Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Метод изучения метаболизма в лимфоидных клетках с использованием химии для измерения включения пуромицина методом проточной цитометрии

978 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67377

⸱

15 августа 2025 г.

 ,  , 
1Laboratory of Immune System Biology, NIAID, NIH, 2Department of Pediatrics, Kyoto University Graduate School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

В протоколе показан метод, основанный на проточной цитометрии с использованием химии для изучения энергетического метаболизма в клетках.

Аннотация

При стимуляции антигеном наивные Т-клетки подвергаются быстрой пролиферации и экспансии в эффекторные Т-клетки. Метаболизм играет важную роль в образовании биомассы, необходимой для этих быстро размножающихся клеток, а также для генерации молекул, необходимых для дифференцировки и функционирования эффекторных Т-клеток, которые влияют на исход адаптивного иммунного ответа при инфекции или раке. Наивные Т-клетки перепрограммируют свой метаболизм при антигенной стимуляции для увеличения выработки АТФ, которая необходима для поддержания их роста, биосинтеза и эффекторных функций. АТФ может образовываться в клетке либо путем митохондриально-окислительного фосфорилирования (OXPHOS), либо гликолитическим путем. Поскольку большая часть АТФ, образующейся в делящейся, растущей клетке, используется для синтеза белков, синтез белка используется в качестве суррогата уровней АТФ. Синтез белка может быть измерен путем включения пуромицина, который имитирует 3'-аденозин тРНК, заряженной модифицированным тирозином, и приводит к спонтанному прекращению трансляции белка. Метаболические ингибиторы, такие как 2-дезоксиглюкоза (2DG), которая блокирует гликолитический путь, и олигомицин (O), который блокирует комплекс 5 электронно-транспортной цепи (ETC), могут быть использованы для изучения зависимости клеточной генерации АТФ от этих двух путей в сочетании с оценкой синтеза белка в методе, называемом SCENITH. Здесь мы опишем вариант этого метода, который обнаруживает включение пуромицина с помощью проточной цитометрии с использованием химии. Этот метод изучения метаболизма относительно прост и может быть использован для оценки популяций редких клеток, а также образцов пациентов с помощью проточной цитометрии.

Введение

В последние годы растет понимание важной роли метаболизма в регуляции Т-клеток. Клеточный метаболизм регулирует многие важнейшие функции лимфоцитов, включая клональную экспансию патоген-специфичных Т-клеток и их дифференцировку в субпопуляции эффекторных клеток, которые синтезируют различные эффекторные молекулы, включая воспалительные цитокины и цитолитические гранзимы, необходимые для уничтожения патогенов1. Поэтому изучение метаболизма Т-клеток важно как для оценки нормальной функции Т-клеток, так и для разработки потенциальных терапевтических средств.

Наивные Т-клетки метаболически неподвижны и полагаются на катаболический метаболизм и окислительное фосфорилирование (OXPHOS) для удовлетворения своих энергетических потребностей 1,2. После активации Т-клеточных рецепторов (TCR) Т-клетки претерпевают быстрое метаболическое перепрограммирование, отчасти обусловленное повышением регуляции переносчиков питательных веществ на поверхности клеток, которые увеличивают поглощение глюкозы и нескольких аминокислот, включая глутамин, из окружающей среды. Эти питательные строительные блоки затем используются в анаболических путях для производства макромолекул, которые способствуют росту клеток и поддерживают повышенные потребности в энергии, связанные с увеличением роста и деления клеток 1,2,3. Метаболическое перепрограммирование в активированных Т-клетках делает клетки более зависимыми от аэробного гликолиза и глутаминолиза для удовлетворения их энергетических потребностей 1,2,3. При стимуляции TCR поглощение питательных веществ также играет решающую роль в активации нижележащих молекулярных путей3. Например, поглощение аминокислот и повышенная локальная концентрация аминокислот активируют передачу сигналов mTORC14. И наоборот, снижение доступности внутриклеточных аминокислот уменьшает сигнальный путь mTORC1 2,3,5,6,7. Таким образом, метаболизм и клеточная функция тесно связаны в эффекторных Т-клетках.

Значительное увеличение биомассы, необходимое для быстрого деления Т-клеток, требует повышения регуляции синтеза/трансляции белка8. Синтез белка может быть количественно определен в клетке путем изучения включения пуромицина9, имитирующего тирозил-тРНК, который блокирует трансляцию путем включения, маркировки и высвобождения удлиняющихся полипептидных цепей из транслирующихся рибосом9. Трансляция белка является высокоэнергетически зависимым процессом; действительно, большая часть АТФ, образующейся в делящихся, растущих клетках, используется для синтеза белков. Таким образом, синтез белка был использован в качестве суррогатного измерения клеточного АТФ10. Для производства АТФ клетки обычно полагаются на гликолиз и/или митохондриальный путь OXPHOS11. Гликолиз генерирует две молекулы АТФ на молекулу глюкозы. Путь OXPHOS генерирует 36 АТФ на глюкозу12,13, но гликолиз может генерировать АТФ быстрее14. Таким образом, быстро делящиеся активированные Т-клетки, как и раковые клетки, в значительной степени зависят от гликолитического пути для образования АТФ.

Зависимость клетки от каждого метаболического пути может быть изучена с помощью специфических ингибиторов. Ингибитор гликолитического пути 2-дезоксиглюкоза (2-ДГ), являющийся аналогом глюкозы, действует как конкурентный ингибитор гликолитического фермента гексокиназы15. 2-DG фосфорилируется до 2DG-фосфата (2DG-P) гексокиназа. 2DG-P не может в дальнейшем метаболизироваться фосфогексозизомеразой, которая обычно превращает глюкозо-6-фосфат (G-6-P) во фруктозо-6-фосфат16. Таким образом, 2DG-P захватывается и накапливается в клетках, что приводит к ингибированию гликолиза и истощению клеточной АТФ, тем самым блокируя синтез белка17. Аналогичным образом, зависимость клеток от митохондриального пути OXPHOS может быть изучена с помощью олигомицина, который связывается с протонным каналом АТФ-синтазы электронной транспортной цепи (ETC)18, тем самым блокируя синтез митохондриальной АТФ (рис. 1). Использование этих ингибиторов в сочетании с оценкой синтеза белка может дать картину метаболического состояния клеток и было использовано в мощном методе на одной клетке, известном как SCENITH, который оценивает включение пуромицина с помощью проточной цитометрии. Тем не менее, доступность реагентов SCENITH может быть ограниченной. Другие широко используемые методы оценки гликолиза и OXPHOS включают анализ внеклеточного потока морских коньков, который требует большего числа клеток, что может быть неосуществимо экспериментально. В этой статье мы опишем альтернативный метод оценки включения пуромицина с использованием коммерчески доступного химического реагента Click-it. Простота этого метода позволяет быстро оценить метаболическое состояние лимфоцитов, включая популяции редких клеток и образцы пациентов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Животноводство и эксперименты проводились в соответствии с утвержденным протоколом G98-3 Комитетом по использованию и уходу за животными Национального научно-исследовательского института генома человека, NIH, и утвержденным протоколом LISB 22E Комитетом по уходу и использованию животных Национального института аллергии и инфекционных заболеваний, NIH. Для настоящего исследования были использованы самцы мышей C57Bl/6J в возрасте 6-12 недель, выращенные и содержавшиеся в специфических условиях, свободных от патогенов (SPF). Аналогичные результаты были получены и с самками мышей. Цельная человеческая кровь была получена из банка крови NIH в соответствии с одобренным IRB протоколом 99-CC-0168 Клинического центра NIH «Сбор и распределение компонентов крови от здоровых доноров для использования в исследованиях in vitro». В соответствии с Хельсинкской декларацией было получено письменное информированное согласие всех субъектов.

1. Выделение и культивирование CD4+ Т-клеток у мышей

  1. Очищайте наивные CD4+ Т-клетки путем отрицательного отбора из объединенных одноклеточных суспензий мышей селезенки или лимфатических узлов от 6 до 12 недель с помощью магнитной системы разделения клеток в соответствии с протоколом производителя.
  2. Культивируемые клетки (как описано ниже) в средах IMDM, содержащих L-аланил-L-глутамин дипептид и дополненных 10% фетальной сывороткой крупного рогатого скота, 2 мМ L-глутамина, 100 Ед/мл пенициллина, 100 Ед/мл стрептомицина и 0,05 мМ 2-β-меркаптоэтанола.
  3. Совместное культивирование наивных CD4 Т-клеток в соотношении 1:8 с обработанными митомицином-С Т-истощенными спленоцитами (описаны ниже) в виде АРК в 48-луночных планшетах в неполяризованных (1 мкг/мл анти-CD3 [клон 2C11] и 3 мкг/мл анти-CD28 [клон 37.51]) и Th0 (1 мкг/мл анти-CD3, 3 мкг/мл анти-CD28, 10 мкг/мл анти-IFNg [клон XMG1.2], anti-IL-12 [клон C17.8] и анти-IL-4 [клон 11B11]) в течение 72 ч при 37 °C. Создание культур с использованием 1 x 106 APC и 0,13 x 106 наивных CD4 Т-клеток на лунку 48-луночного планшета (Таблица материалов)
  4. Генерация обработанных митомицином-С обедненных Т-обедненных спленоцитов в виде APC: Вкратце, окрашивание одноклеточной суспензии селезенки мыши FITC-конъюгированными антителами CD4 и CD8. Затем пометьте клетки магнитом с помощью микрогранул Anti-FITC (см. Таблицу материалов). Затем с помощью системы разделения магнитных ячеек в соответствии с протоколом производителя отрицательно отбирают АПК из Т-клеток. Затем обработайте АПК 50 мкг/мл митомицина С в течение 40 мин при 37 °C инкубаторе, после чего промывайте 3 раза 1x PBS.

2. Изоляция и культура МПМП человека

  1. Выделите PBMC из цельной крови с использованием разделительных сред лимфоцитов и в соответствии с протоколом производителя (см. Таблицу материалов).
  2. Культуральные PBMC в средах RPMI с добавлением 2 мМ L-глутамина, 0,01 М HEPES, 1 мМ пирувата натрия, 1% заменимых аминокислот, 100 Ед/мл пенициллина и стрептомицина, 0,05 мМ 2-β-меркаптоэтанола и 5% сыворотки крови человека.
  3. Посев 1 x 106 PBMC на лунку 96-луночного планшета с U-образным дном с 5 мкг/мл фитогемагглютинина-L (PHA-L) в течение 18-24 ч при 37 °C.

3. Метаболический анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Важно поддерживать температуру всех клеток, ингибиторов [олигомицина (O), 2-дезоксиглюкозы (2-DG), DMSO (Co)] и реагента O-пропаргилпуромицина (OPP) при максимальной близости к 37 °C. Выведите клетки, ингибиторы и реагент OPP на U-образное дно 96 планшетов и оставьте планшеты в инкубаторе при температуре 37 °C как можно дольше. Ингибиторы аликвот 2-DG и O в меньших объемах во избежание многократного замерзания-оттаивания.

  1. Приготовьте 2 М (20x) стоковый раствор 2-DG и 40 мкМ (40x) стоковый раствор O. Для ОПР разведите 1 мкл ОПР в 49 мкл среды так, чтобы концентрация составила 400 мкМ - это будет 20-кратный стоковый раствор.
  2. Перед началом эксперимента убедитесь, что все остальные компоненты набора для синтеза белка OPP (см. Таблицу материалов) имеют комнатную температуру (RT).
  3. Приготовьте 1x реакционный буфер OPP, разбавив аликвоту из бутылки компонента C в соотношении 1:10 с деионизированной водой. После использования храните оставшийся раствор 1x при температуре 2-8 °C.
  4. Затравите 0,1-2 x 10по 6 клеток в лунку 96-луночного планшета с круглым дном для каждого условия (Co / DG / O / DGO) в 100 мкл полного IMDM (для CD4 Т-клеток мыши) или полного RPMI (для человеческих PBMC) или любой полной среды по выбору. Держите тарелку в инкубаторе как можно дольше.
  5. Добавьте 1х ингибиторы из исходных растворов (5 мкл 20x DG, Co), (2,5 мкл 40x O) и инкубируйте в течение 15 мин при 37 °C, 5% CO2. Конечные концентрации на клетках составляют 100 мМ DG и 1 мкМ O. Осторожно перемешайте ингибиторы с клетками с помощью пипетки. Для удобства выделите ингибиторы в 96-луночном планшете, добавьте клетки к ингибиторам и хорошо перемешайте, пипетируя вверх и вниз несколько раз.
  6. В образец DGO добавьте 1x DG (5 μл), тщательно перемешайте с помощью пипетки и инкубируйте в течение 10 минут при 37 °C, 5%CO2. Затем добавьте 1x O (2,5 μл), пару раз пипетку и инкубируйте в течение 5 минут при 37 °C, 5%CO2.
  7. Не вымывая ингибиторы, добавьте 5 μL OPP из 20-кратного (400 μМ) исходного раствора в каждый образец так, чтобы концентрация составила 20 μМ в клетках, пипетируйте вверх и вниз несколько раз и инкубируйте 30 минут при 37 °C, 5%CO2. Для удобства выведите OPP на 96-луночный планшет, добавьте к реагенту OPP клетки с ингибиторами и хорошо перемешайте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для менее метаболически активных клеток и клеток, выделенных непосредственно ex vivo, увеличьте время инкубации после добавления OPP. Время инкубации с OPP должно быть стандартизировано для каждого типа клеток.
  8. После инкубации с ОПР добавьте 100-150 мкл ледяного буфера FACS (2% FBS и 1 мМ ЭДТА в 1x PBS). Центрифугируйте при 750 x g в течение 2 минут при 4°C. Выбросьте надосадочную жидкость и повторите этап стирки.
  9. Окрашивание клеток соответствующими поверхностными маркерами, антителом против мыши CD4 (используется при разведении 1/200) или антителом против человеческого CD4 (используется при разведении 1/50), реагентом Live/Dead (используется при разведении 1/600), в присутствии Fc-блока (используется при разведении 1/200). Выдерживать 25-30 минут при температуре 4 °C в темноте.
  10. Промойте планшет 150-200 μL буфера FACS и центрифугируйте при 750 x g в течение 2 минут при 4 °C. Аккуратно переверните пластину, чтобы сбросить надосадочную жидкость, затем повторите этап стирки. На этом этапе клетки окрашиваются на поверхности.
  11. Ресуспендировать клетки в 1% PFA в PBS, хорошо перемешать и инкубировать в течение 10-15 мин при 4 °C. Беречь от света.
  12. Промойте с помощью буфера FACS и центрифугируйте при 750 x g в течение 2 минут при 4 °C и повторите стирку.
  13. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 200 мкл холодного 1x сапонина пермеабилизационного буфера (0,1% (масс./об.) сапонин + 3% FBS в 1x PBS). Инкубировать при RT, защищенном от света месте в течение 5-15 минут. В это время клетки фиксируются и проникают.
  14. Приготовьте 1x реакционную буферную добавку OPP (компонент E), разбавив 10x раствор 1:10 в деионизированной воде. Приготовьте этот раствор в свежем виде и используйте его в тот же день.
  15. Приготовьте коктейль из реакции OPP в соответствии с таблицей 1. Используйте коктейль реакции в течение 15 минут после приготовления.
  16. Центрифугируйте образцы из стадии 3.13 при давлении 750 x g в течение 2 минут. Выбросьте надосадочную жидкость. Промойте клетки 2 раза 200 мкл 1x сапонинового пермеабилизационного буфера. Открутите и выбросьте надосадочную жидкость.
  17. Добавьте в каждую лунку по 50-100 мкл реакционного коктейля OPP (приготовленного на шаге 3.12) и хорошо перемешайте. Инкубировать в течение 30 минут при RT в защищенном от света месте. Затем вращайте планшеты при температуре 750 x g или 2 минуты при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость.
  18. Ресуспендируйте гранулу в 200 мкл 1x сапонинового пермеабилизационного буфера и центрифугируйте образцы при 750 x g в течение 2 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость.
  19. Ресуспендировать в 50 мкл буфера для промывки реакции (компонент F) на лунку и центрифугировать при 750 x g в течение 2 мин при 4°C. Ресуспендируйте окрашенные клетки в 200 мкл буфера FACS.
  20. Анализируйте образцы с помощью проточной цитометрии (см. дополнительный рисунок 1) в тот же день или храните клетки в темноте при температуре 4 °C и анализируйте их на следующий день.

4. Анализ метаболических анализов

  1. Измерьте включение пуромицина (ОПП) в качестве суррогата синтеза белка при следующих условиях: 1) контрольное условие (Co); 2) в клетках, где гликолитический путь блокируется 2-DG; 3) в клетках, где митохондриальный путь OXPHOS блокируется O; и 4) в клетках, где как гликолитические, так и митохондриальные пути блокируются ингибиторами (DGO), путем оценки средней интенсивности флуоресценции (MFI) OPP (рис. 2).
  2. Проанализируйте зависимость клеток от определенного пути, рассмотрев MFI OPP в каждом условии. Непосредственно оценивайте MFI как меру синтеза белка. Рассчитайте зависимость от глюкозы, гликолитическую способность, способность к окислению жирных кислот (FAO) и окислению аминокислот (AAO), а также митохондриальную зависимость попункту 10.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Наивные CD4+ Т-клетки были выделены из селезенки и лимфатических узлов мышей и дифференцированы в Th0 или неполяризованные (NP) линии в течение 72 ч. Клетки собирали через 0 ч, 48 ч и 72 ч после культивирования, а инкорпорацию OPP измеряли путем изучения MFI OPP. Наивные CD4+ Т-клетки были менее синтетическими, чем активированные Т-клетки, как видно из MFI OPP (рис. 3). Наивные клетки частично зависели от гликолиза, но в большей степени от пути OXPHOS, оцененного с помо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В данной работе представлен метод изучения метаболизма в лимфоидных клетках с помощью проточной цитометрии, основанной на технологии SCENITH, но с использованием химического мечения инкорпорированного пуромицина. Несмотря на то, что мы сосредоточились на лимфоцитах, этот протокол может быть скорректирован для изучения метаболизма в любом типе клеток. Этот метод также полезен для изучения метаболизма в редких популяциях клеток и образцах пациентов, где другие методы, такие как «Морской ко...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Мы благодарим д-ра Цинь Сюя и д-ра Авика Датту за предоставленные образцы PBMC и ценные экспериментальные предложения. Это исследование было частично поддержано Отделом внутренних исследований NIAID, NIH.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-МеркаптоэтанолThermo Fisher21985-023
Alexa Fluor 488 антитело против пуромицинаBiolegend381506Используемое разведение: 1/100
Alexa Fluor 647 антитело против человеческого CD4Biolegend357422Используемое разведение:  1/50
BD Horizon BUV737 Rat Anti-Mouse CD4BD Biosciences612761Используемое разведение:  1/200
Click-iT Plus OPP Alexa Fluor 488 Набор для анализа синтеза белкаThermo FisherC10456
HEPES (1 M)Thermo Fisher15630080
сыворотка человекаMillipore SigmaH4522
IMDM, добавка GlutaMAX, 500 млThermo Fisher31980030
антимышиный CD28 InVivoMAb, клон:  37.51BioXcellBE0015-1
InVivoMAb антимышиный CD3ε, клон:  145-2C11BioXcellBE0001-1
InVivoMAb антимышиный ИФН&гамма;, клон:  XMG1.2BioXcellBE0055
InVivoMAb антимышиный IL-12 p40, клон:  C17.8BioXcellBE0051
InVivoMAb антимышиный IL-4, клон:  11B11BioXcellBE0045
L-глютамин (200 мМ)Thermo Fisher25030081
LIVE/DEAD Фиксируемый набор для окрашивания Aqua Dead Cell, для возбуждения 405 нмThermo FisherL34966:  1/600
LSM среда для разделения лимфоцитовMP Biomedicals50494X
MEM Раствор заменимых аминокислот (100X)Thermo Fisher11140050
Митомицин C из Streptomyces caespitosusSigmaM0503-10X2MG
Naive CD4 Isolation Kit, мышьMiltenyi Biotec130-104-453
Параформальдегид 16% водный раствор EM GradeElectron Microscopy Sciences15710
PBS (1X), pH 7,4, 500 млКачественные биологические препараты114-058-101
Пенициллин-стрептомицин (10 000 Ед/мл). 100 млThermo Fisher15140122
Phytohemagglutinin-L (PHA-L)Millipore Sigma11249738001
Сыворотка плода крупного рогатого скота премиум-класса (FBS)Avantor97068-085
RPMI 1640 Средний, без глютаминаThermo Fisher21870076
СапонинThermo FisherA18820.22
Пируват натрия (100 мМ)Thermo Fisher11360070
Используется разбавление

Ссылки

  1. Saravia, J., Raynor, J. L., Chapman, N. M., Lim, S. A., Chi, H. Signaling networks in immunometabolism. Cell Res. 30, 328-342 (2020).
  2. Chapman, N. M., Boothby, M. R., Chi, H. Metabolic coordination of T cell quiescence and activation. Nat Rev Immunol. 20, 55-70 (2020).
  3. Raynor, J. L., Chi, H. Nutrients: Signal 4 in T cell immunity. J Exp Med. (221), e20221839(2024).
  4. Shimobayashi, M., Hall, M. N. Multiple amino acid sensing inputs to mTORC1. Cell Res. 26, 7-20 (2016).
  5. Huang, H., et al. In vivo CRISPR screening reveals nutrient signaling processes underpinning CD8(+) T cell fate decisions. Cell. 184, 1245-1261.e21 (2021).
  6. Pollizzi, K. N., et al. Asymmetric inheritance of mTORC1 kinase activity during division dictates CD8(+) T cell differentiation. Nat Immunol. 17, 704-711 (2016).
  7. Verbist, K. C., et al. Metabolic maintenance of cell asymmetry following division in activated T lymphocytes. Nature. 532, 389-393 (2016).
  8. Marchingo, J. M., Cantrell, D. A. Protein synthesis, degradation, and energy metabolism in T cell immunity. Cell Mol Immunol. 19, 303-315 (2022).
  9. Enam, S. U., et al. Puromycin reactivity does not accurately localize translation at the subcellular level. Elife. 9, e60303(2020).
  10. Argüello, R. J., et al. SCENITH: A Flow Cytometry-Based Method to Functionally Profile Energy Metabolism with Single-Cell Resolution. Cell Metab. 32, 1063-1075.e7 (2020).
  11. Dunn, J., Grider, M. H. Physiology, Adenosine Triphosphate. , StatPearls Publishing LLC. (2024).
  12. Shiratori, R., et al. Glycolytic suppression dramatically changes the intracellular metabolic profile of multiple cancer cell lines in a mitochondrial metabolism-dependent manner. Sci Rep. 9, 18699(2019).
  13. Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C., Thompson, C. B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 324, 1029-1033 (2009).
  14. Pfeiffer, T., Schuster, S., Bonhoeffer, S. Cooperation and competition in the evolution of ATP-producing pathways. Science. 292, 504-507 (2001).
  15. Brown, J. Effects of 2-deoxyglucose on carbohydrate metabolism: review of the literature and studies in the rat. Metabolism. 11, 1098-1112 (1962).
  16. Weindruch, R., et al. Caloric restriction mimetics: metabolic interventions. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 56 Spec No1, 20-33 (2001).
  17. Gronostajski, R. M., Pardee, A. B., Goldberg, A. L. The ATP dependence of the degradation of short- and long-lived proteins in growing fibroblasts. J Biol Chem. 260, 3344-3349 (1985).
  18. Hearne, A., Chen, H., Monarchino, A., Wiseman, J. S. Oligomycin-induced proton uncoupling. Toxicol In Vitro. 67, 104907(2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

SCENITH
Видео скоро будет доступно
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.