм.
      4. Добавляйте гранулы в суспензию Т-клеток в соотношении 3:1 бусины:клетки.
      5. Ресуспендируйте Т-клетки до 1 × 106 клеток/мл в ТКМ.
      6. Добавьте 100 мкл активированных Т-клеток в 10 лунок 96-луночного планшета. Инкубируйте планшет при 37 °C, 5%CO2.
  2. На 2-й день добавьте разведение CAR лентивируса, создав пластину для разведения следующим образом:
    1. Добавьте 100 мкл ТКМ в семь лунок 96-луночного планшета.
    2. В первую лунку добавьте 50 μL интересующего вируса; Хорошо перемешайте.
    3. Последовательно разбавляйте вирус еще больше, добавляя 50 мкл из лунки 1 в лунку 2; Хорошо перемешайте.
    4. Добавьте 50 μL из лунки 2 в лунку 3 и продолжайте эту схему до лунки 7.
    5. После смешивания лунки 7 удалите 50 μл. Убедитесь, что общий объем всех лунок составляет 100 μл.
    6. Добавьте 50 мкл из каждой лунки разбавляющей пластины в первые семь лунок Т-клеточной пластины с 1-го дня. Хорошо перемешайте.
    7. В последние три лунки Т-клеточного планшета добавьте 50 мкл ТКМ; Хорошо перемешайте. Храните планшет в инкубаторе при температуре 37 °C, 5%CO2.
  3. На 3-й день накормите клетки, добавив 100 мкл ТКМ во все лунки Т-клеточной пластины; Хорошо перемешайте.
  4. На 4-й день проведите проточную цитометрию для определения процента клеток, экспрессирующих CAR, с антителом против каппа-цепи, суррогатным маркером экспрессии CAR, выполнив следующие действия:
    1. Опустите Т-клеточную пластину при 1000 × г в течение 3 минут и сцедите.
    2. Промойте планшет 3 раза буфером антител против каппа-цепи (состоящим из 4% бычьего сывороточного альбумина в PBS (w/v)) путем добавления 200 мкл буфера антител против каппа-цепи, вращая планшет до 1000 × г в течение 3 мин и декантируя.
    3. Добавьте в каждую лунку антитело биотина против каппа-цепи. Выдерживать в течение 45 минут на коромысле при температуре 4 °C.
    4. Промойте пластину 3 раза буфером антител против каппа-цепи, как в шаге 4.4.2.
    5. Окрашивание клеток для проточной цитометрии флуорохром-конъюгированным антителом к стрептавидину и живым/мертвым антителом. Образцы инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте.
    6. Промойте образцы один раз в проточном буфере (состоящем из 2% FBS (v/v) и 1% азида натрия (v/v) в PBS) путем добавления 200 μL проточного буфера, вращения планшета при 1000 × g в течение 3 минут и декантации.
    7. Повторно суспендируйте в 100 мкл проточного буфера и запустите на цитометре.
    8. Выполните отрицательное литникование с тремя нетрансдуцированными лунками.

5. Расчет титра вируса для лентивируса библиотеки CRISPR

Примечание: Этот протокол описывает минимальное количество Т-клеток для титрования лентивируса библиотеки CRISPR, но он может быть масштабирован для размещения большего количества Т-клеток и, следовательно, большего количества вируса.

  1. В день 0 активируйте Т-клетки, добавив 18 × 106 гранул CD3+/CD28+ (соотношение 3:1 гранулы:клетки) к 6 ×10 6 Т-клеткам и доведя окончательный объем до 6 мл с помощью ТКМ. Аликвоту 0,5 мл суспензии Т-клеток в 12 лунок 48-луночного планшета. Хранить в инкубаторе при температуре 37 °C, 5%CO2.
  2. Через двадцать четыре часа, в день 1, добавьте вирус CAR с кратностью инфекции (MOI) 3 в каждую лунку. Хорошо перемешайте, несколько раз перемешав пипеткой вверх и вниз. Хранить в инкубаторе при температуре 37 °C, 5%CO2.
  3. Через сорок восемь часов, на 2-й день, добавьте серию объемов вируса библиотеки CRISPR к активированным клеткам CART, добавив один из следующих объемов вируса CRISPR в каждую лунку (0 μл, 0 μл, 6,25 μл, 6,25 μл, 12,5 μл, 12,5 μл, 25 μл, 25 μл, 50 μл, 50 μл, 100 μл или 100 μл). Хорошо перемешайте, несколько раз перемешав пипеткой вверх и вниз. Хранить в инкубаторе при температуре 37 °C, 5%CO2.
  4. На 3-й день добавьте 1 г пуромицина на мл среды в половину лунок, включая одну лунку, в которую поступил каждый из следующих объемов вируса CRISPR (0 μл, 6,25 μл, 12,5 μл, 25 μл, 50 μл и 100 μл). Остальные лунки не будут обрабатываться пуромицином.
  5. С 4 по 8 день ежедневно подсчитывайте количество Т-клеток и отрегулируйте конечную плотность клеток до 1 ×10 6 клеток/мл с 1 мкг/мл пуромицина в ТКМ для лунок, обработанных пуромицином, и с помощью ТКМ для необработанных лунок.
  6. На 8-й день подсчитайте количество живых клеток в лунке и рассчитайте единицы трансдукции/мл вирусной надосадочной жидкости, используя следующее уравнение:
    figure-protocol-1
    Где A: Количество живых клеток в вирусной реакции хорошо трансдуцируется; B: Количество живых клеток при хорошем контроле без отбора антибиотиков; V: Объем вируса, используемый для заражения в каждой скважине; D: Разбавляющая складка.
  7. Используя лунку TU/mL, рассчитанную из лунки, показывающей эффективность трансдукции приблизительно 20%, рассчитайте объем вируса, необходимый для индукции 1 × 106 клеток при MOI 0,3, используя следующую формулу:
    figure-protocol-2

6. Фаза производства ячейки CART для экрана CRISPR (дни 0 - 8)

Примечание: В приведенном ниже протоколе описывается завершение скрининга CRISPR в одной биологической реплике. Тем не менее, этот протокол ранее был валидирован с использованием трех биологических репликатов, и мы рекомендуем использовать по меньшей мере три биологические репликации для других лиц, выполняющих этот протокол30.

  1. День 0: Выделите и стимулируйте Т-клетки из здоровой донорской крови, как описано ранее10.
    1. Выделите мононуклеарные клетки периферической крови (ПМЦ) из деидентифицированной здоровой донорской крови.
      1. Добавьте 15 мл среды с градиентом плотности в разделительную пробирку с градиентом плотности.
      2. Добавьте разбавленную кровь 1:2 в верхнюю часть пробирки для разделения градиента плотности. Центрифуга при 1 200 × г в течение 10 мин при комнатной температуре.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Кровь следует разбавлять изоляционным буфером (2% FBS (v/v) в фосфатно-солевом буфере [PBS]).
      3. Удалите верхний слой в новую коническую пробирку объемом 50 мл и увеличьте объем вдвое с помощью изоляционного буфера. Центрифугируйте образец при 300 × г в течение 8 мин при 4 °C. Аспирируйте надосадочную жидкость.
      4. Повторно суспендируйте клеточную гранулу с изоляционным буфером и подсчитайте PBMC.
    2. Выделите Т-клетки из PBMC с помощью набора для отрицательного отбора. Следуйте инструкциям производителя к комплекту.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предположим, что восстановление Т-клеток из PBMC составляет 10-20%.
    3. Стимулируйте Т-клетки с помощью гранул CD3+/CD28+ .
      1. Посчитайте Т-клетки.
      2. Аликвота достаточна гранул CD3+/CD28+ для стимуляции Т-клеток в соотношении 3:1 гранулы:клетки. Например, для стимуляции 110 ×10 6 Т-клеток, аликвоты 330 × 106 шариков. Промойте шарики 3 раза, сначала отделив шарики от суспензии с помощью магнитной сепарации, а затем добавив 1 000 μл ТКМ.
      3. Добавьте шарики в Т-клеточную суспензию. Ресуспендируйте Т-клетки до 1 ×10 6 клеток/мл в ТКМ.
      4. Поместите Т-клетки в 6-луночные планшеты для достижения наилучшей эффективности трансдукции. Добавьте в каждую лунку 5 × 106 Т-клеток. Инкубируйте клетки при 37 °C, 5%CO2 в течение 24 ч.
  2. День 1: В условиях BSL-2+ разморозьте лентивирус CAR в количестве, достаточном для трансдукции Т-клеток при кратности инфекции 3,0. Осторожно разбейте розетки Т-клеток перед добавлением соответствующего количества объединенного лентивируса для трансдукции 5 × 106 Т-клеток при MOI 3,0. Инкубируйте клетки при 37 °C, 5%CO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объедините лентивирус из нескольких продуктов в одну пробирку перед трансдуцированием Т-клеток. Это гарантирует, что все Т-клетки получают одинаковое лечение. Кроме того, лентивирус следует размораживать только один раз.
  3. День 2: В условиях BSL-2+ разморозьте лентивирус CRISPR в количестве, достаточном для трансдукции Т-клеток с MOI 0,3. Осторожно разбейте розетки Т-клеток и ресуспендируйте Т-клетки перед добавлением соответствующего количества объединенного лентивируса для трансдукции 5 × 106 Т-клеток при MOI 0,3. Инкубируйте клетки при 37 °C, 5%CO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объедините лентивирус из нескольких продуктов в одну пробирку перед трансдуцированием Т-клеток. Это гарантирует, что все Т-клетки получают одинаковое лечение.
  4. Дни 3 - 5: Повторная суспензия клеток CART для разбиения розеток и подсчета клеток. Доведите конечную концентрацию клеток до 1 ×10 6 клеток/мл в ТКМ с 1 мкг/мл пуромицина. Инкубируйте клетки при 37 °C, 5%CO2.
  5. День 6: Ресуспендирование клеток CART для разрушения розеток, удаление гранул CD3+/CD28+ с помощью магнитной сепарации и подсчет клеток CART. Добавьте ТКМ с 1 мкг/мл пуромицина, чтобы довести конечную концентрацию клеток до 1 × 106 клеток/мл и инкубируйте клетки при 37 °C, 5% CO2. Определите экспрессию CAR с помощью проточной цитометрии, как описано в шаге 4.4.

7. Фаза отбора гРНК с помощью скрининга CRISPR (дни 8 - 22)

  1. День 8: Сохраните образцы для секвенирования следующего поколения (NGS) и начните совместное культивирование.
    1. Промойте ячейки CART 3 раза в ТКМ, центрифугируя образцы при 300 × г в течение 5 мин при 4 °C, отсасывая надосадочную жидкость и повторно суспендируя образцы в 20 мл ТКМ.
    2. Подсчитайте ячейки CART.
    3. Чтобы сохранить образцы для секвенирования нового поколения, выполните следующие действия:
      1. Аликвотировать достаточное количество CART-клеток в конической трубке объемом 50 мл для поддержания представления гРНК на уровне 500 клеток на гРНК (например, аликвотировать примерно 33 × 106 CART-клеток при использовании библиотеки CRISPR с 65 383 гРНК). Центрифугируйте образец при 300 × г в течение 5 мин при 4 °C.
      2. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл PBS и переложите в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл. Промойте коническую пробирку объемом 50 мл 1 мл PBS и переложите промывку в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл.
      3. Центрифугируйте образцы при 500 × г в течение 5 минут при 4 °C. Удалите надосадочную жидкость. Храните гранулы клеток при температуре -20 °C.
      4. Начните совместное культивирование с добавления клеток CART к клеткам CD19+ JeKo-1 в соотношении 1:1. Например, сложите 80 × 10 ячеек6 CART с 80 × 10ячейками 6 JeKo-1. Доведите общий объем кокультуры до 160 мл с помощью ТКМ. Храните образцы в инкубаторе при температуре 37 °C, 5%CO2.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем начать как минимум с 80 × 106 ячеек CART, чтобы сохранить представление библиотеки и иметь достаточное количество ячеек для сохранения образцов на 15-й и 22-й дни.
  2. День 10: Для рестимуляции клеток CART соберите сокультуры в конические пробирки объемом 50 мл и центрифугируйте образцы при давлении 300 × г в течение 5 минут при 4 °C. Повторно суспендируйте каждый образец в 80 мл ТКМ и добавьте 80 × 106 клеток JeKo-1 в 80 мл ТКМ. Храните образцы в инкубаторе при температуре 37 °C, 5%CO2.
  3. Дни 12 и 14: Рестимулируйте клетки CART, как показано на шаге 7.2.
  4. День 15: Законсервируйте образцы для NGS и рестимулируйте клетки CART.
    1. Выделите CART-клетки из ко-культуры, сначала подсчитав клетки, а затем комбинируя набор для положительного отбора CD4+ Т-клеток с набором для положительного отбора для CD8+ Т-клеток, чтобы выделить Т-клетки из сокультур CART-JeKo-1. Посчитайте Т-клетки.
    2. Сохранить образцы для NGS путем выделения 33 × 106 CART-клеток в конической пробирке объемом 50 мл и центрифугирования образца при 300 × г в течение 5 мин при 4 °C. Повторно суспендируйте образец в 1 мл PBS и переложите его в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл. Промойте коническую пробирку объемом 50 мл 1 мл PBS и переложите промывку в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл. Центрифугировать образцы при 500 × г в течение 5 мин при 4 °C; удалить надосадочную жидкость; и хранить гранулы клеток при температуре -20 °C.
    3. Настройка кокультур для продолжения модели in vitro для истощения путем добавления 80 × 106 CART клеток к 80 ×10 6 JeKo-1 клеток. Затем доведите общий объем сокультуры до 160 мл с помощью ТКМ. Храните образцы в инкубаторе при температуре 37 °C, 5%CO2.
  5. Дни 17, 19 и 21: Рестимулируйте клетки CART, как показано на шаге 7.2.
  6. День 22: Законсервируйте образцы для NGS.
    1. Выделите CART-клетки из ко-культуры, сначала подсчитав клетки. Затем объедините набор для положительного отбора CD4+ Т-клеток с набором для положительного отбора для CD8+ Т-клеток, чтобы выделить Т-клетки из сокультур CART-JeKo-1. Посчитайте Т-клетки.
    2. Чтобы сохранить образцы для секвенирования нового поколения, повторите шаг 7.4.2.

8. Подготовка геномной ДНК для секвенирования нового поколения

Примечание: Для поддержания адекватного охвата геномная ДНК (гДНК) должна быть выделена по меньшей мере из 33 × 106 клеток CART. Кроме того, вся гДНК из 33 × 106 CART-клеток должна быть подготовлена к секвенированию.

  1. Выделите гДНК из замороженных клеточных гранул с помощью набора для выделения гДНК.
  2. Очистите гДНК с помощью осаждения этанола.
    1. Предварительно охладите 100% EtOH до -20 °C.
    2. Aliquot равномерно элюировал ДНК в несколько микроцентрифужных пробирок (200-250 мкл). Добавьте к каждой аликвоте следующее: два объема 100% EtOH (500 μL для 250 μL aliquot или 400 μL для 200 μL); 0,1 объема 3 М ацетата натрия (25 мкл для 250 мкл аликвоты или 20 мкл для 200 мкл); и 1 мкл 20 мг/мл гликогена. Инкубируйте образцы в течение ночи при температуре -20 °C.
    3. На второй день вращайте образцы при давлении 13 000 × г в течение 20 минут, чтобы гранулировать осажденную ДНК. Удалите надосадочную жидкость. Промойте гранулы 1 мл 70% EtOH путем отжима при 7 500 × г в течение 10 минут.
    4. Полностью удалите остаточный EtOH. Дайте гранулам высохнуть в течение 30-45 минут.
    5. Повторно суспендируйте гранулы в 50 μл стерильной воды.
  3. Подготовьте гДНК для NGS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Праймеры NGS для этой библиотеки CRISPR, которые амплифицируют гРНК с помощью последовательностей адаптера Illumina, были разработаны в предыдущей публикации27. Использование разного обратного праймера для каждого образца позволит штрих-кодировать каждый образец и обеспечить объединение образцов во время секвенирования.
    1. Подготовить образцы для ПЦР с помощью следующей реакционной смеси (общий объем = 50 μл): мастер-смесь для ПЦР высокой точности, 2x: 25 μL; объединенная матричная ДНК, 0,5 мкг: 1 мкл; Прямой праймер библиотеки NGS, 10 мкМ: 1,25 мкл; обратный праймер библиотеки NGS, 10 мкМ: 1,25 мкл; Вода без ДНКазы: 21,5 мкл.
    2. Проводят ПЦР со следующими условиями цикла: цикл 1: денатурация при 98 °С в течение 3 мин; циклы 2-23: денатурация при 98°С в течение 10 с, отжиг при 63°С в течение 10 с, выдержка при 72°С в течение 25 с; цикл 24: продлить при температуре 72 °C в течение 2 минут.
    3. Объедините реакции ПЦР для каждого образца и очистите продукт ПЦР с помощью набора для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями производителя.
    4. Внесите 3 мкг продукта ПЦР для каждого образца на 2% (по мас./об.) агарозном геле.
    5. Удалите продукт ПЦР (~260-270.н.) из геля, экстрагировав ДНК из геля с помощью набора для экстракции геля в соответствии с инструкциями производителя. Извлеченные образцы хранить при температуре -20 °C.
    6. Выполните секвенирование нового поколения (NGS) с образцами. Стремитесь к более чем 500 чтениям на каждую гРНК в библиотеке.

9. Анализ результатов секвенирования

  1. Для анализа NGS используется платформа MAGeCK-VISPR28. Используйте стандартные настройки для алгоритма оценки максимального правдоподобия (MAGeCK-MLE). Чтобы подготовить выходные файлы к анализу:
    1. Запустите FASTQC для оценки качества файла последовательности31.
    2. Объедините файлы парной секвенции для каждого образца с помощью bbmerge32.
    3. Анализируйте образцы в платформе MAGeCK-VISPR с помощью алгоритма MAGeCK-MLE. Для анализа MAGeCK-MLE нормализуйте количество всех гРНК до списка из 1000 нецелевых гРНК.
    4. Оценивайте качество файла секвенирования, оценивая содержимое сборщика мусора, базовое качество, последовательность операций чтения и сопоставленных операций чтения.
    5. Оценка успешности фазы селективного давления скрининга CRISPR путем оценки изменений в индексе Джини, кластеризации анализа главных компонент (PCA) и путей, связанных со списком отрицательно отобранных генов32.
    6. Исследуйте топовые хиты, проводя поиск литературы и выполняя анализ путей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы исследовать гены и пути, которые могут быть отредактированы для улучшения активности клеток CART непредвзятым образом, мы разработали полногеномный скрининг CRISPR in vitro (рис. 1). Этот экран имеет две фазы: фазу производства ячейки CART и фазу селективного давления. На этапе производства CART-клеток не менее 110 × 106 Т-клеток сначала выделяют из здоровых донорских PBMC и активируют с помощью гранул CD3+/CD28+. На следующий день, в 1...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Редактирование генов стало мощным инструментом как в понимании механизмов устойчивости к терапии, так и в разработке новых методов клеточной терапии CART для увеличения продолжительности жизни и активности клеток CART 16,17,26. В то время как некоторые стратегии редактирования генов показали улучшение активности клеток CART как в доклинических моделях, так и в клинических испытаниях, еще предсто...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SSK является изобретателем патентов в области иммунотерапии CAR, лицензированных компаниями Novartis (по соглашению между клиникой Майо, Университетом Пенсильвании и Novartis), Humanigen (через клинику Майо), Mettaforge (через клинику Майо) и MustangBio (через клинику Майо), а также Chymal therapeutics (через клинику Майо). CS, CMR и SSK являются изобретателями по патентам, лицензированным Immix Biopharma. SSK получает финансирование на исследования от Kite, Gilead, Juno, BMS, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis/Viracta, LifEngine Animal Health Laboratories Inc. и Lentigen. SSK принимала участие в консультативных совещаниях с компаниями Kite/Gilead, Calibr, Luminary Therapeutics, Humanigen, Juno/BMS, Capstan Bio и Novartis. SSK входила в состав совета по безопасности и мониторингу данных в компаниях Humanigen и Carisma. SSK расторгла контракты с консультантами по Torque, Calibr, Novartis, Capstan Bio, BMS, Carisma и Humanigen. CMS и SSK являются изобретателями интеллектуальной собственности, полученной в результате использования этого протокола.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было частично профинансировано Центром индивидуализированной медицины клиники Майо (SSK), Комплексным онкологическим центром клиники Майо (SSK), Клиническим центром регенеративной биотерапии Майо (SSK), Национальными институтами здравоохранения K12CA090628 (SSK) и R37CA266344-01 (SSK), Грантом CA201127 Министерства обороны (SSK), Фондом Преддолина (SSK) и Миннесотским партнерством по биотехнологии и медицинской геномике (SSK). CMS поддерживается Высшей школой биомедицинских наук клиники Майо. Схема экрана CRISPR (рис. 1) была создана с помощью BioRender.com (Siegler, L. (2022) https://BioRender.com/k71r054).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
293T клеткиATCCCRL-3216Клетки, используемые для производства лентивируса
Biotin ProteinL АнтителоGenScriptM00097антикаппа цепное антитело для обнаружения CAR
Бычий сывороточный альбуминMillipore SigmaA7906
Карбенициллин динатриевая сольMillipore SigmaC1389-1GКарбенициллин антибиотик
CD4 Выделение БусиныMiltenyi Biotec130-045-101 
CD8 Изолирующие бусиныMiltenyi Biotec130-045-201
CTS (Системы клеточной терапии) Dynabeads CD3/CD28Gibco40203D
CytoflexBeckman CoulterNC2279958
ДНКазная водаInvitrogenAM9937
модифицированная орлиная среда Дульбекко (DMEM)Corning10-017-CV
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt BufferedGibco14190-144
EasySep Набор для изоляции Т-клеток человекаSTEMCELL Technologies17951RFНабор для отрицательной изоляции
Endura Electrocompetent Cells Biosearch Technologies60242-1Электрокомпетентные клетки с восстанавливающей средой
ЭтанолMillipore SigmaE7023
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Corning35-010-CV
GeCKO v2 CRISPR Knockout Pooled Library AAddGene1000000048CRISPR Библиотека плазмид
Ген Pulser II Bio-RAD165-2105Электропоратор
гликогенаМиллипор Сигма10901393001
JeKo-1ATCCCRL-3006CD19+ клеток-мишеней 
Lipofectamine 3000 Transfection ReagentThermoFisher ScientificL3000075Набор реагентов для трансфекции с реагентом для трансфекции (Lipofectamine 3000 Reagent) и нейтральным со-липидным реагентом (p3000)
LIVE/DEAD AquaInvitrogenL34966
LymphoprepSTEMCELL Technologies7851Градиентная среда
плотности Machery-Nagel NucleoBond Xtra Maxi KitsThermoFisher Scientific12748412Maxi-prep kit
NEBNext High-Fidelity 2X PCR MasterMixNew England BioLabsM0541SHigh Fidelity PCR mastermix
Opti-MEM I Сниженная сыворотка средаGibco31985-070Восстановленная сыворотка
среда pCMVR8.74AddGene22036Лентивирусная упаковка плазмида
Пеннициллин-стрептомицин-глутамин (100X)Life Technologies10378-016
pMD2.GAddGene12259VSV-G оболочка, экспрессирующая плазмиду
Pooled Human AB Serum Инновационные исследованияISERABHI
PuromycinMillipore SigmaP8833
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704Gek Extraction
Kit Qucik-DNA Midiprep Plus KitZymo ResearchD4075Kit used for isolata gDNA
RoboSep-SSTEMCELL Technologies21000Автоматизированный сепаратор клеток
Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI)Gibco21870092
SepMate-50STEMCELL Technologies85450Градиентная разделительная трубка
Ацетат натрияInvitrogenAM9740
Азид натрияFisher Scientific71448-16
Антитело к стрептавидину (PE)BioLegend405203Вторичное антитело используется для обнаружения CAR
Термоамплификатор T100Bio-Rad1861096
ультрацентрифуга (Optima XPN-80)BeckmanCoulterA99839
Вакуумные фильтрующие системы, 0,22 &; mThermoFisher Scientific567-0020
Вакуумные фильтрующие системы, 0.45 & микро; mThermoFisher Scientific165-0045
X-VIVO 15 Бессывороточная гемопоэтическая клеточная средаLonza04-418QГемопоэтическая клеточная среда

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neelapu, S. S., et al. 5-year follow-up supports curative potential of axicabtagene ciloleucel in refractory large B-cell lymphoma (zuma-1). Blood. 141 (19), 2307-2315 (2023).
  2. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. N Engl J Med. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  3. Locke, F. L., et al. Long-term safety and activity of axicabtagene ciloleucel in refractory large B-cell lymphoma (zuma-1): A single-arm, multicentre, phase 1-2 trial. Lancet Oncol. 20 (1), 31-42 (2019).
  4. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. N Engl J Med. 378 (5), 439-448 (2018).
  5. Schuster, S. J., et al. Tisagenlecleucel in adult relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma. N Engl J Med. 380 (1), 45-56 (2018).
  6. Bai, Z., et al. Single-cell antigen-specific landscape of CAR T infusion product identifies determinants of CD19-positive relapse in patients with all. Sci Adv. 8 (23), eabj2820(2022).
  7. Fraietta, J. A., et al. Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia. Nat Med. 24, 563-571 (2018).
  8. Gennert, D. G., et al. Dynamic chromatin regulatory landscape of human CAR T cell exhaustion. Proc Natl Acad Sci USA. 118 (30), e2104758118(2021).
  9. Deng, Q., et al. Characteristics of anti-CD19 CAR T cell infusion products associated with efficacy and toxicity in patients with large B cell lymphomas. Nat Med. 26 (12), 1878-1887 (2020).
  10. Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. Using CRISPR/CAS9 to knock out GM-CSF in CAR-T cells. J Vis Exp. (149), e59629(2019).
  11. Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. 133 (7), 697-709 (2019).
  12. Cox, M. J., et al. GM-CSF disruption in CART cells modulates T cell activation and enhances CART cell anti-tumor activity. Leukemia. 36 (6), 1635-1645 (2022).
  13. Ottaviano, G., et al. Phase 1 clinical trial of CRISPR-engineered CAR19 universal T cells for treatment of children with refractory B cell leukemia. Sci Transl Med. 14 (668), eabq3010(2022).
  14. Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-CAS9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12, 828-863 (2017).
  15. Mccutcheon, S. R., et al. Transcriptional and epigenetic regulators of human CD8+ T cell function identified through orthogonal CRISPR screens. Nat Genet. 55, 2211-2223 (2023).
  16. Zhu, W., Kelly, C., Dagur, P., Dunbar, C. E., Cordes, S. CRISPR activation screen to optimize chimeric antigen receptor (CAR) T cell immunophenotype. Blood. 142 (Supplement 1), 4820-4820 (2023).
  17. Wang, D., et al. CRISPR screening of CAR T cells and cancer stem cells reveals critical dependencies for cell-based therapies. Cancer Discov. 11 (5), 1192-1211 (2021).
  18. Shifrut, E., et al. Genome-wide CRISPR screens in primary human T cells reveal key regulators of immune function. Cell. 175 (7), 1958-1971.e15 (2018).
  19. Belk, J. A., et al. Genome-wide crispr screens of T cell exhaustion identify chromatin remodeling factors that limit T cell persistence. Cancer Cell. 40 (7), 768-786.e7 (2022).
  20. Jiang, P., et al. Single-cell ATAC-seq maps the comprehensive and dynamic chromatin accessibility landscape of CAR-T cell dysfunction. Leukemia. 36 (11), 2656-2668 (2022).
  21. Rossi, J., et al. Preinfusion polyfunctional anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells are associated with clinical outcomes in NHL. Blood. 132 (8), 804-814 (2018).
  22. Beider, K., et al. Molecular and functional signatures associated with CAR T cell exhaustion and impaired clinical response in patients with B cell malignancies. Cells. 11 (7), 1140(2022).
  23. Wherry, E. J. T. cell exhaustion. Nat Immunol. 12, 492-499 (2011).
  24. Prinzing, B., et al. Deleting DNMT3A in CAR T cells prevents exhaustion and enhances antitumor activity. Sci Transl Med. 13, eabh0272(2021).
  25. Lynn, R. C., et al. C-jun overexpression in CAR T cells induces exhaustion resistance. Nature. 576, 293-300 (2019).
  26. Tang, N., et al. TGF-beta inhibition via CRISPR promotes the long-term efficacy of CAR T cells against solid tumors. JCI Insight. 5 (4), e133977(2020).
  27. Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-CAS9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).
  28. Li, W., et al. Quality control, modeling, and visualization of CRISPR screens with MAGeCK-VISPR. Genome Biol. 16, 281(2015).
  29. Sakemura, R., et al. Targeting cancer-associated fibroblasts in the bone marrow prevents resistance to CART-cell therapy in multiple myeloma. Blood. 139 (26), 3708-3721 (2022).
  30. Stewart, C. M., et al. IL-4 drives exhaustion of CD8+ CART cells. Nat Commun. 15 (1), 7921(2024).
  31. FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data. , Babraham Bioinformatics. https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010).
  32. Bbmerge. , https://github.com/BioInfoTools/BBMap/blob/master/sh/bbmerge.sh (2019).
  33. Pattanayak, V., et al. High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed CAS9 nuclease specificity. Nat Biotechnol. 31 (9), 839-843 (2013).
  34. Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-CAS9-mediated gene inactivation. Nat Biotechnol. 32 (12), 1262-1267 (2014).
  35. Dong, M. B., et al. Systematic immunotherapy target discovery using genome-scale in vivo CRISPR screens in CD8 T cells. Cell. 178 (5), 1189-1204.e23 (2019).
  36. Zhou, P., et al. Single-cell CRISPR screens in vivo map T cell fate regulomes in cancer. Nature. 624 (7990), 154-163 (2023).
  37. Sutra Del Galy, A., et al. In vivo genome-wide CRISPR screens identify SOCS1 as intrinsic checkpoint of CD4+ TH1 cell response. Sci Immunol. 6 (66), eabe8219(2021).
  38. Ramos, A., et al. Leukemia-intrinsic determinants of CAR-T response revealed by iterative in vivo genome-wide CRISPR screening. Nat Commun. 14 (1), 8048(2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CAR TCD19

Похожие статьи