Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Валидация конъюгации терапевтического агента с медицинскими изделиями, покрытыми поливиниловым спиртом

913 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67358

⸱

29 ноября 2024 г.

 ,  , 
1Department of Surgery, LSU Health Shreveport, 2Department of Molecular and Cellular Physiology, LSU Health Shreveport

В этой статье

Краткое содержание

В данной работе мы представляем протокол дериватизации медицинских изделий с белковыми терапевтическими средствами путем конъюгации белковых терапевтических средств с мембраной из поливинилового спирта, отлитой на медицинских устройствах. Конъюгация белковых терапевтических средств обеспечивает локализованную и концентрированную доставку и является экономически эффективным подходом, который требует значительно меньшего количества препарата для дозирования при минимизации побочных эффектов.

Аннотация

Белковые терапевтические средства часто ограничены путем введения и невозможностью ограничить их местом действия. Один из инновационных подходов, который мы разработали, заключается в ковалентном связывании белковых терапевтических средств с медицинскими устройствами, что позволяет более локализовать и высококонцентрировать доставку этих препаратов к месту их предполагаемого действия. Это исследование направлено на то, чтобы оценить, может ли глюкагоноподобный пептид-2 (GLP-2) ковалентно связываться с устройствами для расширения влагалища (VES) и рукава для расширения кишечника (IES) в клинически значимых и измеримых количествах.

Расширительные рукава покрывали поливиниловым спиртом (ПВА) и сшивали парами глутаральдегида/серной кислоты для создания химически активной поверхности, способной связывать аминсодержащие терапевтические средства, такие как GLP-2. Стандартную кривую создавали путем связывания 250 мкг, 100 мкг, 50 мкг, 25 мкг и 0 мкг GLP-2 с покрытыми ПВА лунками 24-луночного планшета. Стандарт ИФА был создан с использованием антитела против GLP-2 кролика, за которым последовало вторичное антитело щелочной фосфатазы IgG против кролика и субстрат микролунок щелочной фосфатазы синей лунки. Колориметрия (от желтого до синего при длине волны 620 нм) была пропорциональна концентрации связанных антител к ГПП-2, что позволило рассчитать связанную концентрацию ГПП-2 на рукавах с покрытием ПВА. Добавление 50 мкг GLP-2 к устройствам IES/VES связывало в среднем 22,69 ± 9,32 мкг/см2 GLP-2 с внешней площадью поверхности IES/VES (9,425см2), что указывает на то, что 44% добавленного GLP-2 было иммобилизовано на рукавах IES/VES с покрытием PVA.

В настоящее время дозировка ГПП-2 для человека составляет 50 мкг/кг. Поскольку каждый рукав содержит 22 мкг, это составляет примерно 44% от системной дозы в одном устройстве. Данная методика позволяет добавлять значительно меньшие дозы терапевтических средств, чтобы получить тот же эффект, что и при системном введении препарата ГПП-2, а также избежать системных эффектов.

Введение

Белковые терапевтические средства, такие как ферменты, антитела, цитокины, гормоны и факторы роста, показали высокую эффективность в лечениинескольких заболеваний. Если мы улучшим наше понимание того, как предоставлять эти терапевтические агенты, мы сможем значительно продвинуть биотехнологию применения этих веществ в качестве лекарств/медицинских методов лечения. Эффективность белковых терапевтических средств ограничена их биораспределением, стоимостью и нецелевыми эффектами. Было опробовано несколько подходов к улучшению фармакокинетики и фармакодинамики белковых терапевтических средств, включая ПЭГилирование, гликозилирование, липидирование и слияние других белков2. «Таргетируемость» является еще одной проблемой, потому что большинство современных белковых терапевтических средств имеют несколько областей действия, что приводит к нецелевым эффектам. В частности, нацеливание этих препаратов на желаемые участки может снизить требуемую терапевтическую дозу и уменьшить побочные эффекты2. Если бы можно было ограничить доставку лекарств в предполагаемую область действия, можно было бы радикально улучшить лечение, а также ограничить нежелательные побочные эффекты этих препаратов.

В настоящее время используется множество медицинских устройств, содержащих терапевтические средства, такие как стенты с лекарственным покрытием и антипролиферативным лекарственным покрытием, содержащим клопидогрел, винкристин и винбластин, которые помогают предотвратить рестеноз и необходимость повторной реваскуляризации после катетеризации сердца3. Кроме того, были созданы биоразлагаемые мочеточниковые стенты с лекарственным покрытием с паклитакселом, доксорубицином, гемцитабином и другими антипролиферативными агентами для лечения уротелиальной карциномы верхних дыхательных путей4. По мере деградации этих стентов противоопухолевые препараты высвобождаются локально контролируемым образом, продлевая доставку лекарства без необходимостидополнительного дозирования. Эта методология позволяет обеспечить долгосрочный эффект противоопухолевых препаратов в предполагаемом месте действия, а также предотвращать необходимость системного воздействия, ограничивая действие препарата на неопухолевые клетки и снижая токсичность препарата. Кроме того, биоразлагаемая природа стента также может предотвратить необходимость процедуры удаления стента4.

Синдром короткой кишки (СКБ) является еще одним заболеванием, при котором использование белковых терапевтических средств показало значительное улучшение у пациентов5. СКК может возникать по различным механизмам, но приводит к недостаточной длине кишечника, вызывая мальабсорбцию и недоедание. Методы лечения, такие как аналоги глюкагоноподобного пептида 2 (GLP-2), могут быть использованы до перехода к хирургическому лечению этого состояния5. ГПП-2 человека, системный гормон питательных пептидов, вырабатывается в дистальном отделе тонкой кишки и толстой кишки эндокринными клетками L-типа. GLP-2 индуцирует пролиферацию клеток крипты кишечника, способствует восстановлению поврежденной слизистой оболочки, ингибирует апоптоз эпителиальных клеток кишечника и улучшает кровоснабжение кишечника5. Аналоги GLP-2, такие как тедуглутид, были одобрены для лечения СКК у пациентов в возрасте 1 года и старше, чтобы помочь усилить естественную адаптацию кишечника6. Естественно, адаптация кишечника может занять годы и приводит к задержке опорожнения желудка для увеличения времени абсорбции и увеличению диаметра за счет расширения кишечника для увеличения площадиповерхности для абсорбции. Аналоги ГПП-2 обладают той же фармакологической активностью, что и природный ГПП-2, при этом имеют более стабильную структуру, что обеспечивает более длительный период полувыведения и более сильное сродство к мишеням5. В настоящее время ежегодная стоимость тедуглютида составляет 295 000 долларов США, а дозировка для пациентов составляет 0,05 мг/кг в день5. Побочные эффекты тедуглютида включают тошноту, рвоту, диарею, боль в животе, потерю веса, желудочно-кишечные полипы и ускоренный рост существующих опухолей5.

Ранее наша лаборатория показала, что использование рукава для расширения кишечника (IES) (Рисунок 1) способно обеспечить немедленное удлинение тонкой кишки ex vivo на 36,2% и удлинение тонкой кишки на 30,2% после одномесячного развертывания in vivo 6,8. Это устройство может стать терапией для пациентов с СБС, что может сократить зависимость от парентерального питания. Возможность биоконъюгации терапевтических средств к устройству IES может еще больше улучшить способность дистракционного энтерогенеза за счет добавления в устройство агониста роста слизистой оболочки кишечника GLP-2. Мембраны из поливинилового спирта (ПВА) представляют собой гидрофильные полимеры, которые можно получить путем растворения ПВС в воде, нанесения ее на структурную основу, а затем сшивания с глутаральдегидом с использованием серной кислоты в качестве катализатора9. Было показано, что эти гидрогелевые наночастицы обладают потенциалом в качестве систем доставки лекарств за счет диффузии лекарств, набухания гидрогелевой матрицы и химической реакционной способности лекарства/матрицы10. ПВА был одобрен FDA для клинического использования у людей благодаря своей превосходной биосовместимости и безопасности11. Полимеризация ПВС приводит к образованию концевых групп, которые обеспечивают биоконъюгацию12.

Устройства IES/VES имеют длину 3 см и площадь внешней поверхности 9,425см2 и способны к литью с помощью мембран ПВА. Эти мембраны PVA могут быть биоконъюгированы с GLP-2 для обеспечения локализованной и концентрированной доставки терапевтических агентов. Снижение необходимой дозы препарата и обход необходимости системного введения, недопущение негативных побочных эффектов лечения. Это может помочь снизить стоимость этих дорогостоящих лекарств, требуя меньшей дозировки, а отсроченный высвобождение препарата может уменьшить частоту дозирования, что еще больше снизит затраты. Покрытие устройства IES GLP-2 может снизить необходимые дозы, сэкономить деньги пациентов, избежать системного введения, предотвратить негативные эффекты лечения и обеспечить непрерывную доставку препарата в целевой участок. В этом отчете оценивается степень, в которой терапевтический белок, такой как GLP-2, может ковалентно связываться с медицинскими устройствами, такими как устройства IES/VES, в физиологически значимых количествах, чтобы обеспечить местную пользу этих препаратов, избегая при этом побочных эффектов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Разделы 1 и 2 завершены одновременно. Нанесение покрытия ПВА и сшивание мембраны ПВА должно производиться одновременно как для расширительных рукавов, так и для 24-луночного планшета. Это позволяет им быть готовыми одновременно к созданию стандартной кривой с 24-луночным планшетом, чтобы использовать абсорбцию для расчета концентрации GLP-2 в каждой гильзе.

1. Создание приборов ИЭС и ВЭС с покрытием GLP-2

  1. Приготовьте 5% раствор ПВА, добавив 5 г ПВС в 100 мл деионизированной воды. Чтобы раствориться, подумайте о том, чтобы помешивать на горячей плите. Затем приготовьте раствор GLP-2 в дозе 1 мг/мл, добавив 1 мг GLP-2 в 1 мл деионизированной воды.
  2. Предварительно сократите рукава для расширения кишечника и вагинальные рукава над стеклянной пипеткой, стабилизируя концы с помощью пластиковых пипеток, обрезанных так, чтобы они плотно прилегали к стеклянной пипетке вокруг предварительно сжатых рукавов.
  3. Покрасьте предварительно стянутые рукава готовым 5% ПВА с помощью маленькой кисти. После покраски слоя ПВА дайте рукавам высохнуть при комнатной температуре (RT) в течение 10 минут, затем нанесите еще один слой, в общей сложности 5 слоев ПВА на каждом рукаве.
  4. После того,как 5-й слой высохнет, поместите предварительно сжатые рукава в эксикатор под химическим защитным колпаком, чтобы они могли сшиваться на RT. Начните сшивку, добавив 3 мл 25% глутаральдегида и 3 мл 94%-98% серной кислоты для разделения открытых стаканов в эксикаторе для реакции паров и сшивания мембран ПВА на рукавах.
  5. После сшивания рукавов в камере в течение 48 часов выньте их из камеры и дайте глутаральдегиду испариться с рукавов в течение 15 минут.
  6. Затем добавьте 50 мкл раствора GLP-2 в дозе 1 мг/мл, тщательно нанеся пипетированием на каждую гильзу. Дайте ему высохнуть в течение 30 минут при температурной терапии, прежде чем снять предварительно сжатые гильзы со стеклянной пипетки и добавить каждую гильзу в соответствующую лунку на 24-луночном планшете.

2. Создание 24-луночного планшета с покрытием GLP-2

  1. Чтобы сделать стандартную кривую ГПП-2 связанной с ПВА, пипетируйте 50 мкл 5% ПВС на дно 18 предназначенных для использования лунок 24-луночного планшета. Оставьте пустыми 6 лунок для удержания устройств IES и VES (по 3 для каждого типа устройств).
  2. Дайте слою ПВА высохнуть на 24-луночной пластине в течение ночи в духовке при температуре 120 °C.
  3. Поместите 24-луночный планшет в эксикатор под химическим защитным колпаком, чтобы позволить ПВА сшиваться в течение 48 часов при RT. Начните сшивку, добавив 3 мл 25% глутаральдегида и 3 мл 94%-98% серной кислоты для разделения открытых стаканов, чтобы пары могли вступать в реакцию внутри камеры и сшивать ПВС с 24-луночным планшетом.
  4. После сшивания в течение 48 часов извлеките 24-луночный планшет из камеры и дайте глутаральдегиду испариться с планшета в течение 15 минут.
  5. Затем сделайте градиент концентрации, добавив 250 μл, 100 μл, 50 μл, 25 μл и 0 μл раствора GLP-2 1 мг/мл в их меченые лунки, создав 24-луночный планшет с 3 лунками для каждой концентрации GLP-2 (250 мкг, 100 мкг, 50 мкг, 25 мкг и 0 мкг) и 3 лунками для каждого типа рукава (IES и VES).

3. Создание стандартной кривой и различающей концентрации втулки ГПП-2

  1. После того, как соответствующие разведения GLP-2 добавлены в лунки и в лунки добавлены рукава с лекарственным покрытием, охладите планшет на ночь при температуре 4 °C, чтобы обеспечить связывание лекарственного средства.
  2. На следующий день добавьте 2 мл 1 мг/мл сухого молока в деионизированный водоблокирующий раствор в каждую лунку на 1 ч. После блокировки промойте каждую лунку 3 раза PBS в течение 5 минут после каждой промывки.
  3. Приготовьте раствор антитела к ГПП-2 у кролика, добавив 40 мкл антитела против ГПП-2 кролика в 50 мл деионизированной воды. Затем добавьте 2 мл раствора антитела GLP-2 кролика в каждую лунку на 24-луночном планшете и поставьте в холодильник на ночь при температуре 4 °C.
  4. После первичной инкубации антител промойте каждую лунку еще 3 раза PBS в течение 5 минут после каждой промывки. Получите щелочную фосфатазу IgG против кроликов, полученную в растворе вторичного антитела козы, добавив 20 мл вторичного антитела в 40 мл деионизированной воды. Затем добавьте 2 мл раствора вторичного антитела в каждую лунку и оставьте на 2 ч в режиме ЛТ.
  5. Аспирируйте вторичный раствор антител и промойте каждую лунку еще 3 раза PBS в течение 5 минут каждая. Затем добавьте щелочную фосфатазу синего микролуночного субстрата в каждую лунку.
  6. Дайте щелочной фосфатазе, конъюгированной вторичному антителу, вступить в реакцию с субстратом в течение 20 мин при ЛТ. По мере развития реакции следите за тем, чтобы цвет раствора менялся с желтого на синий.
  7. Остановите реакцию, пипетируя по 200 мкл раствора из каждой лунки и поместите его в 96-луночный планшет, помеченный так же, как и 24-луночный планшет. Как только реагент будет удален из 24-луночного планшета с мембраной ПВА, сопряженной с ферментом щелочной фосфатазой, реакция остановится, а цвет не изменится.
  8. Считывание показаний 96-луночного планшета с помощью абсорбционного микропланшетного ридера на длине волны 620 нм для построения стандартной кривой и расчета концентрации GLP-2 на гильзах с покрытием PVA.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этом протоколе описывается нанесение покрытия и сшивание устройств IES и VES с PVA для обеспечения сопряжения GLP-2. На рисунке 2 показана стандартная кривая, построенная для определения концентрации GLP-2 на каждом устройстве. На рисунке 3 показана концентрация GLP-2 каждого устройства IES и VES, а также концентрация скважин, используемых для стандартной кривой. Гильзы имели среднюю концентрацию ГПП-2 22,69 ± 9,32 мкг/см2, что соответств...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мы представляем здесь методологию связывания белковых терапевтических средств, таких как GLP-2, с медицинскими устройствами с покрытием PVA и поперечными сшитыми системами. Концентрацию связанного ГПП-2 определяли путем создания стандартной кривой концентрации ГПП-2 на 24-луночных планшетах с покрытием ПВА путем добавления антитела к ГПП-2 кролика, щелочной фосфатазы IgG козы и субстрата микролунок щелочной фосфатазы синего. Вторичное антитело, конъюгированное с ферментом щелочной фосфат...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Джонатан Стивен Александер и Кристен Бойер владеют патентом US10537659B2 на медицинские устройства и методы активации, напечатанные на 3D-принтере из поливинилового спирта (2017). Остальным авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование финансировалось Р. Китом Уайтом, доктором медицины, через Фонд кафедры хирургии Джона С. Макдональда, У. Ридом Граймсом, доктором медицины, для финансирования через Фонд профессорства кафедры хирургии Уитни Боггс и грант LSU LIFT2, HSCS-2022-LIFT-002.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Anti-Rabbit IgG (цельная молекула) Антитела к пероксидазе производятся в козахSigma-AldrichA0545-1ML
BluePhos Microwell Substrate KitSera Care5120-0059
GenClone 25-107, 24-луночные клеточные культуральные планшеты плоское дно, обработанные TC, 100 планшетов/единицуGenesee Scientific 25-107
GLP-2 Рекомбинантное моноклональное антитело кролика (3K3P5)Invitrogen MA5-42869
Глюкагоноподобный пептид-2 (GLP-2) (1-33), крысаEchelon Biosciences195262-56-7
Глутаральдегид, 25% водный растворSigma-Aldrich111-30-8
Nalgene Полипропиленовый влагопоглотитель с запорным краномThermoFisher Scientific5310-0250
Поли(виниловый спирт)Sigma-Aldrich9002-89-5
Серная кислота (марка TraceMetal), Fisher ChemicalFischer ScientificA510-P212

Ссылки

  1. Conner, K. P., Devanaboyina, S. C., Thomas, V. A., Rock, D. A. The biodistribution of therapeutic proteins: Mechanism, implications for pharmacokinetics, and methods of evaluation. Pharmacol Ther. 212, 107574(2020).
  2. Ebrahimi, S. B., Samanta, D. Engineering protein-based therapeutics through structural and chemical design. Nat Commun. 14 (1), 2411(2023).
  3. Senst, B., Goyal, A., Basit, H., Borger, J. Drug Eluting Stent Compounds. , StatPearls Pubs. Treasure Island, FL. (2024).
  4. Shan, H., et al. Advances in drug delivery via biodegradable ureteral stent for the treatment of upper tract urothelial carcinoma. Front Pharmacol. 11, 224(2020).
  5. Zhu, C., Li, Y. An updated overview of glucagon-like peptide-2 analog trophic therapy for short bowel syndrome in adults. J Int Med Res. 50 (3), 3000605221086145(2022).
  6. Clayton, S., et al. Self-expanding intestinal expansion sleeves (IES) for short gut syndrome. Pediatr Surg Int. 38 (1), 75-81 (2022).
  7. Rosete, B. E., Wendel, D., Horslen, S. P. Teduglutide for pediatric short bowel syndrome patients. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 15 (7), 727-733 (2021).
  8. Novel Intestinal Expansion Sleeve (IES): promoting distraction enterogenesis in a live animal model. Colvin, J. C., et al. 39th Southern Biomedical Engineering Conference, , (2023).
  9. Kim, K. J., Lee, S. B., Han, N. W. Kinetics of crosslinking reaction of PVA membrane with glutaraldehyde. Korean J Chem Eng. 11 (1), 41-47 (1994).
  10. Hamidi, M., Azadi, A., Rafiei, P. Hydrogel nanoparticles in drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 60 (15), 1638-1649 (2008).
  11. Chong, S. F., Smith, A. A., Zelikin, A. N. Microstructured, functional PVA hydrogels through bioconjugation with oligopeptides under physiological conditions. Small. 9 (6), 942-950 (2013).
  12. Jensen, B. E., Dávila, I., Zelikin, A. N. Poly(vinyl alcohol) physical hydrogels: Matrix-mediated drug delivery using spontaneously eroding substrate. J Phys Chem B. 120 (26), 5916-5926 (2016).
  13. Teduglutide for short bowel syndrome. Aust Prescr. 43 (2), 72-73 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Покрытие из поливинилового спиртапрепараты на основе белковглюкагоноподобный пептид-2экспанзионные стент-графтыковалентное связывание лекарственного веществаколориметрический ИФАреакция сшиваниялокальная доставка лекарствпокрытие медицинских изделий
Валидация конъюгации терапевтического агента с медицинскими изделиями, покрытыми поливиниловым спиртом
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.