Методическая статья

Анализ сфероидной инвазии сфероидов между макрофагами и опухолями

1.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67374

⸱

24 января 2025 г.

 , 
1Institute for Medical Microbiology, Virology and Hygiene, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

В этой статье

Краткое содержание

В данной работе мы представляем протокол исследования взаимодействия первичных макрофагов, полученных из моноцитов человека, с опухолевым сфероидом в трехмерной (3D) матрице коллагена I, с возможностью сравнения влияния растворимых и физических свойств микроокружения на клеточную инвазию.

Аннотация

Взаимодействие иммунных и раковых клеток и их соответствующее влияние на метастазирование представляет собой важный аспект исследований рака. До сих пор доступно только несколько протоколов, которые позволяют in vitro аппроксимировать ситуацию in vivo . В данной работе мы представляем новый подход к наблюдению за влиянием макрофагов человека на инвазивность раковых клеток с использованием опухолевых сфероидов немелкоклеточной карциномы легкого H1299, встроенных в трехмерную (3D) матрицу коллагена I. С помощью этой схемы совместного культивирования мы проверили влияние истощения регуляторных факторов в макрофагах на основе малой интерферирующей РНК (миРНК) на 3D-инвазию раковых клеток из сфероида опухоли по сравнению с контрольной группой. Этот метод позволяет определить различные параметры, такие как площадь сфероида или количество вторгшихся раковых клеток, и, таким образом, обнаружить различия в инвазии раковых клеток. В этой статье мы представим соответствующую установку, обсудим последующий анализ, а также преимущества и потенциальные подводные камни этого метода.

Введение

Макрофаги являются важной частью врожденной иммунной системы и представляют собой первую линию защиты при многих патологических состояниях, таких как инфекции или очистка клеток от остатков после травм. В течение последних десятилетий влияние иммунных клеток на прогрессирование рака было одним из аспектов многих исследований. Соответственно, было показано, что макрофаги могут способствовать метастазированию, связываясь с первичными опухолями и становясь опухолеассоциированными макрофагами (ТАМ)2. Макрофаги могут изменять свой профиль экспрессии при контакте с раковыми клетками, способствуя удалению метастазирования отиммунной системы. Кроме того, было показано, что раковые клетки могут использовать дефекты во внеклеточном матриксе (ВКМ), генерируемые макрофагами, чтобы убежать от первичной опухоли, и что их поведением также манипулирует поглощение секретируемых факторов, включая внеклеточные везикулы (ВВ)4,5. Это взаимодействие физических и химических аспектов требует разработки новых методов для характеристики влияния иммунных клеток на распространение опухоли и окружающее микроокружение.

Были разработаны различные подходы к изучению поведения иммунных клеток в контексте метастазирования in vivo6. Однако, как и для всех экспериментов, включая животных, необходима лицензия на испытания на животных и помещение для животных; Эти подходы уже требуют большого развития и подготовки. Кроме того, анализ часто бывает сложным, особенно в отношении визуализации живых клеток, поскольку не все образцы доступны для большинства микроскопических установок. Разработка новых методов проверки гипотез в первых квалифицированных условиях in vitro также необходима и своевременна, поскольку наука и общество стремятся к исследованиям без животных, чтобы уменьшить количество приносимых в жертву животных.

В недавней публикации7 мы исследовали влияние первичных макрофагов человека на инвазивность вторгающихся раковых клеток из опухолевого сфероида. С этой целью мы создали анализ коинвазии сфероидов из макрофагов и опухолей на основе коллагена I. В этом контексте мы стремились выяснить роль быстрых путей рециркуляции мембранной матриксной металлопротеиназы 1-го типа (MT1-MMP) в макрофагах. Мы протестировали макрофаги, которые были истощены сверхпроцессивным кинезином KIF16B, который мы определили как основной фактор рециркуляции MT1-MMP, и их влияние на инвазивные способности клеток H1299-зеленого флуоресцентного белка (GFP) из твердого сфероида. Истощенные KIF16B макрофаги демонстрируют сниженные уровни мембраносвязанного MT1-MMP на своей поверхности, в то время как сами клетки H1299 не подвергались лечению.

Насколько нам известно, не было описано аналогичного метода, позволяющего получить полную визуализацию и анализ коинвазии макрофагов-опухолей-сфероидов. Несмотря на то, что в нашей недавней публикации7 мы сосредоточились на анализе индивидуально мигрирующих клеток, удаленных от сфероида, этот анализ позволяет провести множество дальнейших исследований, таких как количество вторгшихся нитей, белки, участвующие во взаимодействии раковых клеток и макрофагов, степень деградации коллагена I или другие свойства сфероида, такие как длина его периметра.

Протокол

Этот протокол предполагает использование первичных макрофагов человека, полученных из образцов донорской крови. В соответствии с этическими принципами Университетской клиники Гамбург-Эппендорф, были собраны образцы крови, а донорам была выплачена компенсация. Дальнейшая обработка образцов проводилась в соответствии с указаниями по технике безопасности (например, обработка непроверенных образцов). Работа с первичными человеческими макрофагами в этом исследовании была признана неоспоримой Ärztekammer Hamburg, Германия.

1. Генерация опухолевых сфероидов H1299 в бескаркасном доступе (за 3 дня)

  1. Культивировать раковые клетки в инкубаторе с температурой 37 °C с 5% CO2 в колбахдля клеточных культур размером 25 см 2 (см. Таблицу материалов) со средой для раковых клеток (модифицированная среда Дульбекко [DMEM] + 1% пенициллин-стрептомицин [pen-strep] + 10% фетальная бычья сыворотка [FBS] + 0,1 мМ заменимые аминокислоты + 2 мМ L-глутамин) до 80% конфлюенции.
  2. Промойте клетки один раз фосфатно-солевым буфером Дульбекко (DPBS) и отделите их, добавив 1 мл трипсина-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (0,25%, фенол-красный) в течение 2 минут. Остановите ферментативную реакцию, добавив 2 мл среды раковых клеток, и проверьте отслоение под световым микроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы раковые клетки были разделены и чтобы не было кластеров раковых клеток.
  3. Перенесите клеточную суспензию в реакционную пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при температуре 245 x g в течение 5 минут. После этого удалите раствор трипсина с помощью пипетирования или с помощью насоса, затем промойте гранулы, добавив 5 мл DPBS, и снова центрифугируйте их в тех же условиях.
  4. Ресуспендируйте гранулу в 5 мл раковой клеточной среды и подсчитайте клетки, например, с помощью камеры Нейбауэра. Перенесите 8000 клеток H1299-GFP в 96-луночный планшет со сверхнизкой адгезией (см. Таблицу материалов) в конечном объеме 25 мкл среды раковых клеток.
  5. Инкубировать камеру в течение 3 суток в инкубаторе при температуре 37 °C и 5%СО2. Проверьте сфероиды под микроскопом на однородность. Не стоит рассматривать сфероиды с меньшей плотностью или неприкрепленные отдельные раковые клетки для дальнейших экспериментов.

2. Получение первичных макрофагов человека из образцов крови донора

  1. Если образцы донорской крови не используются для выделения клеток сразу, храните их при температуре 4 °C, встряхивая.
  2. Перенесите 20 мл крови из пакета для переливания в реакционную пробирку объемом 50 мл.
  3. Затем подготовьте новую пробирку объемом 50 мл и добавьте 15 мл среды для разделения лимфоцитов (LSM).
  4. Осторожно добавьте 20 мл крови в каждую пробирку, содержащую LSM, не смешивая, и центрифугируйте при 450 x g в течение 30 минут при 4 °C.
  5. Тем временем приготовьте новую пробирку объемом 50 мл и добавьте 10 мл холодной среды Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640.
  6. После центрифугирования переложите плотную белую фазу («охристую шерсть») из содержащей кровь пробирки в подготовленную пробирку, содержащую RPMI, и добавьте объем до 50 мл с помощью холодного RPMI.
  7. Центрифугируйте суспензию при 450 x g в течение 10 минут при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость.
  8. Ресуспендируйте клетки в 10 мл холодного RPMI.
  9. Снова центрифугируйте смесь при 450 x g в течение 10 минут при 4 °C, выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 50 мл RPMI.
  10. Снова центрифугируйте образец при 450 x g в течение 10 мин при 4 °C, выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1,5 мл холодного буфера для моноцитов (0,5% сывороточного альбумина человека + 5 мМ ЭДТА в 25 мл DPBS).
  11. Положите клеточную суспензию на лед, добавьте 250 μл микрогранул анти-CD14 и инкубируйте в течение 15 минут на льду.
  12. Подготовьте разделительную колонку, добавив фильтр на магнитный сепаратор, и добавьте 900 мкл моноцитарного буфера для уравновешивания.
  13. Вылейте суспензию ячеек на фильтр и дайте ей течь в сточную трубу под действием силы тяжести.
  14. Промойте колонку, в которой находятся клетки, связанные с магнитными шариками, добавив 1 мл моноцитарного буфера.
  15. Приготовьте свежую пробирку объемом 50 мл, содержащую 20 мл RPMI, и установите пробирку для отходов под колонкой.
  16. Добавьте в колонку 3 мл моноцитарного буфера, снимите его с магнитной стойки и прикрепите штамп.
  17. Вдавите клетки в подготовленную пробирку объемом 50 мл и заполните ее объемом до 30 мл с помощью RPMI.
  18. Подсчитайте клетки (например, с помощью счетной камеры Нейбауэра) под световым микроскопом и отрегулируйте количество клеток, добавив RPMI к 2 x 106 клеток/мл.
  19. Высейте по 1 мл клеточной суспензии в каждую лунку 6-луночной камеры и инкубируйте планшет в течение 2-4 ч при 37 °С и 5%СО2.
  20. Проверьте, правильно ли прилипли клетки, и замените RPMI на 1,5 мл мономедии (20% сыворотки крови человека + 1% пен-стрептококка в RPMI).
  21. Смените среду после 24 ч инкубации. В этих условиях моноциты дифференцируются в макрофаги в течение 6 дней.

3. Подготовка макрофагов

  1. В день эксперимента отделите макрофаги с помощью соответствующего количества аккутазы для конкретных условий культивирования. Например, используйте 500 мкл аккутазы, если клетки засеяны в 6-луночную чашку. Инкубируйте клетки около 40 минут в растворе, промойте их один раз 2 мл DPBS и подсчитайте с помощью камеры Нейбауэра.
  2. Для одного сфероида развести желаемое количество макрофагов в 40 мкл коллагена I (2,5 мг/мл коллагена I крысиного хвоста) и перемешать их, кратковременно вортексируя реакционную трубку. В проведенных экспериментах 200 000 клеток/мл показали обнаруживаемую разницу при инвазии раковых клеток. Держите смесь коллагена и клеток на льду, так как при комнатной температуре (RT) она начнет быстро полимеризоваться.

4. Постановка анализа на совместную инвазию

ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от формата камеры визуализации, цели анализа или соответствующей установки визуализации, может потребоваться перенос сфероида опухоли с пластины со сверхнизкой адгезией и адаптация значений коллагена и среды. Следующие шаги описывают настройку для одного образца в 15-луночном μ-слайде.

  1. Сначала промойте сфероид, добавив 300 μл DPBS. Отрежьте кончик синего наконечника пипетки объемом 1 мл и возьмитесь за сфероид с помощью DPBS. После того, как аспирация сфероида осядет в наконечнике, кратковременно протолкните пипетку на дно камеры визуализации для переноса опухоли-сфероида за счет поверхностного натяжения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно отметить, что трение на неизмененных кончиках может нарушить целостность сфероида.
  2. Удалите остатки DPBS, перенесенные со сфероидом, насколько это возможно, с помощью пипетирования.
  3. Быстро добавьте 40 мкл смеси коллагена I/макрофагов (см. шаг 3.4) в камеру визуализации, содержащую сфероид H1299-GFP.
  4. Перенесите планшет в клеточный инкубатор и инкубируйте его в течение 30 минут при 37 °C и 5%CO2 во влажных условиях для полной полимеризации коллагеновой смеси.
  5. После полимеризации осторожно добавьте в каждую лунку по 25 мкл среды для раковых клеток и инкубируйте планшет в течение 3 дней в инкубаторе в ранее описанных условиях. При необходимости визуализируйте живой образец с помощью лазерного сканирующего микроскопа в нужные моменты времени.

5. Дополнительная фиксация и окрашивание

  1. Для проведения иммунофлуоресцентного окрашивания необходимо зафиксировать макрофаги и сфероиды H1299-GFP в матриксе коллагена I. Сначала осторожно удалите надосадочную жидкость из каждого образца с помощью насоса, не касаясь матрицы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во избежание разрушения образца надосадочная жидкость также может быть удалена с помощью ручного пипетирования без использования насоса.
  2. Добавьте в каждую лунку по 50 мкл 3,7% формальдегида, содержащегося в DPBS, и инкубируйте образцы в течение 5 минут на льду. После этого удалите фиксирующий раствор и снова добавьте в него 50 μл свежего фиксирующего раствора. Этот шаг важен для достижения более равномерного уровня формальдегида в скважине. Инкубируйте образцы в течение ночи при температуре 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от количества коллагена, которое я смешиваю, время инкубации может увеличиться до нескольких часов.
  3. Снимите фиксатор на следующий день и промойте образцы путем повторного удаления не менее двух раз DPBS в зависимости от объема камеры визуализации. Кратковременно инкубируйте их в течение 5 минут на льду в шейкере, прежде чем удалить DPBS с помощью пипетирования. Теперь образцы готовы к окрашиванию.
  4. Окрашивайте образцы смесью 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в соотношении 1:100 (1 мг/мл, для окрашивания ядер) и фаллоидина 568 (для окрашивания F-актина) в DPBS в течение не менее 30 минут и дважды промойте их DPBS перед визуализацией.

6. Визуализация и анализ различных параметров опухолевого роста

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги могут быть выполнены для фиксированных образцов визуализации живых клеток.

  1. Для наблюдения за опухолью-сфероидом используйте инвертированный лазерный сканирующий микроскоп, оснащенный 10-кратным объективом, который позволяет визуализировать z-стек примерно нижней трети сфероида.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за толщины образца также может быть полезен 2-фотонный микроскоп. Для оптимальной идентификации отдельных клеток может потребоваться более высокая мощность лазера и время экспозиции.
  2. После приобретения объедините стеки по z-проекции с помощью программы Fiji, которая является программным обеспечением ImageJ (Fiji). Кроме того, обработайте результирующий канал сигнала H1299-GFP, применив автоматический порог (например, автоматический порог Huang), и удалите остаточный шум путем удаления пятен с изображения в зависимости от количества фона и интенсивности сигнала.
  3. Измерьте параметры сфероида с помощью Fiji.
    1. Площадь: Измерьте размер сфероида с помощью инструмента « Палочка ».
    2. Периметр: Включите Периметр в настройки измерения.
    3. Диаметр: Включите диаметр Ферета в настройки измерения.
    4. Круговость: Включите дескрипторы формы в настройки измерения.
  4. Измерьте параметры отдельных раковых клеток с помощью Фиджи.
    1. Измерьте количество вторгшихся клеток.
      1. Выберите центральный сфероид с помощью инструмента Палочка и удалите сигнал. Это позволит удалить сфероид, а также все связанные с ним сигналы клеток, которые еще прикреплены к сфероиду.
      2. После этого используйте инструмент «Анализ частиц» или количественно оцените все остаточные отдельные сигналы.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Результатом будет количество вторгшихся раковых клеток. Кроме того, результат может также показать репрезентативную область, покрытую раковыми клетками, и быть интерпретирован как коллективная инвазия или инвазия одиночных клеток, в зависимости от размера области. Для дальнейшей проверки количества вторгшихся раковых клеток маска из анализируемых частиц может быть наложена над каналом DAPI и подсчитаны ядра.
  5. Далее оцените результаты с помощью статистической программы, такой как GraphPad Prism или Microsoft Excel.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол показал свою надежность и гибкость. Он использовался в нашей лаборатории более 50 раз, всегда с первичными человеческими макрофагами как минимум от 3 доноров, чтобы учесть вариабельность доноров. В его нынешнем виде было показано, что протокол приводит к успеху на уровне 90-95%. Однако, поскольку установка сложна, различные результаты также могут быть результатом, поскольку взаимодействие макрофагов для каждого сфероида индивидуально. Таким образом, для получения статистически значимого результата предлагается провести эксперимент не менее 3 раз с 5 сфероидами.

Результаты

На рисунке 1 показан сфероид H1299-GFP, полученный в соответствующие дни инкубации в матриксе коллагена I. Соответствующее светлопольное изображение, сделанное в день 0, также показывает первичные человеческие макрофаги, сокультурные со сфероидом. Репрезентативное изображение, записанное на 3-й день эксперимента, увеличивается после обработки. Указываются различные параметры, которые могут быть проанализированы, в том числе количество вторгшихся ячеек, места коллективной инвазии и периметр сфероида. В прилагаемой таблице показаны результаты, полученные с помощью этого изображения. Количество обнаруженных сигналов соответствует визуальному впечатлению. Никаких нарушений работы центрального сфероида не видно, что указывает на фактическую инвазию отдельных раковых клеток, а не на клетки, полученные из обломков сфероида. Результаты различных сфероидов и состояний теперь можно сравнивать с помощью статистического анализа.

figure-results-1
Рисунок 1: Репрезентативные результаты. (Верхняя панель) Сфероид H1299-GFP изображен в день 0, день 1, день 2 и день 3 инкубации в матриксе коллагена I. (Средняя левая панель) Светлопольное изображение сфероида, показывающее кокультурные первичные макрофаги человека. (Средняя правая панель) Репрезентативное изображение, полученное на 3-й день, увеличенное после обработки, показывающее различные параметры, которые могут быть проанализированы (периметр сфероида выделен красным цветом; обведен вручную для лучшей визуализации). (Нижняя панель) Результаты получены из изображения на средней правой панели. Примечание: Макрофаги не видны, так как для выяснения поведения раковых клеток был записан только канал GFP. Масштабные линейки: 100 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Инвазия раковых клеток остается важной, но недостаточно изученной темой в контексте совместного вторжения иммунных клеток, таких как макрофаги. Коллективная и индивидуальная инвазия раковых клеток является критическим процессом во время метастазирования и, как было показано, снижает выживаемость онкологических больных из-за множественности инвазий различных органов 8,9. Исследования in vivo являются сложными и проводятся только в лабораториях с доступом к помещениям для содержания животных. Более того, также сложно контролировать условия in vivo или специально манипулировать отдельными аспектами. Таким образом, потребность в более доступной системе остается важной для ответа на основные вопросы первого направления исследований.

С помощью представленного здесь метода мы разработали способ, с помощью которого можно дополнительно проанализировать i) иммунную клетку и ii) поведение раковой клетки, iii) рост и развитие твердого сфероида и iv) влияние клеток в окружающем опухолевом микроокружении (TME) на компоненты ECM. Он может быть использован для сравнения влияния модифицированных (например, истощенных до специфических регуляторов обработкой миРНК) макрофагов на инвазивность отдельных раковых клеток из твердого сфероида. Является ли физическая перестройка ТМЭ или секретируемые факторы основной причиной наблюдаемого поведения раковых клеток, в настоящее время неясно и нуждается в более подробном анализе.

Кроме того, можно манипулировать самими раковыми клетками, например, путем лечения миРНК или нокаутирования специфических регуляторов. Кроме того, анализ может быть улучшен путем сравнения количества подсчитанных ядер в идентифицированном клеточном профиле, что позволяет более точно определить инвазивные раковые клетки.

Мы использовали этот анализ для определения влияния макрофагов в ТМЭ на инвазию опухолевых клеток. Однако следует также отметить, что опухолевые клетки, вероятно, влияют на активность макрофагов, возможно, через секретируемые факторы в среде. Таким образом, также было бы целесообразно выявить изменения в макрофагах, такие как измененный поляризационный статус (M1 против M2) путем иммунофлуоресцентного окрашивания с использованием соответствующих антител. В прошлом сравнение между клетками, растущими в монослоях, и клетками, культивируемыми в 3D-среде, показало значительные различия в профилях их экспрессии.

Кроме того, поучительной может быть сортировка флуоресцентно-активируемых клеток (FACS) субпопуляций макрофагов и их интеграция в экспериментальную процедуру. И последнее, но не менее важное: более детальная визуализация контактных областей, где макрофаги взаимодействуют с раковыми клетками или сфероидальной поверхностью опухоли, может привести к выявлению дальнейших механизмов, имеющих отношение к 3D-инвазии и взаимодействию.

Следует отметить, что нельзя полностью контролировать точное позиционирование сфероида в центре лунки после добавления коллаген-смеси. Количество коллагена под сфероидом особенно трудно регулировать. Здесь были разработаны другие методы, позволяющие точно позиционировать сфероид, например, на вершине агарозных форм с большим номеромобразца 11. Однако, поскольку высвобождение цитокинов является общим механизмом, все сфероиды в этом многосфероидном анализе подвергаются воздействию секретируемых факторов, и количество иммунных клеток, действующих на один сфероид, трудно контролировать.

Одним из основных ограничений этого протокола является способность линий раковых клеток образовывать однородные сфероиды, таким образом, он применим только к подмножеству клеточных линий. Например, клетки меланомы MeWo образуют неровные, листовые 3D-структуры, но не имеют однородных сфероидов.

Следует также отметить, что анализ обладает высокой адаптивностью, так как многие его характеристики могут быть изменены, например, материал ВКМ, количество клеток или путем добавления специфических факторов, таких как цитокины, в надосадочную жидкость. Таким образом, он должен быть очень подходящим для первоначальных исследований in vitro взаимодействия раковой клетки с иммунной клеткой и может быть адаптирован к конкретному исследовательскому вопросу, который в настоящее время рассматривается.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Андреа Мордхорст за отличную техническую поддержку и культивирование клеток, а также Мартина Апфельбахера за постоянную поддержку. Работа по изучению инвазии макрофагов в лаборатории SL проводится при поддержке Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC877/B13; LI925/13-1).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
15 &микро;-Горка Ангиогенез ibidi81506
AccutaseInvitrogen00-4555-56
Alexa Fluor 568 Phalloidin ThermoFisher ScientificA12380
CD14 МикрошарикиMiltenyi Biotec130-050-201
CO2Инкубатор Связующее Коллаген
I Крысиный хвост Corning354236
DAPIAppliChem
DMEM (1x) + GlutaMAXGibco31966-021
DPBSAnprotecMS01Y71003
FBSBio& КлеткаFBS. S 0613
Фиджи NIHImageJ 2 Версия: 2.3.0/1.53s
Формальдегид 37% 252549-500млSigma-Aldrich
H1299-GFP клеточная линия
Альбумин сыворотки крови человекаSigma-AldrichA5843
Leica TCS SP8 XLeica
l-глютамин Gibco25030-024
Среда для разделения лимфоцитов (LSM) 1077PromoCellC-44010
MS колонкиMiltenyi Biotec130-042-201
заменимые аминокислоты Sigma-Aldrich11140050
Pen StrepGibco15140-122
RPMI-1640 Gibco81275-034
TC-Platte 96 скважина, BIOFLOAT, R SARSTEDT83,39,25,400
VORTEX-GENE 2 Научные отрасли

Ссылки

  1. Lendeckel, U., Venz, S., Wolke, C. Macrophages: shapes and functions. ChemTexts. 8 (2), 12(2022).
  2. Dallavalasa, S., et al. The role of tumor associated macrophages (TAMs) in cancer progression, chemoresistance, angiogenesis and metastasis - Current status. Curr Med Chem. 28 (39), 8203-8236 (2021).
  3. Pan, Y., Yu, Y., Wang, X., Zhang, T. Tumor-associated macrophages in tumor immunity. Front Immunol. 11, 583084(2020).
  4. Boutilier, A. J., Elsawa, S. F. Macrophage Polarization States in the Tumor Microenvironment. Int J Mol Sci. 22 (13), 6995(2021).
  5. Wenzel, E. M., et al. Intercellular transfer of cancer cell invasiveness via endosome-mediated protease shedding. Nat Commun. 15 (1), 1277(2024).
  6. Anfray, C., Ummarino, A., Calvo, A., Allavena, P., Torres Andon, F. In vivo analysis of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment. Methods Mol Biol. 2614, 93-108 (2023).
  7. Hey, S., Wiesner, C., Barcelona, B., Linder, S. KIF16B drives MT1-MMP recycling in macrophages and promotes co-invasion of cancer cells. Life Sci Alliance. 6 (11), e202302158(2023).
  8. Wu, J. S., et al. Plasticity of cancer cell invasion: Patterns and mechanisms. Transl Oncol. 14 (1), 100899(2021).
  9. Shi, X., et al. Mechanism insights and therapeutic intervention of tumor metastasis: latest developments and perspectives. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 192(2024).
  10. Li, G. N., Livi, L. L., Gourd, C. M., Deweerd, E. S., Hoffman-Kim, D. Genomic and morphological changes of neuroblastoma cells in response to three-dimensional matrices. Tissue Eng. 13 (5), 1035-1047 (2007).
  11. Lin, Y. N., et al. Monitoring cancer cell invasion and T-cell cytotoxicity in 3D culture. J Vis Exp. 160, e61392(2020).

Перепечатки и разрешения

Теги

Инвазия опухолевых сфероидовтрехмерный коллагеновый матриксинвазия раковых клетокдеплеция макрофаговмалые интерферирующие РНКпервичные макрофаги человекалазерная сканирующая микроскопиякокультивирование клеток
Анализ сфероидной инвазии сфероидов между макрофагами и опухолями
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.