Методическая статья

Создание ортотопических моделей ксенотрансплантатов, полученных от пациента, для опухолей головного мозга с использованием стереотаксического устройства

1.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67349

⸱

2 мая 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Children's Cancer Institute Australia, Lowy Cancer Research Centre, UNSW Sydney, 2School of Clinical Medicine, Faculty of Medicine & Health, UNSW Sydney, 3Kid's Cancer Centre, Sydney Children's Hospital

В этой статье

Краткое содержание

Разработка ортотопических моделей опухолей головного мозга у детей требует тщательной точности с использованием стереотаксического устройства для точной имплантации раковых клеток. Представленная здесь методология описывает шаги, связанные с препарированием опухолевых клеток головного мозга, выполнением внутричерепных инъекций и внедрением системы послеоперационного мониторинга для оценки приживления опухоли головного мозга.

Аннотация

Разработка клинически значимых и надежных моделей опухолей центральной нервной системы (ЦНС) сыграла ключевую роль в развитии нейроонкологии. Одним из наиболее широко используемых методов является ортотопическая внутричерепная инъекция, метод, который позволяет исследовать рост, инвазию и распространение опухоли в контролируемых условиях. Этот метод включает в себя трансплантацию опухолевых клеток из определенной области пациента в соответствующий анатомический участок у животного. Таким образом, эти ортотопические модели опухолей головного мозга имеют уникальное преимущество, поскольку они более точно воспроизводят биологическое поведение рака и его взаимодействие с окружающей средой мозга, наблюдаемое у людей. Это делает их особенно ценными для доклинических терапевтических испытаний, где близкое сходство с клиническим сценарием имеет важное значение для оценки потенциальных методов лечения. В рамках этого протокола используется опыт разработки моделей ксенотрансплантата (PDX) для опухолей головного мозга у детей, включая диффузную срединную глиому (DMG), глиобластому (GBM), медуллобластому и эпендимому. Этот метод очерчивает процедуру проведения внутричерепных стереотаксических инъекций у мышей, обеспечивая правильное нацеливание на место инъекции в пределах мозга. Кроме того, мы описываем систему постпроцедурного мониторинга, используемую для выявления признаков успешного приживления опухоли. После инъекции опухоли внедряется строгая система мониторинга для наблюдения за животными на предмет любых признаков неврологических нарушений, поведенческих изменений и/или потери веса, которые являются общими индикаторами прогрессирования опухоли. Эта система позволяет своевременно вмешаться и предоставляет критически важные данные о динамике роста опухоли. Совершенствуя эти модели и протоколы, мы стремимся повысить надежность и трансляционный потенциал доклинических исследований, способствуя разработке более эффективных методов лечения опухолей ЦНС у детей.

Введение

Опухоли центральной нервной системы (ЦНС) у детей являются наиболее распространенными солидными опухолями у детей, составляя около 20-25% первичных опухолей у детей, с характеристиками, отличными от опухолей взрослых с точки зрения частоты и ответа на лечение 1,2. Глиомы высокой степени злокачественности (ГГГ), такие как глиобластома (ГБМ) и диффузная внутренняя понтинная глиома/диффузная глиома средней линии (DIPG/DMG), являются особенно агрессивными, с мрачными прогнозами, и, несмотря на достижения в методах лечения, показатели выживаемости остаются низкими 3,4,5. Медуллобластомы, составляющие почти 20% опухолей ЦНС у детей, достигли высокой 5-летней выживаемости при стандартной терапии, однако некоторые подтипы создают проблемы, особенно при сценариях рецидива 6,7. Эпендимомы, составляющие около 10% опухолей ЦНС у детей, демонстрируют различные прогнозы в зависимости от молекулярных характеристик и локализации опухоли, при этом рецидив создает значительные клинические проблемы 8,9. Понимание молекулярного ландшафта и разработка моделей ортотопических опухолей головного мозга (БТ) открывают перспективы для разработки эффективных методов лечения для улучшения результатов лечения педиатрических пациентов.

Разработка клинически значимых моделей БТ имеет жизненно важное значение для продвижения нейроонкологических исследований и терапевтических открытий. Ортотопические инъекции с использованием стереотаксического устройства имеют решающее значение в этом подходе, поскольку они позволяют точно разместить опухолевые клетки в мозге, точно имитируя естественную среду опухолей головногомозга. Этот метод повышает надежность и воспроизводимость моделей опухолей, способствуя более точным исследованиям биологии опухоли и ключевых характеристик, таких как инвазия и ангиогенез, а также оценке терапевтическихвмешательств. Способность стереотаксического устройства контролировать точное расположение и глубину инъекций клеток гарантирует, что опухолевые клетки последовательно размещаются в предполагаемых областях мозга, тем самым улучшая достоверность экспериментальных результатов. Подкожные модели представляют собой более доступный и экономически эффективный вариант первичного скрининга терапевтических средств. В этих моделях опухолевые клетки имплантируются под кожу, что позволяет осуществлять прямой мониторинг роста опухоли и реакции на лечение. Несмотря на то, что им не хватает способности воспроизводить сложное микроокружение мозга, подкожные модели остаются очень ценными для высокопроизводительного скрининга лекарств и предварительной оценки эффективности12,13.

Многочисленные исследования продемонстрировали успешную разработку ортотопических моделей ксенотрансплантатов (PDX) пациента из образцов опухолей головного мозга, включая прямую имплантацию тканей из образцов аутопсии или биопсии и первичных культур опухолей головного мозга 11,14,15. Тем не менее, важно признать, что внутричерепная инъекция диссоциированной опухолью ткани или опухолевых клеток не всегда гарантирует приживление, а причины неудачи доконца не изучены. Интересно, что образцы биопсии HGG, как правило, демонстрируют более высокий уровень успеха по сравнению с другими подтипами опухолей головного мозга. Например, He et al. продемонстрировали 56% успеха для ортотопических моделей HGG, в то время как исследование Brabetz et al. сообщило о более низких показателях приживления, таких как 43% и 30% соответственно, для других образцов опухолей головного мозга у детей, таких как эпендимома и медуллобластома 11,14,16. Примечательно, что модели PDX опухоли головного мозга демонстрируют широкий диапазон латентных периодов, варьирующихся от 1 до 11 месяцев, при этом более поздние приживления демонстрируют меньшую доклиническую полезность. Несмотря на их способность повторять болезнь на молекулярном уровне, наблюдаются некоторые геномные расхождения между биопсией и установленными моделями14,16.

Модели PDX служат незаменимыми инструментами в поиске новых терапевтических стратегий против педиатрических БТ. Они считаются золотым стандартом для проведения исследований эффективности лекарств, поскольку модели точно повторяют болезнь человека с точки зрения роста опухоли, симптомов и фармакокинетики лекарств из-за наличия гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). Исследования в области глиомы ствола головного мозга у детей показали, что сохраняемая целостность ГЭБ и отсутствие проникновения лекарственного препарата являются особенностью, которая приводит к снижению терапевтической эффективности при этих опухолях 17,18,19. Тем не менее, эффективность может наблюдаться при выборе методов лечения, которые демонстрируют адекватное проникновение лекарственных средств, таких как эпигенетические и метаболические ингибиторы17,20.

В данном исследовании представлен метод выполнения внутричерепных инъекций опухолевых клеток головного мозга у животных с ослабленным иммунитетом, направленный на оценку развития приживления PDX и/или оценку эффективности терапевтических препаратов. Также предоставляются комплексные инструменты для мониторинга прогрессирования опухоли до тех пор, пока не будет достигнута этическая экспериментальная конечная точка.

Протокол

Протокол, изложенный ниже, соответствует этическим принципам ухода за животными и их использования, изложенным Университетом Нового Южного Уэльса, и все процедуры были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию. Благополучие животных было приоритетом, и были предприняты все усилия, чтобы свести к минимуму страдания животных, используемых во время процедуры внутричерепной инъекции.

1. Культивирование для расширения нейросферообразующих культур опухолей головного мозга

ПРИМЕЧАНИЕ: Конкретные требования могут варьироваться в зависимости от используемых культур мозга. Следующие шаги описывают общий протокол культивирования клеток первичной опухоли головного мозга в виде нейросфер. Культуры опухолей головного мозга могут быть получены от коммерческих поставщиков или установлены в качестве первичных культур из биопсии или аутопсии опухоли головного мозга пациента. Процедура получения первичных культур из образцов биопсии или аутопсии пациента описана в опубликованной литературе15,21.

  1. Поместите криоконсервированный флакон на водяную баню при температуре 37 °C до тех пор, пока содержимое не оттает. Протрите внешние поверхности флакона 70% этанолом для обеспечения стерильности.
  2. Подготовьте нейросферную среду для первичных опухолевых клеток головного мозга, как описано в Mayoh et al.21. В шкафу биологической безопасности (BSC) используйте стерильную пипетку объемом 1 мл для переноса размороженных клеток в стерильную коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 5 мл предварительно подогретых нейросферных сред.
  3. Центрифугируйте коническую трубку при давлении 300 x g в течение 3 минут, чтобы гранулировать ячейки. Осторожно выбросьте как можно больше надосадочной жидкости с помощью пипетки объемом 10 мл.
  4. Ресуспендируйте клеточную таблетку в 10 мл или 25 мл нейросферной среды. Поместите клеточную суспензию в колбу Т25 или Т75, в зависимости от ожидаемого количества клеток из криоконсервации. Как правило, исходные ячейки плотностью 5х 105 ячеек помещают в колбу Т25.
  5. Поместите колбу в инкубатор, установленный при температуре 37 °C и 5%CO2. Обменивайте носители на свежие 1 или 2 раза в неделю. В качестве альтернативы можно докармливать факторы роста и B27 по мере необходимости, в зависимости от скорости роста клеток.
  6. После того, как нейросферы сформировались в колбе Т25, они могут быть расширены в колбах Т75. Переложите содержимое колбы T25 с помощью пипетки объемом 10 мл в коническую пробирку объемом 15 мл. Наблюдайте за нейросферами под световым микроскопом, и как только они вырастут достаточно большими (примерно 500 мкм), их также можно будет увидеть невооруженным глазом.
  7. Центрифугируйте пробирку при 300 х г в течение 3-5 минут. Аспирируйте среду над клеточной гранулой, оставляя в пробирке примерно 1 мл.
  8. Аккуратно пипетируйте клетки вверх и вниз в 12-15 раз пипеткой объемом 1 мл, чтобы диссоциировать клеточную гранулу. Используйте клеточный фильтр (40 мкм) для диссоциации нейросфер в одноклеточную смесь.
  9. Поместите ситечко на верхнюю часть конической трубки объемом 50 мл и добавьте диссоциированные сфероиды с помощью пипетки объемом 10 мл на ситечко. Большинство одиночных ячеек пропускают сетку в трубку, а комковатые материалы остаются на сетке.
  10. Подсчет ячеек с камерой подсчета ячеек. Оцените жизнеспособность клеток, смешав равное количество клеточной суспензии (например, 5 мкл) с трипановым синим (5 мкл). Мертвые клетки будут казаться синими под световым микроскопом, в то время как живые клетки останутся неокрашенными.
  11. Рассчитайте плотность ячеек следующим образом:
    Концентрация клеток = Среднее количество клеток на сетке × Коэффициент разбавления / Объем одной сетки (мл). Объем сетки от стандартной камеры подсчета клеток составляет 0,0001 мл.
  12. Для прохождения клеток ресуспендировать 1 х 106 клеток в 25 мл свежей, подогретой среды в колбе Т75. После того, как клетки помещены в колбу T75, инкубируйте их при температуре 37 °C в увлажнённом инкубаторе с 5% содержаниемCO2 до тех пор, пока нейросферы не вырастут.
  13. Чтобы криоконсервировать клетки опухоли головного мозга, ресуспендируйте 1 x 106 клеток в 1 мл раствора для криоконсервации и поместите на ночь в контейнер для заморозки с контролируемой скоростью и храните при температуре -80 °C. Поместите криоконсервированные запасы в резервуар с жидким азотом при температуре -180 °C для длительного хранения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Среда для криоконсервации состоит на 90% из сыворотки плода теленка и на 10% из диметилсульфоксида (ДМСО).

2. Подготовка опухолевых клеток головного мозга к внутричерепному введению

ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как следующий протокол описывает подготовку культивируемых клеток из установленных или краткосрочных культур для внутричерепного введения, он также может быть адаптирован для других типов клеток, включая свежедиссоциированную ткань из опухолей головного мозга человека22,23.

  1. В шкафу биобезопасности осторожно переложите клетки и питательную среду из колбы для тканевых культур с помощью серологической пипетки в коническую пробирку объемом 50 мл.
  2. Центрифугируйте коническую пробирку при давлении 300 x g в течение 5 минут при комнатной температуре. Отсасывайте с помощью пипетки объемом 25 мл среду над гранулой, оставляя в пробирке примерно 0,5 мл.
  3. Аккуратно пипетируйте клетки вверх и вниз 10 раз с помощью пипетки объемом 1 мл, чтобы диссоциировать клеточную гранулу. Подсчитайте клетки с помощью трипанового синего и гемоцитометра.
  4. После того, как желаемое количество клеток будет аликвотировано в свежую пробирку, промойте 2 раза PBS, повторно суспендируя клетки и гранулируя их при 300 x g в течение 5 минут при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: количество ячеек может быть определено так, как описано. Например, если необходимо ввести 10 животных при плотности клеток 200 000 клеток, то минимальное необходимое количество клеток составляет 2 x 106.
  5. Во время окончательной стирки удалите как можно больше PBS. Аккуратно положите клеточную гранулу и гидрогелевую аликвоту внеклеточного матрикса (ВКМ) объемом 50 мкл на лед.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гидрогель ECM можно предварительно распределить на порции 50 мкл на льду с помощью охлаждаемых при температуре 4 °C пипеток и хранить при -80 °C до тех пор, пока он не понадобится. Гидрогель ECM можно временно держать на льду для медленного оттаивания для последующего экспериментального использования.
  6. Смешайте клеточную гранулу с гидрогелем ECM для инъекции, стремясь завершить этот этап как можно быстрее, прежде чем начинать внутричерепные инъекции. В качестве стандартной процедуры используйте 2 мкл суспензии, содержащей 200 000 клеток, суспендированных в гидрогеле ECM.
    Примечание: Если внутричерепные инъекции занимают более 2-3 часов, следует подготовить новый запас клеток, так как длительная инкубация на льду может снизить жизнеспособность клеток. Возможно внутричерепное введение до 1 000 000 клеток и в объемах до 10 μл; однако для этого потребуется ресуспендировать клетки в PBS, а не в гидрогеле ECM, и добавить их с очень медленной скоростью инъекции.

3. Установка стереотаксического и анестезиологического оборудования

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура, перечисленная ниже, может незначительно отличаться в зависимости от производителя стереотаксического оборудования и предпочитаемого типа анестезии.

  1. Запустите BSC, сначала продезинфицировав его поверхность с помощью моющего средства Polysorbate 20 и оставив на 10 минут. Впоследствии протрите поверхность 80% этанолом. Перед установкой в колпак BSC протрите каждую единицу оборудования 80% этанолом (избегайте смачивания электрических входов).
  2. Расположите опорную пластину внутри капота BSC в соответствии с рисунком 1 так, чтобы носовой обтекатель располагался с правой стороны (для правшей). Убедитесь, что манипуляторы XYZ уже прикреплены к опорной плите и закреплены.
  3. Подключите консоль цифрового дисплея к входному отверстию в задней части опорной плиты и подключите кабель питания к прилагаемому источнику питания в кожухе BSC (см. рис. 1). Эта консоль регистрирует координаты движений манипулятора XYZ.
  4. Закрепите канистру с угольным фильтром (для выхода анестетика) и вход анестетика в двух клапанах на съемном наконечнике. Наденьте наконечник носа на монтажную секцию и затяните винт на стереотаксическом аппарате.
  5. Прикрепите ушные планки к соответствующим держателям с каждой стороны монтажной секции, закрепив их на месте, затянув винты, прикрепленные к держателям. Ушные планки можно накрыть марлевыми салфетками или изолентой.
  6. Введите хирургическое ложе в устройство, регулируя его высоту так, чтобы оно совпадало с ушными планками, которые фиксируют животное в нужном положении. Оберните хирургическую кровать измерительной подушкой, чтобы животное было в тепле.
  7. Подключите грелку к источнику питания и расположите ее под животным, чтобы сохранить тепло во время процедуры анестезии.
  8. Внутри капюшона BSC расположите стерильные ватные наконечники, наконечники для пипеток объемом 20 мкл, глазную мазь, индивидуально упакованные салфетки с изопропанолом, хирургический клей и пипетку объемом 20 мкл. Смочите марлевую салфетку с 80% этанолом и положите поверх нее стерильные щипцы и скальпель.
  9. Очистите стеклянный микрошприц, промыв его 5 раз в холодном 80% этаноле, а затем в холодном 0,9% физиологическом растворе.
  10. Для сверления подключите двигатель дрели к источнику питания и установите дрель на манипулятор XYZ, обеспечив надежную посадку, плотно закрутив ее.
  11. Замените компонент дрели на стеклянный держатель микрошприца для инъекций клеток. Снимите дрель, ослабив винт на манипуляторе XYZ и заменив его держателем шприца. Убедитесь, что винт затянут, прежде чем совмещать стеклянный микрошприц с ранее просверленным отверстием.
  12. После использования стереотаксического устройства демонтируйте все компоненты и продезинфицируйте их 80% этанолом, прежде чем хранить их в чистом ящике для хранения или непыльном шкафу. Утилизируйте все острые предметы безопасно и надлежащим образом в специальный контейнер для острых предметов.

4. Внутричерепная инъекция

Внутричерепные инъекции могут быть выполнены как самцам, так и самкам мышей, хотя самкам мышей обычно отдается предпочтение, так как они менее подвержены раневым осложнениям, вызванным агрессией среди самцов. Процедура обычно проводится на мышах в возрасте 7-10 недель, что дает достаточно времени для развития опухоли. Как правило, животных рандомизируют в группы по 4-6 человек в клетке. Штаммы с ослабленным иммунитетом, такие как BALB/c Nude, NOD-SCID и NSG, обычно используются для разработки ксенотрансплантата (PDX), полученного от пациента, поскольку их иммунодефицитный статус способствует приживлению и росту опухоли24. В то время как данный протокол указывает на использование изофлурана для индукции анестезии, альтернативные анестетики, такие как кетамин и ксилазин, также могут быть использованы25. Если изофлуран не используется, этапы с использованием анестезиологической камеры и связанного с ней оборудования могут быть исключены из процедуры.

  1. Взвесьте и контролируйте общее самочувствие животных перед внутричерепной процедурой. Вводите обезболивающее средство животным по одной клетке за раз (например, бупренорфин 0,05 мг/кг, внутрибрюшинно) в течение 1 ч до начала внутричерепной инъекции.
  2. Настройте анестезиологическое оборудование в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к инструменту. Перед началом процедуры убедитесь, что испаритель заполнен хотя бы наполовину. Убедитесь, что подача кислорода открыта.
  3. Если у животных есть мех, его можно удалить за день до внутричерепной процедуры или одновременно. Удалите шерсть с места операции на тыльной стороне или черепе мыши с помощью электрических машинок для стрижки или бритвы.
  4. Переведите животное в камеру индукции анестезии. Убедитесь, что расходомер на анестезиологическом аппарате настроен на скорость потока 1 л/мин, а регулятор кислорода находится в диапазоне 40-50 фунтов на квадратный дюйм. Обеспечьте поддержание средней анестезии, проверив, что мышцы расслаблены, а рефлексы отсутствуют.
  5. Следите за реакцией животного на раздражители и наблюдайте за движением грудной стенки, чтобы обеспечить ровное дыхание. Если внутричерепные инъекции превышают 10 минут, контролируйте температуру с помощью ректального зонда и системы мониторинга температуры, а также отслеживайте пульс с помощью пульсоксиметра
  6. Установите животное на стереотаксическое устройство, убедившись, что передние зубы зафиксированы в разрезе, а носовой конус зафиксировал животное на месте.
  7. Продезинфицируйте голову мыши ватным наконечником, пропитанным йодом, а затем салфеткой с изопропанолом. Нанесите мазь роговицы на оба глаза, чтобы предотвратить высыхание во время операции.
  8. Начните разрез у основания мозжечка и продлите его через череп до середины, сделав небольшой надрез примерно 1 см в длину вдоль верхней части черепа.
  9. Натяните кожу между ушами, чтобы обнажить череп, и закрепите голову, затянув ушные планки. Очистите поверхность черепа и высушите ее ватной палочкой.
  10. Закрепите сверло на стереотаксической раме и найдите брегму (или лямбдоидную структуру) с помощью дрели.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конкретные стереотаксические координаты выбираются на основе анатомической области, необходимой для исследования приживления. Эти точные координаты могут быть получены из опубликованной литературы или определены с помощью таких ресурсов, как атлас Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates26 , что обеспечивает точное нацеливание для успешной имплантации.
  11. После того, как координаты установлены, с помощью дрели осторожно создайте небольшое отверстие в кости в обозначенном месте диффузной срединной глиомы (DMG): X = +0,5, Y = -5,5, Z = -3,1 от брегмы; Супратенториальная опухоль головного мозга (ГБМ или эпендимома): X = +1,5, Y = +1, Z = -3 от брегмы; Инфратенториальная опухоль головного мозга (медуллобластома, эпендимома): X = +2, Y = - 2, Z = -2 от лямбдоидной структуры.
  12. Многократно суспендируйте ячейки с помощью пипетки, избегая образования пузырьков воздуха. Наберите 2 мкл клеточной смеси в предварительно промытый холодный стеклянный микрошприц. Прикрепите шприц к стереотаксической раме и отрегулируйте иглу по кончику черепа.
  13. Введите клетки в течение 30 с в просверленную область, высушив всю рефлегмационную суспензию клеток во время инъекции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку клетки суспензированы в гидрогеле ECM, инъекция должна происходить достаточно быстро, чтобы клеточная суспензия не застыла в шприце. Различная плотность клеток может быть использована для оценки различных скоростей приживления, при этом более высокая плотность клеток обычно приводит к более быстрому приживлению опухоли.
  14. Оставьте шприц на месте на 1 минуту, чтобы избежать обратного потока и дать гидрогелю ECM осесть. Извлеките шприц и протрите рану салфеткой с изопропанолом. При необходимости используйте клей для кожи или зажимы для ран, чтобы закрыть разрез.
  15. Поместите животное в лежачее положение в чистую клетку для восстановления с тепловой лампой или на грелку, чтобы сохранить тепло до выздоровления. Постоянно наблюдайте за животным, пока оно не начнет двигаться самостоятельно, и часто после этого, пока оно не начнет вести себя нормально.
  16. Если обнаружено, что ранее запечатанная рана у животного вновь открылась во время восстановления, снова обезболите животное, очистите рану салфеткой с изопропанолом, чтобы удалить остатки клея, а затем снова закрепите скобами.

5. Послеоперационный мониторинг для приживления

  1. После внутричерепной инъекции начните наблюдение за мышами 5 дней в неделю (или чаще, если это необходимо). Обеспечьте последующий уход, такой как семена или кашеобразная пища, в течение первых нескольких недель после внутричерепной инъекции. Внимательно следите за животными на предмет возможного открытия раны.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если самкам обрезают раны, они остаются в лотке, так как редко проявляют агрессию. Для самцов животных мы предоставляем два иглу в клетке, а также дополнительное обогащение, чтобы снизить агрессию. В редких случаях, когда возникает агрессия, приводящая к повторному открытию ран, раны закрепляются скобами, а агрессор удаляется из группы и размещается отдельно.
  2. Записывайте в лист мониторинга общие параметры самочувствия, такие как потеря веса, уровень активности, осанка, признаки обезвоживания и состояние шерсти.
  3. Запишите в лист мониторинга прерывистые, легкие или тяжелые неврологические симптомы, такие как наклон головы, атаксия и/или круговое поведение.
  4. Определите неврологические симптомы следующим образом:
    1. Наблюдайте и классифицируйте следующие симптомы как интермиттирующие: Наклон головы: наблюдается 1-2 раза в течение 5-минутного осмотра, общее самочувствие удовлетворительное. Атаксия: наблюдается 1-2 раза в течение 5-минутного осмотра; Общее самочувствие удовлетворительное. Кружение: наблюдается 1-2 раза в течение 5-минутного осмотра; Общее самочувствие удовлетворительное. Поведение: Мыши демонстрируют нормальное поведение, способны дотягиваться до пищи/воды и лазать.
    2. Наблюдайте и классифицируйте следующие симптомы как легкие: Наклон головы: регулярно проявляется во время 5-минутного осмотра, общее самочувствие удовлетворительное. Атаксия: Регулярно проявляется во время 5-минутного осмотра, общее самочувствие удовлетворительное. Кружение: Регулярно отображается во время 5-минутного осмотра, общее самочувствие удовлетворительное. Поведение: У мышей может быть взъерошенная шерсть или сухая кожа, но они все еще могут демонстрировать нормальное поведение, питаться и лазать.
    3. Наблюдайте и классифицируйте следующие симптомы как тяжелые: Наклон головы: постоянно проявляется во время осмотра, наклон почти на 90°, шерсть взъерошена, менее активна. Атаксия: Постоянно проявляется при осмотре, пьяные движения, взъерошенная шерсть, менее активна. Круговая: Постоянно проявляется во время осмотра, шерсть с оборками, менее активна. Поведение: У мышей может быть очень взъерошенная шерсть или сухая кожа. У них может наблюдаться потеря веса более чем на 15%. На этом этапе обеспечьте животных семенами или кашицей кормом.
  5. Установите гуманную конечную точку для мышей, когда у них проявляются любые из следующих клинических признаков, указывающих на рост опухоли, влияющий на их благополучие: потеря веса на 20% или более от их первоначального веса, сильный наклон головы, тяжелая атаксия, сильное кружение, летаргия или затрудненное дыхание. На этом этапе гуманно усыпляют мышей с помощью удушенияСО2 .

6. Забор мозгов

  1. Убедитесь, что животное гуманно усыплено либо путем удушьяCO-2 , либо вывиха шейного отдела.
  2. Сделайте разрез по средней линии в 2 см вдоль кожи головы с помощью ножниц или скальпеля. Осторожно отделите и снимите кожу, чтобы обнажить череп.
  3. С помощью тонких ножниц или скальпеля сделайте аккуратный разрез на 2 см по средней линии черепа. Аккуратно подденьте череп с помощью щипцов, двигаясь от затылка к носу.
  4. Продолжайте резать по бокам черепа, не повреждая мозговую ткань под ним. Как только череп будет полностью открыт, осторожно отделите мозг от черепных нервов и кровеносных сосудов с помощью щипцов и ножниц.
  5. Аккуратно поднимите мозг из полости черепа, начиная со спины и двигаясь вперед. Хранение мозга в соответствующих условиях, основанных на требованиях последующих экспериментальных процедур, таких как внезапная заморозка или фиксация. Иммуногистохимический анализ головного мозга может варьироваться в зависимости от лаборатории. Типичный рабочий процесс для пролиферативного клеточного маркера KI67 описан в опубликованной литературе20.

Результаты

Ортотопические инъекции с использованием стереотаксического устройства стали неотъемлемой частью разработки моделей опухолей головного мозга. Этот метод позволяет точно и воспроизводимо размещать опухолевые клетки, что имеет решающее значение для получения согласованных и надежных данных в исследованиях в области нейроонкологии. Успешное внедрение ортотопических инъекций в значительной степени зависит от точной настройки стереотаксического оборудования, которое обычно включает в себя стереотаксическую раму, цифровой микроманипулятор для точных движений, инъекционный шприц и систему анестезии для иммобилизации животного (рис. 1A, B). Использование стеклянного микрошприца позволяет вводить внутрь небольшие объемы, обычно от 2 до 5 мкл. Надлежащий уход и частое мытье необходимы для предотвращения накопления биологического материала, который может блокировать инъекцию (Рисунок 1C).

Процедура внутричерепного введения опухолевых клеток головного мозга с использованием стереотаксического оборудования у мышей включает в себя несколько ключевых этапов. Во-первых, мышь обезболивается, чтобы оставаться неподвижной и комфортной на протяжении всей процедуры. Типичными признаками, указывающими на то, что животное находится под наркозом, являются отсутствие движения и рефлексов при пощипывании пальцев ног, а также наличие регулярного паттерна дыхания. Затем мышь помещается в стереотаксическую рамку, фиксируя ее голову в фиксированном положении (рисунок 2А). С помощью ориентиров на черепе, таких как брегма и лямбда, определяются точные координаты для инъекции. На волосистой части головы делается небольшой разрез, а в черепе по выбранным координатам просверливается отверстие для заусенцев (рисунок 2В). Игла для микроинъекций, прикрепленная к стереотаксической руке, вводится через отверстие для заусенцев, чтобы доставить опухолевые клетки в желаемую область мозга (кору, мозжечок или ствол мозга; Рисунок 2В). Тщательный контроль и регулировка положения иглы обеспечивают точное прицеливание. После инъекции игла медленно извлекается, а разрез закрывается (рисунок 2D). Ожидается, что запечатанная рана заживет в течение двух недель после внутричерепной инъекции.

После внутричерепной инъекции животные нуждаются в тщательном наблюдении за общим самочувствием и развитием неврологических симптомов, которые часто указывают на прогрессирование опухоли (дополнительная таблица 1). Как правило, животные могут испытывать незначительную потерю веса в течение 1-й недели после инъекции (до 10% от их максимального веса), которая обычно стабилизируется после того, как места инъекций полностью запечатаны к концу2-й недели. Как правило, животные демонстрируют устойчивый рост веса и поддерживают хорошее общее состояние здоровья до тех пор, пока не произойдет прогрессирование опухоли. Проявление неврологических симптомов варьируется в зависимости от таких факторов, как тип опухоли головного мозга, место инъекции и штамм животного. Например, корковые глиомы или эпендимомы могут проявляться прогрессирующей потерей веса и потенциальным увеличением переднего мозга, в то время как глиомы ствола головного мозга и медуллобластомы могут проявлять такие симптомы, как атаксия и наклон головы, особенно у животных с ослабленным иммунитетом (рис. 3A). Кроме того, круговое поведение может наблюдаться у животных с опухолями ствола мозга, особенно у штаммов NSG или NOD/SCID. Прогрессирование неврологических симптомов часто совпадает с постепенным снижением веса. Надлежащие меры после ухода, такие как предоставление бутылок с водой с длинными насадками или предложение мягкой пищи (кашеобразных гранул корма) или семян, имеют важное значение для поддержания благополучия животных. По достижении экспериментальной конечной точки и последующей гуманной эвтаназии животных могут стать очевидными потенциальные изменения в мозге, включая увеличение в месте инъекции и/или наличие геморрагических областей (рис. 3B).

Графы Каплана-Мейера обычно используются для отображения результатов выживания животных моделей опухолей головного мозга. Они предлагают визуальное изображение вероятности выживания с течением времени после внутричерепной инъекции или противоопухолевого лечения. Эти графики служат важнейшими инструментами для анализа и представления данных о выживаемости в условиях доклинических исследований15,27. Мы проводили внутричерепные инъекции клеточной культуры медуллобластомы D425 при различной плотности клеток в мозжечке. У всех животных внутричерепно вводились развившиеся опухоли. Наши результаты показали, что более высокая плотность клеток, а именно 50 000 и 100 000 клеток на мышь, приживаются быстрее, чем 10 000 клеток на мышь (рис. 4). Кроме того, мы внутричерепно ввели клетки глиомы высокой степени злокачественности (HGG), полученные от пациента, в кору головного мозга и ствол мозга, чтобы сравнить общую выживаемость и характер роста опухоли, а также иммуногистохимические особенности в этих различных местах. Независимо от локализации, всем животным вводили внутричерепные опухоли. Культивирование клеток HGG проводили в соответствии с протоколом, подробно описанным в шагах 1.1 - 1.10. Подготовку клеток к внутричерепному введению проводили, как описано на этапах с 2.1 по 2.6, в то время как процедуру внутричерепной инъекции проводили в соответствии с методом, описанным на этапах 4.1 - 4.1627. При введении в кору головного мозга клетки HGG показали среднюю выживаемость примерно через 25 дней после внутричерепной инъекции (рис. 5A). Наблюдение за животными проводилось в соответствии с шагами 5.1 - 5.4. У этих животных не проявлялось никаких неврологических симптомов, но наблюдалась прогрессирующая потеря веса. Животных гуманно усыпляли по достижении гуманной конечной точки, описанной в шаге 5.5. Мозг собирали в соответствии с протоколом, подробно описанным в шагах с 6.1 по 6.5, и отправляли надальнейший анализ27. Иммуногистохимический анализ выявил большую, высокоядерную опухолевую массу с признаками повышенной васкуляризации (Рисунок 5B) и большое количество пролиферативных клеток Ki67 (Рисунок 5C). При введении в ствол мозга клетки HGG продемонстрировали среднюю выживаемость примерно через 26 дней после внутричерепной инъекции (рисунок 5D). Иммуногистохимический анализ показал большое опухолевое образование в области 4-го желудочка/верхнего моста, а также лептоменингеальную инфильтрацию в боковой желудочек (рисунок 5E). Дальнейший иммуногистохимический анализ показал наличие большого количества пролиферативных клеток в стволе мозга и других инфильтрированных областях (Рисунок 5F). Этот эксперимент подчеркивает, что введение одних и тех же опухолевых клеток в разные анатомические места не влияет на скорость роста опухоли, хотя наблюдаются некоторые различия в характере роста.

figure-results-1
Рисунок 1: Репрезентативные изображения стереотаксической установки для внутричерепного введения клеток опухоли головного мозга. (A) Анестезиологический аппарат обычно располагается рядом с капюшоном BSC, что требует двойного введения анестезии как в индукционную камеру, так и в стереотаксический аппарат. (B) Стеклянная станция для промывки микрошприцев и стереотаксический держатель; Шприц требует промывания физиологическим раствором, этанолом, а впоследствии и водой после каждой внутричерепной инъекции. (C) Стереотаксическая установка внутри колпака BSC, иллюстрирующая анестезиологическую камеру, сверлильный станок, стереотаксическое устройство, стереотаксическую координатную консоль, ватные наконечники, скальпель, пинцет, пипетку и наконечники. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Репрезентативные изображения внутричерепной инъекции, выполняемой мыши с ослабленным иммунитетом. (A) Животное под наркозом, помещенное в конус с анестезирующим. (В) Разрез кожи с последующим закреплением кожи с каждой стороны ушными планками. (C) Стеклянный микрошприц, расположенный поверх просверленного отверстия для инъекции. (D) После приклеивания кожа принимает форму ирокеза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Потенциальные неврологические симптомы, наблюдаемые после приживления опухолевых клеток головного мозга. (A) Животное демонстрирует наклон головы после внутричерепного введения клеток DMG в ствол мозга. (Б) Увеличение правого кортикального полушария со стороны инъекции, выявляющее опухолевое образование. Животному вводили клетки эпендимомы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Приживление культуры медуллобластомы D425 при различной плотности клеток. Клетки медуллобластомы вводили внутричерепно с использованием стереотаксического оборудования при плотности 10 000 клеток в 2 мкл гидрогеля ECM, 50 000 клеток и 100 000 клеток. За животными наблюдали на предмет прогрессирующей потери веса и гуманно усыпляли, как только они достигали 20% ниже своего максимального зарегистрированного веса. Медиана выживаемости для животных, которым было введено 10 000 клеток, составила 29 дней, в то время как средняя выживаемость для животных, которым была введена более высокая плотность клеток 50 000 и 100 000 клеток, составила 17,5 дней и 15 дней соответственно. У всех животных, введенных в этом исследовании, успешно развились опухоли. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Репрезентативные кривые выживаемости и гистологический анализ животных NSG, которым внутричерепно вводили клетки HGG в кору головного мозга и ствол мозга. Приблизительно 100 000 HGG-клеток (пассаж 3) вводили в 2 мкл гидрогеля ECM с использованием стереотаксического оборудования. За животными наблюдали на предмет прогрессирующей потери веса и гуманно усыпляли, как только они достигали 20% ниже своего максимального зарегистрированного веса. Никаких неврологических симптомов для этого подтипа опухоли головного мозга не наблюдалось. (A) Медиана выживаемости животных с клетками HGG, введенными в кору головного мозга, составляет примерно 25 дней после инъекции (N=2). (B) Окрашивание коры головного мозга H&E показывает высокоядерную область с повышенной васкуляризацией, на что указывает присутствие эритроцитов. (C) Привитая опухолью область коры головного мозга демонстрирует высокий уровень пролиферативных клеток, о чем свидетельствует окрашивание KI67. (D) Медиана выживаемости животных с клетками HGG, введенными в ствол мозга, составляет примерно 26 дней после инъекции (N=2). У всех животных, введенных в этом исследовании, успешно развились опухоли. (E) Окрашивание ствола головного мозга методом H&E показывает область с высоким содержанием ядер с инфильтрацией опухоли, наблюдаемой в лептоменингах в боковом желудочке. (F) Привитая опухолью область ствола мозга демонстрирует высокий уровень пролиферативных клеток, о чем свидетельствует окрашивание KI67. Черная масштабная линейка на основных изображениях указывает на 2 мм, в то время как увеличенные вставленные изображения указывают на 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительная таблица 1: Форма мониторинга используется для осмотра животных после внутричерепных инъекций и потенциального лечения противоопухолевыми препаратами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Обсуждение

В то время как техника внутричерепной инъекции, описанная в этом исследовании, обеспечивает надежный метод для создания ортотопических моделей ксенотрансплантата пациента (PDX) для опухолей головного мозга у детей, несколько областей нуждаются в улучшении. Один из подходов к совершенствованию методики заключается в оптимизации процесса подготовки опухолевых клеток. Это включает в себя очистку материалов, используемых для имплантации опухолевых клеток. В то время как гидрогель ВКМ считается золотым стандартом, использование гидрогелей, состоящих из компонентов, которые больше напоминают компоненты ЭКМ мозга или опухоли, может повысить выживаемость и приживление БТ-клеток. Этот подход особенно полезен для типов опухолей с более длительным периодом приживления, таких как медуллобластомы и эпендимомы. Например, было показано, что коллаген играет решающую роль в росте медуллобластомы группы 3, в то время как ламинин поддерживает тип медуллобластомыSHH 28. Кроме того, жесткость ВКМ также может влиять на рост опухоли. Глиобластомы высокой степени злокачественности, например, демонстрируют более высокую жесткость в ядре по сравнению с нормальной тканью мозга, что может способствовать росту опухолии выживаемости. Подгоняя состав и жесткость ЭКМ в соответствии с конкретными требованиями различных типов опухолей, можно значительно улучшить приживление и рост моделей PDX.

Несколько недавних исследований предоставили ценную информацию об обработке образцов опухолей у пациентов и разработке моделей PDX. Tsoli et al. подчеркнули, что прямая имплантация ткани DMG обычно приводит к более высоким показателям приживления, чем при использовании первичных культур15. Smith et al. создали 37 моделей PDX с помощью внутричерепного введения биопсии опухоли головного мозга или образцов аутопсии, сообщив об общем показателе успеха в 43%, при этом HGG продемонстрировали самую высокую частоту приживления (100%), за ними следуют медуллобластомы (45%) и эпендимомы (25%). Латентность опухоли варьировала в широких пределах, от 1 до 11 месяцев, при этом более агрессивные опухоли приживалисьбыстрее. Напротив, Brabetz et al. сообщили о более низком общем показателе успеха в 30%, при этом HGG демонстрируют 31% приживления и более низкие показатели для медуллобластом (37%) и эпендимомы (17%)16. Несмотря на эти различия, последние два исследования, проведенные Smith et al. и Brabetz et al., подтвердили, что модели PDX в целом повторяют опухоли пациентов на иммуногистохимическом и молекулярном уровнях, хотя наблюдались незначительные геномные расхождения между исходными образцами опухолей и установленными моделями. Эти результаты подчеркивают трудности в разработке репрезентативных моделей PDX и подчеркивают вариабельность успешности приживления у разных типов опухолей11,16.

Одним из существенных ограничений ортотопического подхода является невозможность точного измерения размера опухоли без использования системы визуализации, такой как ксеногенная визуализация, если опухолевые клетки помечены люциферазой или магнитно-резонансной томографией (МРТ). Мечение опухолевых клеток люциферазой может стать решением, позволяющим проводить биолюминесцентную визуализацию для подтверждения приживления и мониторинга прогрессирования опухоли неинвазивным способом. Этот метод расширит возможности динамического отслеживания ответа на лечение, тем самым предлагая более точную оценку терапевтической эффективности. Альтернативный метод включает в себя использование технологии МРТ; Однако обнаруживаемость опухолей зависит от их размера. Более крупные опухоли легче идентифицировать, что часто находится в экспериментальной конечной точке, и обнаружение также может варьироваться в зависимости от подтипа опухоли, при этом GBM обнаруживается легче, чем диффузные глиомы27,31. В частности, при диффузных глиомах наличие неповрежденного гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) приводит к отсутствию контрастного усиления. Однако при ГБМ негерметичная сосудистая сеть и наличие отека могут усиливать контраст между опухолевой тканью и окружающей здоровой тканью мозга, потенциально способствуя процессу обнаружения. Как правило, контрастные агенты необходимы для улучшения обнаружения 30,31,32. Альтернативные методы визуализации, такие как диффузионно-взвешенная визуализация (DWI) и восстановление инверсии с ослаблением жидкости (FLAIR), иногда используются для улучшения обнаружения неусиливающихся областей опухоли. Однако эти методы также имеют свои ограничения и не всегда могут обеспечить точное разграничение границ опухоли33. Амидная протонно-взвешенная визуализация (APTw) — это неинвазивный метод МРТ, который обнаруживает диффузные глиомы путем отслеживания протонного обмена белка и воды, что способствует классификации опухоли. Несмотря на многообещающие перспективы, он сталкивается с такими проблемами, как восприимчивость к артефактам, и еще не адаптирован для визуализации мелких животных, что ограничивает его болееширокое применение.

Еще одним важным аспектом, который следует учитывать при использовании ортотопических моделей BT PDX для исследований эффективности лекарств, является целостность ГЭБ в используемых моделях PDX. Проницаемость ГЭБ значительно влияет на доставку лекарств и эффективность лечения опухолей головного мозга. Например, поддержание целостности ГЭБ при глиомах ствола мозга часто приводит к плохому проникновению лекарств, ограничивая эффективностьсистемной терапии. С другой стороны, при медуллобластомах 3-й группы целостность ГЭБ была неоднородной на МРТ-томографии, и она также была обнаружена негерметичной в моделях ксенотрансплантата (PDX)35. Таким образом, характеристика статуса ГЭБ - является ли она неповрежденной или негерметичной - в каждой модели PDX имеет важное значение для разработки соответствующих терапевтических стратегий и точной интерпретации результатов исследований эффективности лекарств.

В целом, описанная процедура внутричерепной инъекции предлагает надежный подход к созданию моделей БТ PDX и проведению исследований эффективности терапевтических агентов. Постоянное совершенствование в сочетании с всесторонним пониманием этих моделей повысит их полезность и облегчит разработку терапевтических вмешательств для детей с БТ.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят пациентов, врачей и исследователей из Сети детских больниц Сиднея, Сети банков детских опухолей Сиднея и Программы по борьбе с раком у детей за щедрое предоставление необходимых образцов для разработки этой методологии. Детский институт рака Австралии связан с Университетом Нового Южного Уэльса в Сиднее и Сетью детских больниц Сиднея. Этот протокол основан на исследовательских усилиях, поддержанных грантами Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям (Synergy Grant #2019056, Leadership Grant APP2017898 to DZ) и Cancer Institute New South Wales Program Grant (TPG2037 to DZ и MT), а также при поддержке проектов Levi's, The Kids Cancer Project, The Cure Starts Now, DIPG Collaborative, Фонд лечения рака мозга, Фонд Роберта Коннора Доуса и Фонд Бенни Уиллса.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Обезболивающее средство (например, изофлуран)Мерк792632
100% этанолМерк459844
70% этанолNANAСделайте 70% этанол из 100% этанола, разбавив его стерильной водой
80% этанолNANAСделайте 80% этанол из 100% этанола, разбавив его стерильной водой
Адгезивные предметные стекла для микроскопаМеркZ681156
Анальгетик (Бупренорфин 0,3 мг/мл)ДжуроксNA
Канистра с угольным фильтромВетеринарное снаряжение931401
Конические пробирки 15 мл (Falcon)Научный центр Фишера14-959-53А
Конические пробирки 50 мл (Falcon)Научный центр Фишера14-432-22
ДМСОМерк472301
АмбушюрыКопф1921
Гидрогель ECM (Matrigel, Corning)МеркЕ1270
Мазь для глаз (Poly Visc)ХимикДирект 719986
Фетальная сыворотка для теленкаМеркФ0926
стеклянный микрошприцГамильтон7002
Салфетки с изопропаноломМедисаSUL_LWMS-1
Антитела к KI67АбкамАБ209897
Микроцентрифужные пробиркиЭппендорф211-2130
Микробуровые долота  0.028"Копф8170
Блок микровпрыскаКопф5004
ПБСМеркП4474
Пипетка 10 млКорнингCLS4488
Пипетка 1мл Эппендорф3123000063
Пипетка 200 мклЭппендорф3123000055
Пипетка 20 мклЭппендорф3123000098
Пипетка 25 млКорнингCLS4489
Наконечник для пипетки 1 млКорнингCLS4868
Наконечник для пипетки 200 мклКорнингCLS4860
Моющее средство Полисорбат 20 (F10SC)Здоровье и гигиенаГ3070
Пульсоксиметр (MouseSTAT)Кент СайентификSPO2-MSE
Рйод (повидон-йод)МеркY0000466
Скальпель (одноразовый)МедисаSUL_SCALPEL
Клей для кожи VetbondМедиса3M_1469SB
Стереотаксический инструмент для мелких животных с цифровым дисплеем консоли Копф940
Стереотаксическая дрель Копф1474
Система мониторинга температуры Гарвардский аппарат55-7020
Трипан синийМерк93595

Ссылки

  1. Mueller, S., Chang, S. Pediatric brain tumors: current treatment strategies and future therapeutic approaches. Neurotherapeutics. 6 (3), 570-586 (2009).
  2. Packer, R. J. Brain tumors in children. Arch Neurol. 56 (4), 421-425 (1999).
  3. Paugh, B. S., et al. Integrated molecular genetic profiling of pediatric high-grade gliomas reveals key differences with the adult disease. J Clin Oncol. 28 (18), 3061-3068 (2010).
  4. MacDonald, T. J., Aguilera, D., Kramm, C. M. Treatment of high-grade glioma in children and adolescents. Neuro Oncol. 13 (10), 1049-1058 (2011).
  5. Rutka, J. T. Malignant brain tumours in children : Present and future perspectives. J Korean Neurosurg Soc. 61 (3), 402-406 (2018).
  6. Cho, Y. J., et al. Integrative genomic analysis of medulloblastoma identifies a molecular subgroup that drives poor clinical outcome. J Clin Oncol. 29 (11), 1424-1430 (2011).
  7. Thomas, A., Noel, G. Medulloblastoma: optimizing care with a multidisciplinary approach. J Multidiscip Healthc. 12, 335-347 (2019).
  8. Pajtler, K. W., et al. Molecular classification of ependymal tumors across all CNS compartments, histopathological grades, and age groups. Cancer Cell. 27 (5), 728-743 (2015).
  9. Thorp, N., Gandola, L. Management of ependymoma in children, adolescents and young adults. Clin Oncol. 31 (3), 162-170 (2019).
  10. Upton, D. H., Ziegler, D. S., Tsoli, M. Development of orthotopic patient-derived xenograft models of pediatric intracranial tumors. Methods Mol Biol. 2806, 75-90 (2024).
  11. Smith, K. S., et al. Patient-derived orthotopic xenografts of pediatric brain tumors: a St. Jude resource. Acta Neuropathol. 140 (2), 209-225 (2020).
  12. Akter, F., et al. Pre-clinical tumor models of primary brain tumors: Challenges and opportunities. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1875 (1), 188458(2021).
  13. Stribbling, S. M., Ryan, A. J. The cell-line-derived subcutaneous tumor model in preclinical cancer research. Nat Protoc. 17 (9), 2108-2128 (2022).
  14. He, C., et al. Patient-derived models recapitulate heterogeneity of molecular signatures and drug response in pediatric high-grade glioma. Nat Commun. 12 (1), 4089(2021).
  15. Tsoli, M., et al. International experience in the development of patient-derived xenograft models of diffuse intrinsic pontine glioma. J Neurooncol. 141 (2), 253-263 (2019).
  16. Brabetz, S., et al. A biobank of patient-derived pediatric brain tumor models. Nat Med. 24 (11), 1752-1761 (2018).
  17. Khan, A., et al. Dual targeting of polyamine synthesis and uptake in diffuse intrinsic pontine gliomas. Nat Commun. 12 (1), 971(2021).
  18. Chen, Y., et al. Preclinical evaluation of protein synthesis inhibitor omacetaxine in pediatric brainstem gliomas. Neurooncol Adv. 6 (1), vdae029(2024).
  19. Ung, C., et al. Doxorubicin-loaded gold nanoarchitectures as a therapeutic strategy against diffuse intrinsic pontine glioma. Cancers (Basel). 13 (6), 1278(2021).
  20. Ehteda, A., et al. Dual targeting of the epigenome via FACT complex and histone deacetylase is a potent treatment strategy for DIPG. Cell Rep. 35 (2), 108994(2021).
  21. Mayoh, C., et al. High-throughput drug screening of primary tumor cells identifies therapeutic strategies for treating children with high-risk cancer. Cancer Res. 83 (16), 2716-2732 (2023).
  22. Lin, G. L., Monje, M. A Protocol for rapid post-mortem cell culture of diffuse intrinsic pontine glioma (DIPG). J Vis Exp. (121), e55360(2017).
  23. Whitehouse, J. P., et al. In vivo loss of tumorigenicity in a patient-derived orthotopic xenograft mouse model of ependymoma. Front Oncol. 13, 1123492(2023).
  24. Hermans, E., Hulleman, E. Patient-derived orthotopic xenograft models of pediatric brain tumors: In a mature phase or still in its infancy. Front Oncol. 9, 1418(2019).
  25. Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc. 4 (11), 1670-1680 (2009).
  26. Paxinos, G., Franklin, K. Paxinos and Franklin's the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , 5th edn, Academic Press. (2019).
  27. Tsoli, M., et al. Integration of genomics, high throughput drug screening, and personalized xenograft models as a novel precision medicine paradigm for high risk pediatric cancer. Cancer Biol Ther. 19 (12), 1078-1087 (2018).
  28. Yang, H., et al. Roles and interactions of tumor microenvironment components in medulloblastoma with implications for novel therapeutics. Genes Chromosomes Cancer. 63 (4), e23233(2024).
  29. Kondapaneni, R. V., et al. Glioblastoma mechanobiology at multiple length scales. Biomater Adv. 160, 213860(2024).
  30. Mahmoudian, E., Jahani-Asl, A. Establishing brain tumor stem cell culture from patient brain tumors and imaging analysis of patient-derived xenografts. Methods Mol Biol. 2736, 177-192 (2024).
  31. Oudin, A., Moreno-Sanchez, P. M., Baus, V., Niclou, S. P., Golebiewska, A. Magnetic resonance imaging-guided intracranial resection of glioblastoma tumors in patient-derived orthotopic xenografts leads to clinically relevant tumor recurrence. BMC Cancer. 24 (1), 3(2024).
  32. Bauer, S., Wiest, R., Nolte, L. P., Reyes, M. A survey of MRI-based medical image analysis for brain tumor studies. Phys Med Biol. 58 (13), R97-R129 (2013).
  33. Lasocki, A., Gaillard, F. Non-contrast-enhancing tumor: A new frontier in glioblastoma research. AJNR Am J Neuroradiol. 40 (5), 758-765 (2019).
  34. Nichelli, L., Zaiss, M., Casagranda, S. APT weighted imaging in diffuse gliomas. BJR Open. 5 (1), 20230025(2023).
  35. Genovesi, L. A., et al. Patient-derived orthotopic xenograft models of medulloblastoma lack a functional blood-brain barrier. Neuro Oncol. 23 (5), 732-742 (2021).

Перепечатки и разрешения

Теги

ортотопическая опухоль головного мозгаинтракраниальная инъекцияпедиатрическая опухоль головного мозгадиффузная глиома срединных структургематоэнцефалический барьерприживление опухоликультура нейросфериммуногистохимический анализ
Создание ортотопических моделей ксенотрансплантатов, полученных от пациента, для опухолей головного мозга с использованием стереотаксического устройства
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.