В протоколе показан метод, основанный на проточной цитометрии с использованием химии для изучения энергетического метаболизма в клетках.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
В протоколе показан метод, основанный на проточной цитометрии с использованием химии для изучения энергетического метаболизма в клетках.
При стимуляции антигеном наивные Т-клетки подвергаются быстрой пролиферации и экспансии в эффекторные Т-клетки. Метаболизм играет важную роль в образовании биомассы, необходимой для этих быстро размножающихся клеток, а также для генерации молекул, необходимых для дифференцировки и функционирования эффекторных Т-клеток, которые влияют на исход адаптивного иммунного ответа при инфекции или раке. Наивные Т-клетки перепрограммируют свой метаболизм при антигенной стимуляции для увеличения выработки АТФ, которая необходима для поддержания их роста, биосинтеза и эффекторных функций. АТФ может образовываться в клетке либо путем митохондриально-окислительного фосфорилирования (OXPHOS), либо гликолитическим путем. Поскольку большая часть АТФ, образующейся в делящейся, растущей клетке, используется для синтеза белков, синтез белка используется в качестве суррогата уровней АТФ. Синтез белка может быть измерен путем включения пуромицина, который имитирует 3'-аденозин тРНК, заряженной модифицированным тирозином, и приводит к спонтанному прекращению трансляции белка. Метаболические ингибиторы, такие как 2-дезоксиглюкоза (2DG), которая блокирует гликолитический путь, и олигомицин (O), который блокирует комплекс 5 электронно-транспортной цепи (ETC), могут быть использованы для изучения зависимости клеточной генерации АТФ от этих двух путей в сочетании с оценкой синтеза белка в методе, называемом SCENITH. Здесь мы опишем вариант этого метода, который обнаруживает включение пуромицина с помощью проточной цитометрии с использованием химии. Этот метод изучения метаболизма относительно прост и может быть использован для оценки популяций редких клеток, а также образцов пациентов с помощью проточной цитометрии.
В последние годы растет понимание важной роли метаболизма в регуляции Т-клеток. Клеточный метаболизм регулирует многие важнейшие функции лимфоцитов, включая клональную экспансию патоген-специфичных Т-клеток и их дифференцировку в субпопуляции эффекторных клеток, которые синтезируют различные эффекторные молекулы, включая воспалительные цитокины и цитолитические гранзимы, необходимые для уничтожения патогенов1. Поэтому изучение метаболизма Т-клеток важно как для оценки нормальной функции Т-клеток, так и для разработки потенциальных терапевтических средств.
Наивные Т-клетки метаболичес....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Животноводство и эксперименты проводились в соответствии с утвержденным протоколом G98-3 Комитетом по использованию и уходу за животными Национального научно-исследовательского института генома человека, NIH, и утвержденным протоколом LISB 22E Комитетом по уходу и использованию животных Национального института аллергии и инфекционных заболеваний, NIH. Для настоящего исследования были использованы самцы мышей C57Bl/6J в возрасте 6-12 недель, выращенные и содержавшиеся в специфических условиях, свободных от патогенов (SPF). Аналогичные результаты были получены и с самками мышей. Цельная человеческая кровь была получена из банка крови NI....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Наивные CD4+ Т-клетки были выделены из селезенки и лимфатических узлов мышей и дифференцированы в Th0 или неполяризованные (NP) линии в течение 72 ч. Клетки собирали через 0 ч, 48 ч и 72 ч после культивирования, а инкорпорацию OPP измеряли путем изучения MFI OPP. Наивные CD4+ Т-клетки были менее синтетическими, чем активированные Т-клетки, как видно из MFI OPP (рис. 3). Наивные клетки частично зависели от гликолиза, но в большей степени от пути OXPHOS, оцененного с помо.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
В данной работе представлен метод изучения метаболизма в лимфоидных клетках с помощью проточной цитометрии, основанной на технологии SCENITH, но с использованием химического мечения инкорпорированного пуромицина. Несмотря на то, что мы сосредоточились на лимфоцитах, этот протокол может быть скорректирован для изучения метаболизма в любом типе клеток. Этот метод также полезен для изучения метаболизма в редких популяциях клеток и образцах пациентов, где другие методы, такие как «Морской ко.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Мы благодарим д-ра Цинь Сюя и д-ра Авика Датту за предоставленные образцы PBMC и ценные экспериментальные предложения. Это исследование было частично поддержано Отделом внутренних исследований NIAID, NIH.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 2-Меркаптоэтанол | Thermo Fisher | 21985-023 | |
| Alexa Fluor 488 антитело против пуромицина | Biolegend | 381506 | Используемое разведение: 1/100 |
| Alexa Fluor 647 антитело против человеческого CD4 | Biolegend | 357422 | Используемое разведение: 1/50 |
| BD Horizon BUV737 Rat Anti-Mouse CD4 | BD Biosciences | 612761 | Используемое разведение: 1/200 |
| Click-iT Plus OPP Alexa Fluor 488 Набор для анализа синтеза белка | Thermo Fisher | C10456 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher | 15630080 | |
| сыворотка человека | Millipore Sigma | H4522 | |
| IMDM, добавка GlutaMAX, 500 мл | Thermo Fisher | 31980030 | |
| антимышиный CD28 InVivoMAb, клон: 37.51 | BioXcell | BE0015-1 | |
| InVivoMAb антимышиный CD3ε, клон: 145-2C11 | BioXcell | BE0001-1 | |
| InVivoMAb антимышиный ИФН&гамма;, клон: XMG1.2 | BioXcell | BE0055 | |
| InVivoMAb антимышиный IL-12 p40, клон: C17.8 | BioXcell | BE0051 | |
| InVivoMAb антимышиный IL-4, клон: 11B11 | BioXcell | BE0045 | |
| L-глютамин (200 мМ) | Thermo Fisher | 25030081 | |
| LIVE/DEAD Фиксируемый набор для окрашивания Aqua Dead Cell, для возбуждения 405 нм | Thermo Fisher | L34966 | : 1/600 |
| LSM среда для разделения лимфоцитов | MP Biomedicals | 50494X | |
| MEM Раствор заменимых аминокислот (100X) | Thermo Fisher | 11140050 | |
| Митомицин C из Streptomyces caespitosus | Sigma | M0503-10X2MG | |
| Naive CD4 Isolation Kit, мышь | Miltenyi Biotec | 130-104-453 | |
| Параформальдегид 16% водный раствор EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| PBS (1X), pH 7,4, 500 мл | Качественные биологические препараты | 114-058-101 | |
| Пенициллин-стрептомицин (10 000 Ед/мл). 100 мл | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Phytohemagglutinin-L (PHA-L) | Millipore Sigma | 11249738001 | |
| Сыворотка плода крупного рогатого скота премиум-класса (FBS) | Avantor | 97068-085 | |
| RPMI 1640 Средний, без глютамина | Thermo Fisher | 21870076 | |
| Сапонин | Thermo Fisher | A18820.22 | |
| Пируват натрия (100 мМ) | Thermo Fisher | 11360070 |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Эта статья была опубликована
Видео скоро будет доступно