Методическая статья

Методология корреляционной оптической спектроскопии и масс-спектрометрии для визуализации распределения лекарств в срезе мягких тканей

DOI:

10.3791/67383

⸱

20 июня 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Chemical & Biological Sciences Department, National Physical Laboratory, 2Department of Life Sciences, University of Bath, 3Haleon CH SARL, 4School of Chemistry & Chemical Engineering, University of Surrey

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данном исследовании представлен метод корреляционной визуализации лекарственных препаратов в мягких тканях с использованием нелинейной оптической спектроскопии и масс-спектрометрии. Сочетание визуализации кожи с высоким разрешением и чувствительным обнаружением лекарств предлагает ценный подход к изучению распределения лекарств в коже, что имеет решающее значение для разработки превосходных продуктов для местного применения.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Новая методология корреляционной визуализации, сочетающая субмикронное пространственное разрешение с чувствительным обнаружением лекарств с помощью оптической спектроскопии и масс-спектрометрической визуализации, была разработана для визуализации распределения химических веществ при внесении лекарства в мягкие ткани. В данном примере метод был протестирован на иссеченной ткани кожи после местного применения in vitro коммерческого нестероидного противовоспалительного лекарственного препарата в течение 16 часов. Неразрушающие оптические спектроскопические методы, в том числе вынужденное комбинационное рассеяние, генерация второй гармоники и двухфотонная флуоресцентная микроскопия, были впервые использованы для картирования структуры и морфологии кожи. Впоследствии те же образцы тканей кожи были проанализированы с помощью времяпролетной масс-спектрометрии вторичных ионов (ToF-SIMS), что позволило повысить чувствительность к обнаружению диклофенака в самых внешних слоях кожи – эпидермисе и дерме. Разработаны методы регистрации изображений, позволяющие интегрировать оптические и масс-спектрометрические данные. Этот подход сочетает в себе безметочную визуализацию структуры тканей с высоким разрешением и чувствительным химическим обнаружением и представляет собой ценный инструмент для исследования распределения лекарств в коже и, возможно, в других мягких биологических тканях.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Понимание скорости, степени и движущих сил распределения активных фармацевтических ингредиентов в мягких биологических тканях после их местного или системного применения имеет решающее значение для выяснения механизмов, лежащих в основе тканеспецифического поглощения, метаболизма и клиренса лекарственных препаратов (т.е. для более глубокого понимания фармакокинетики лекарственных средств). В данной работе мы представляем новый метод корреляционной визуализации, объединяющий нелинейную оптическую спектроскопию и масс-спектроскопию для визуализации структуры ткани без меток и распределения местных лекарственных препаратов в одном и том же образце ткани1.

Рамановская спектроскопия (РС) стала ценным инструментом для картирования распределения лекарств в клетках и тканях с высоким пространственным разрешением и молекулярной специфичностью2. RS основан на неупругом рассеянии света3 на интересующем образце, что позволяет детально определить химическую характеристику с помощью характеристических колебательных мод молекул в нем, без необходимости использования внешних меток. Тем не менее, длительное время получения изображений с высоким разрешением может потенциально поставить под угрозу целостность чувствительных биологических образцов. Кроме того, при исследовании более глубоких слоев тканей рассеяние и поглощение света тканью может ослабить сигнал комбинационного рассеяния, что еще больше ограничивает его чувствительность. Микроскопия вынужденного комбинационного рассеяния света (SRS) представляет собой значительный шаг вперед по сравнению с традиционной РС, используя импульсное лазерное возбуждение и детектирование стимулированного комбинационного сигнала4. Микроскопия SRS позволяет быстро получать 2-D и 3-D изображения с высоким пространственным разрешением, а при выполнении в тандеме с микроскопией второй гармоники (ГВГ) и двухфотонной возбужденной флуоресцентной (TPEF) микроскопией может обеспечить комплексное изображение соединительных тканей, коллагена и эластина 1,5,6,7,8,9 . Микроскопия ГВГ — это нелинейный оптический метод, который основан на взаимодействии света с нецентросимметричными структурами в образце, генерируя сигнал на половине длины волны падающего света. Это особенно полезно для визуализации упорядоченных структур, таких как коллаген в биологических тканях. TPEF — это еще один метод нелинейной микроскопии, при котором два фотона с более низкой энергией одновременно возбуждают флуорофор, заставляя его излучать флуоресценцию. TPEF позволяет визуализировать глубокие ткани с уменьшенным фотоповреждением, так как возбуждающий свет находится в ближнем инфракрасном диапазоне, который глубже проникает в биологические образцы.

Масс-спектрометрия (MSI) — это мощный аналитический метод, который сочетает в себе возможности масс-спектрометрии с пространственной информацией, позволяя идентифицировать широкий спектр молекул 10,11,12 без меток. Времяпролетная масс-спектрометрия вторичных ионов (ToF-SIMS) работает путем бомбардировки поверхности образца высокоэнергетическими первичными ионами, вызывая выброс вторичных ионов с поверхности. Затем эти вторичные ионы ускоряются к времяпролетному анализатору, где определяется их отношение массы к заряду. Этот анализ позволяет идентифицировать молекулярные фрагменты и изотопные вариации с высокой чувствительностью и разрешением. Ценное применение ToF-SIMS было продемонстрировано в биологических и фармацевтических исследованиях для изучения химических веществ и биомолекул в клетках13, тканях14, 15 и органах15.

Как SRS, так и ToF-SIMS использовались независимо друг от друга для изучения распределения лекарств в различных моделях кожи. Тем не менее, наиболее ценно использовать эти методы в комбинации, чтобы извлечь выгоду из их взаимодополняемости. В этом исследовании мы описываем рабочий процесс объединения оптической микроскопии (SRS, TPEF и SHG) с ToF-SIMS для получения изображений морфологии кожи с субмикронным пространственным разрешением (обеспечиваемым оптическими методами) с наложением на сигнал лекарственного препарата, обнаруженный с превосходной чувствительностью (обеспечиваемый ToF-SIMS). Этот подход был использован для решения сложного примера визуализации распределения диклофенака в удаленных тканях кожи, обработанных коммерческим препаратом для местного применения (гель Вольтарен). Критерии успеха включали высокую химическую чувствительность для обнаружения диклофенака в его терапевтической концентрации и достаточное пространственное разрешение для разрешения структуры кожи. Несмотря на то, что содержание диклофенака в различных слоях кожи может быть количественно определено после местного лечения с помощью трудоемких и технически сложных методов, таких как зачистка ленты с последующим количественным определением16, или с помощью микроперфузии открытого потока17, эти подходы не могут пролить свет на разделение, проникновение, удержание и распределение по глубине диклофенака в отдельных слоях кожи, которые являются существенными факторами, способствующими фазе разработки продукта.

Перед описанной ниже методикой измерения гель Вольтарен Форте (содержащий 2,32 % диклофенака диэтиламмония) или соответствующий гель плацебо (поставляемый компанией Haleon CH SARL) наносили на поверхность кожи в течение различных периодов времени (4, 12, 16 или 24 ч). После удаления любого остаточного состава были проведены измерения SRS и ToF-SIMS на тех же образцах кожи; Полная информация о методологии изложена в оригинальной рукописи1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этическое заявление: Образцы кожи человека были получены компанией Tissue Solutions Ltd, Глазго, Великобритания, компанией Charles River Laboratories (CRL) в Эдинбурге, Великобритания. Все анонимные образцы были получены в соответствии с правовыми и этическими стандартами страны сбора, с этического одобрения и информированного согласия доноров или их ближайших родственников.

1. Секционирование кожи

Для получения срезов тканей кожи использовался криостат.

  1. Выньте обработанные диски из морозильной камеры при температуре -20 °C и отрежьте небольшой кусочек (~1,0 см x 1,0 см) от центра диска.
  2. Установите образец на патрон в криостате над замерзшей каплей воды. Не используйте компаунд с оптимальной температурой резки (OCT) или другие закладные среды.
  3. Установите температуру лезвия и образца на уровне -20 °C и -16 °C соответственно.
  4. Секция толщиной 30 мкм на стеклянном покровном листе (#1.5, Fisher Scientific).
  5. Выполните SRS и ToF-SIMS немедленно или в качестве альтернативы, образец может быть упакован в вакуум для хранения при температуре -80 °C.
  6. Перед использованием высушить в течение 20 минут.

2. Визуализация SRS

Микроскопию SRS, SHG и TPEF проводили с использованием когерентного рамановского микроскопа. Два пикосекундных лазерных импульса были сгенерированы пучком Стокса с длиной волны 1031,2 нм, перекрытым пространственно и временно перестраиваемым лучом накачки. Луч Стокса, модулированный на частоте 20 МГц, облегчал обнаружение вынужденных сигналов комбинационных потерь при передаче. Для детектирования сигнала был использован детектор на основе кремния в сочетании с синхронным усилителем. Другой канал был использован для сбора сигналов второй гармоники и излучаемых флуоресцентных сигналов, используя фотоумножитель для детектирования.

  1. Установите подходящий объектив и конденсорные линзы для многофотонной визуализации тканей, в данном случае водную иммерсионную линзу с 40-кратным увеличением (1,1 NA) в сочетании с короткой рабочей дистанцией воздушной конденсорной линзы (0,9 NA).
  2. Поместите смонтированный срез ткани на предметный столик микроскопа SRS так, чтобы ткань находилась на той же стороне предметного стекла микроскопа, что и линза конденсора. Сфокусируйте линзу объектива на участке ткани, а затем оптимизируйте высоту конденсора.
  3. Установите мощность лазера на соответствующие значения, чтобы получить хорошее соотношение сигнал/шум без повреждения ткани. В данном примере на образец было приложено приблизительно 10 мВт для пучка накачки и 30 мВт для пучка Стокса. Обратитесь к Tsikritsis et al для практических соображений по измерениям SRS4.
  4. Получите мозаичное изображение всего сечения с разрешением 512 x 512 пикселей, что соответствует 290 μм x 290 μм при масштабировании X1, со скоростью изображения 400 Гц и средним значением линии 1 на 2850 см-1 , что соответствует растяжению CH2 .
  5. В мозаичном изображении всего разреза выберите интересующую область (ROI) со следующими соображениями: (i) она расположена в центре, избегая крайних 20 % периметра образца, где может быть недозированная кожа, зажатая в клеточном аппарате Франца; (ii) она достаточно плоская, чтобы ее можно было исследовать в пределах одного и того же оптического уровня глубины; (iii) он имеет отличительные структурные особенности, которые способствовали бы его визуальной идентификации при переносе образца в ToF-SIMS.
  6. Применение согласованных настроек усиления по всему исследованию для детекторов SRS и SHG/флуоресцентных детекторов и получение изображений в (i) области растяжения C-H (на 2945 см-1, 2850 см-1 и 2650 см-1 , соответствующих CH3, CH2 и контролю внерезонансного резонанса, соответственно); (ii) область отпечатков пальцев (при 1666 см-1 и 1723 см-1 , соответствующих амиду I и внерезонансному контролю, соответственно); (iii) волновое число, соответствующее включенному и выключенному резонансу, относящемуся к применяемому лекарственному средству; в данном примере при 1586 см-1 и 1530 см-1 , соответствующих C=C и выключенному резонансу соответственно.

После создания изображений SRS немедленно перенесите образец в установку ToF-SIMS для анализа.

3. Визуализация ToF-SIMS

Времяпролетная масс-спектрометрия вторичных ионов проводилась с использованием пучка первичных ионов Bi3+ с энергией 30 кэВ и током 0,2 пА.

  1. Выберите подходящие настройки сбора данных; В этом примере использовалась отрицательная ионная полярность с временем рабочего цикла 100 мс, диапазоном масс M/Z 0-900 и диаметром пучка 5 мкм. Для компенсации заряда использовалась пушка с электронным заливкой 20 эВ при 5 мкА.
  2. Получение общего изображения с помощью макрорастрового режима рабочей области для отображения всего участка ткани с полем зрения в зависимости от размеров ткани (в нашем случае мы использовали размеры от 2,5 до 3,0 мм x 8,5 до 9,0 мм). Этот общий образ формируется из мозаики более мелких изображений. В этом примере каждый из них имел поле зрения 0,5 мм x 0,5 мм (256 x 256 пикселей) с 1 выстрелом ионного пучка на пиксель, в результате чего доза ионов составила 8,18 x 108 ионов/см2.
  3. Используйте тот же метод для получения изображений ROI, выбрав соответствующее поле зрения; В данном случае это было 1,0 мм x 0,5 мм, с 4 кадрами на пиксель на кадр и 10 кадрами на патч, что соответствует дозе ионов 1,31 x 1011 ионов/см2.
  4. Чтобы обеспечить контроль качества, анализируйте образцы гомогената тканей непосредственно до и после осмотра каждого участка кожи. Используйте поле зрения 0,5 мм x 0,5 мм (256 x 256 пикселей) с 1 снимком на пиксель и 1 кадром на скан, проведя в общей сложности 15 сканирований. Эта конфигурация соответствует плотности дозы ионов 3,27 x10 10 ион/см2.
  5. Полученные масс-спектры могут быть откалиброваны с использованием ионов H−, C−, C2− и C3−.
  6. Сбор и извлечение данных осуществлялись с помощью программного обеспечения Surface Lab 7.1.

4. Регистрация изображений и анализ данных с помощью MATLAB

  1. Уменьшите изображения SIMS и SRS до 3 измерений, используя неотрицательную матричную факторизацию, чтобы визуализировать их в виде красных, зеленых и синих цветовых каналов.
  2. Выберите совпадающие объекты между этими двумя изображениями без матричной факторизации, выбрав инструмент выбора контрольных точек Matlab "cpselect" (Matlab, Mathworks, 2019b и Image Processing Toolbox).
  3. Используйте функции "cp2tform" и "imtransform" для выполнения регистрации, применив аффинное преобразование с данными SIMS в качестве фиксированных изображений и данными оптической спектроскопии в качестве движущихся изображений.
  4. Если в данных ToF-SIMS для интересующего препарата обнаружено несколько пиков, суммируйте интенсивность этих пиков для создания комбинированной интенсивности ионов препарата.
  5. Извлеките среднее общее количество ионов из двух наборов данных гомогенатов (до и после) для каждого соответствующего образца ткани кожи. Используя это соответствующее значение, нормализуйте интенсивность данных ToF-SIMS иона препарата на каждом изображении кожи.
  6. После регистрации создайте наложение данных оптической спектроскопии и SIMS, назначив соответствующие изображения RGB-каналам: красный (изображение SRS для CH2), зеленый (изображение SHG для коллагена) и синий (изображение SIMS для диклофенака, включая сигналы от различных ионов на m/z 214.04, 216.04, 250.02, 252.02, 294.01 и 296.01).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На рисунке 1 представлены результаты регистрации изображений на основе признаков, отображающие зарегистрированные наложенные изображения SRS, SHG и SIMS для двух образцов кожи, один из которых был обработан плацебо (рисунок 1a), а другие — гелем Вольтарен в течение 4 часов (рисунок 1b) и 16 часов (рисунок 1c). На этом изображении суммарный сигнал интенсивности препарата ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот метод позволяет проводить корреляционную визуализацию с помощью нелинейной оптической спектроскопии и масс-спектрометрии для обнаружения распределения лекарственного препарата в мягких тканях с субмикронным пространственным разрешением и высокой чувствительностью. Важно отметить, что визуализация достигается без использования потенциально мешающих меток, которые потребовались бы для флуоресцентной микроскопии. Дальнейшая валидация рабочего процесса включала в себя традиционное окраш...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MBB является сотрудником компании Haleon CH SARL, финансирующей исследование.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было профинансировано компанией Haleon CH SARL. Взносы NAB и RHG были частично поддержаны Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) Министерства здравоохранения и социальных служб США (HHS) в виде финансовой помощи (1-U01-FD006533). Эта работа финансировалась Министерством бизнеса, энергетики и промышленной стратегии Великобритании в рамках проектов NMS/ID74 и NMS/ST18 Национальной системы измерений Великобритании. Содержание этой статьи принадлежит авторам и не обязательно отражает официальную точку зрения или одобрение со стороны FDA/HHS или правительства США. NAB благодарен за поддержку со стороны Сообщества по науке аналитических измерений для присуждения стипендии CAMS Fellowship Award 2020, финансируемой Трастовым фондом аналитической химии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Когерентный рамановский микроскоп Leica Microsystemshttps://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/
Образцы кожи человека Tissue Solutions Ltd, Глазго
Leica CM 1850 Cryostat Leica Biosystemshttps://www.leicabiosystems.com/en-fr/histology-equipment/cryostats/leica-cm1850/Снята с производства
лазерная система PicoEmerald-SAPE Berlinhttps://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/
ToF SIMS 5IONToF GmbHhttps://spectral.se/products/tof-sims-5

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Belsey, N. A., et al. Visualisation of drug distribution in skin using correlative optical spectroscopy and mass spectrometry imaging. J Control Release. 364, 79-89 (2023).
  2. Pudlas, M., et al. Raman spectroscopy: A noninvasive analysis tool for the discrimination of human skin cells. Tissue Eng Part C Methods. 17 (10), 1027-1040 (2011).
  3. Raman, C. V., Krishnan, K. S. A new type of secondary radiation. Nature. 121 (3048), 501-502 (1928).
  4. Tsikritsis, D., Legge, E. J., Belsey, N. A. Practical considerations for quantitative and reproducible measurements with stimulated Raman scattering microscopy. Analyst. 147 (21), 4642-4656 (2022).
  5. Sarri, B., et al. Stimulated Raman histology: One to one comparison with standard hematoxylin and eosin staining. Biomed Opt Express. 10 (10), 5378-5384 (2019).
  6. Lee, M., et al. Recent advances in the use of stimulated Raman scattering in histopathology. Analyst. 146 (3), 789-802 (2021).
  7. Mansfield, J., Moger, J., Green, E., Moger, C., Winlove, C. P. Chemically specific imaging and in-situ chemical analysis of articular cartilage with stimulated Raman scattering. J Biophotonics. 6 (10), 803-814 (2013).
  8. Shi, L., Fung, A. A., Zhou, A. Advances in stimulated Raman scattering imaging for tissues and animals. Quant Imaging Med Surg. 11 (3), 1078-1101 (2021).
  9. Brzozowski, K., et al. Stimulated Raman scattering microscopy in chemistry and life science - development, innovation, perspectives. Biotechnol Adv. 60, 108003(2022).
  10. Buchberger, A. R., Delaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass spectrometry imaging: A review of emerging advancements and future insights. Anal Chem. 90 (1), 240-265 (2018).
  11. Seeley, E. H., Caprioli, R. M. Molecular imaging of proteins in tissues by mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18126-18131 (2008).
  12. Vanbellingen, Q. P., et al. Time-of-flight secondary ion mass spectrometry imaging of biological samples with delayed extraction for high mass and high spatial resolutions. Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (13), 1187-1195 (2015).
  13. Singh, A. V., et al. ToF-SIMS 3D imaging unveils important insights on the cellular microenvironment during biomineralization of gold nanostructures. Sci Rep. 10 (1), 261(2020).
  14. Yoon, S., Lee, T. G. Biological tissue sample preparation for time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) imaging. Nano Converg. 5 (1), 24(2018).
  15. Shi, X., et al. A ToF-SIMS methodology for analyzing inter-tissue lipid distribution variations and intra-tissue multilevel mass spectrometry imaging within a single rat. Microchem J. 200, 110235(2024).
  16. Louw, E. -V., et al. Comparative study on the topical and transdermal delivery of diclofenac incorporated in nano-emulsions, nano-emulgels, and a colloidal suspension. Drug Deliv Transl Res. 13 (5), 1372-1389 (2023).
  17. Hummer, J., et al. Optimization of topical formulations using a combination of in vitro methods to quantify the transdermal passive diffusion of drugs. Int J Pharm. 620, 121737(2022).
  18. Sjövall, P., et al. Imaging the distribution of skin lipids and topically applied compounds in human skin using mass spectrometry. Sci Rep. 8 (1), 16683(2018).
  19. Delvaux, X., Noël, C., Poumay, Y., Houssiau, L. Probing the human epidermis by combining tof-sims and multivariate analysis. Biointerphases. 18 (1), 011002(2023).
  20. Kolenc, O. I., Quinn, K. P. Evaluating cell metabolism through autofluorescence imaging of nad (p) h and fad. Antioxid Redox Signal. 30 (6), 875-889 (2019).
  21. Hanson, K. M., Clegg, R. M. Observation and quantification of ultraviolet-induced reactive oxygen species in ex vivo human skin. Photochem Photobiol. 76 (1), 57-63 (2002).
  22. Wang, J., et al. Non-invasive skin imaging assessment of human stress during head-down bed rest using a portable handheld two-photon microscope. Front Physiol. 13, 899830(2022).
  23. Brunetti, A., et al. Correlative morphologic and functional imaging for diagnosis, staging and follow up in aids: An overview. Q J Nucl Med. 39 (3), 201-211 (1995).
  24. Van Zyl, T., Van Rensburg, L. J., Naidoo, K., Merven, M., Opperman, J. F. Correlative imaging and histopathology of a complicated sinonasal teratocarcinosarcoma. SA J Radiol. 27 (1), 2548(2023).
  25. Huber, K., et al. Novel approach of MALDI drug imaging, immunohistochemistry, and digital image analysis for drug distribution studies in tissues. Anal Chem. 86 (21), 10568-10575 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи