Оценка высвобождения LC3-II через внеклеточные везикулы в связи с накоплением внутриклеточных LC3-положительных везикул

Краткое содержание

В данной статье мы представляем методологию краткой оценки уровня аутофагосомного маркера LC3-II во внеклеточных везикулах (ВВ) методом иммуноблоттинга. Анализ уровней LC3-II в ВВ, образовании аутолизосом и образовании омегасом позволяет предположить новую роль STX6 в высвобождении LC3-II-положительных ВВ при ингибировании слияния аутофагосом и лизосом.

Аннотация

(Макро)аутофагия представляет собой фундаментальный путь клеточной деградации. В этом процессе двухмембранные везикулы, известные как аутофагосомы, поглощают содержимое цитоплазмы, впоследствии сливаясь с лизосомами для деградации. Помимо канонической роли, гены, связанные с аутофагией, также модулируют секреторный путь, включающий высвобождение воспалительных молекул, факторов восстановления тканей и внеклеточных везикул (ВВ). Примечательно, что процесс распространения патологических белков между клетками, особенно при нейродегенеративных заболеваниях, поражающих головной и спинной мозг, подчеркивает важность понимания этого феномена. Недавние исследования показывают, что ДНК-связывающий белок 43 кДа (TDP-43) с трансактивным ответом, ключевой игрок в боковом амиотрофическом склерозе и лобно-височной долевой дегенерации, высвобождается аутофагическим зависимым образом через EV, обогащенные аутофагосомными маркерами микротрубочек-ассоциированными белками легкой цепи 1A/1B легкой цепи 3B-II (LC3-II), особенно когда ингибируется слияние аутофагосом и лизосомы.

Чтобы выяснить механизм, лежащий в основе формирования и высвобождения LC3-II-положительных ВВ, необходимо разработать доступный и воспроизводимый метод оценки как внутриклеточных, так и внеклеточных LC3-II-положительных везикул. В данном исследовании представлен подробный протокол оценки уровней LC3-II с помощью иммуноблоттинга в клеточных и EV-фракциях, полученных с помощью дифференциального центрифугирования. Бафиломицин А1 (Baf), ингибитор слияния аутофагосом и лизосом, служит положительным контролем для повышения уровня внутриклеточных и внеклеточных LC3-II-положительных везикул. Ген восприимчивости к опухолям 101 (TSG101) используется в качестве маркера для мультивезикулярных тельц. Применяя этот протокол, было продемонстрировано, что миРНК-опосредованный нокдаун синтаксина-6 (STX6), генетического фактора риска спорадической болезни Крейтцфельдта-Якоба, увеличивает уровни LC3-II во фракции EV клеток, обработанных Baf, не оказывая при этом существенного влияния на уровни TSG101. Эти данные свидетельствуют о том, что STX6 может негативно регулировать внеклеточное высвобождение LC3-II через ВВ, особенно в условиях, когда нарушается слияние аутофагосом и лизосом. В сочетании с установленными методами оценки аутофагии этот протокол дает ценную информацию о роли конкретных молекул в образовании и высвобождении LC3-II-положительных EV.

Введение

ДНК-связывающий белок 43 с трансактивационным ответом (TDP-43) представляет собой широко экспрессируемый гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин, участвующий в регуляции сплайсинга экзонов, транскрипции генов и стабильности мРНК, что жизненно важно для выживания клеток ^1,2. При нейродегенеративных состояниях, таких как боковой амиотрофический склероз (БАС) и лобно-височная долевая дегенерация (FTLD), ядерный белок TDP-43 аномально накапливается в цитоплазме. Этот сдвиг приводит к потере функции TDP-43 в ядре и токсическому усилению функции в цитоплазме. Патологическое накопление TDP-43 начинается в определенных областях головного и спинного мозга, распространяясь по этим областям прионоподобным образом, процесс, тесно связанный с прогрессированием заболевания³. Однако точный механизм, с помощью которого патология TDP-43 распространяется по головному и спинному мозгу, остается неизвестным.

TDP-43 секретируется через внеклеточные везикулы (ВВ), а повышенные уровни TDP-43 обнаруживаются в плазме и спинномозговой жидкости (СМЖ) пациентов с БАС и FTLD-TDP ^4,5,6. СМЖ у пациентов с диагнозом БАС и ЛЛЗ индуцирует внутриклеточную неправильную локализацию и агрегацию эндогенного TDP-43 в клетках глиомы человека⁷. Таким образом, TDP-43, высвобождаемый внеклеточно через ВВ, может опосредуть межклеточное распространение патологии TDP-43 от клетки к клетке.

Аутофагия — это хорошо сохранившийся механизм клеточной деградации, который включает в себя заключение нежелательных веществ в двухмембранные везикулы, известные как аутофагосомы, которые помечены LC3. Эти аутофагосомы сливаются с лизосомно-ассоциированными мембранным белком 1 (LAMP1)-положительными лизосомами с образованием аутолизосом (LC3⁺/LAMP1⁺), что приводит к деградации их содержимого⁸. Гистологические анализы свидетельствуют о том, что аутофагосомы, поглощающие включения, накапливаются в нейронах пациентов со спорадическим БАС⁹. Некоторые причинные гены семейного БАС и FTLD-TDP связаны с регуляцией аутофагии 10,11,12. Эти данные свидетельствуют о том, что аутофагия подавляется у пациентов с БАС и FTLD-TDP.

Предыдущее исследование показало, что TDP-43 секретируется через ВВ, положительные на маркер аутофагосом LC3-II^{, когда} ингибируется слияние аутофагосом и лизосомы. Нарушение регуляции пути аутофагии-лизосомы может привести не только к внутриклеточному накоплению TDP-43, но и к внеклеточному высвобождению TDP-43 через EVs¹⁴. Однако остается неизвестным, каким образом высвобождаются LC3-II положительные ВВ и насколько это значимо в распространении патологии TDP-43.

ВВ классифицируются на большие ВВ (от 100 до 1000 нм в диаметре), которые образуются в результате почкования клеточной поверхности, и малые ВВ (от 50 до 150 нм в диаметре), которые образуются в результате почкования эндосомальных мембран к внутренней части эндосомы (известных как экзосомы) и аппарата Гольджи. Чтобы раздельно собирать большие и малые электромобили, мы выполняем последовательное центрифугирование и собираем гранулы методом центрифугирования в концентрации 20 000 × г и 110 000 × г соответственно. Фракция P1 EV (20 000 × г гранул) подготавливается для сбора крупных EV, а фракция P2 EV (110 000 × г гранул) — для сбора мелких EV15. Методика оценки уровней LC3-II в больших и малых ВВ, полученных в результате последовательного центрифугирования методом иммуноблоттинга, стабильна и воспроизводима¹⁶. В дополнение к анализу уровней LC3-II в ВВ, анализ образования аутолизосом и омегасом улучшает понимание того, как нарушение регуляции аутофагии приводит к высвобождению LC3-II положительных ВВ. В настоящем исследовании показана подавляющая роль синтаксина 6 (STX6), белка SNARE, который способствует движению транспортных везикул к мембранам-мишеням¹⁷, в высвобождении LC3-II положительных EV при ингибировании слияния аутофагосом и лизосом.

Протокол

1. Получение клеточной, P1 и P2 EV фракции из культивируемой среды клеток HeLa

1. Получение фракции P1 и P2 EV из культивируемой среды клеток HeLa
   1. День 1
      1. Подсчитайте клетки с помощью клеточного счетчика и затравите 1 × 10⁶ клеток на 6-сантиметровой пластине, содержащей питательную среду, состоящую из DMEM High Glucose, 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C с 5%_CO2 и контролируемой влажности в течение 24 часов.
   2. День 2 (по желанию)
      1. Приготовьте 20 мкМ раствор миРНК.
      2. Смешайте 100 мкл восстановленной сывороточной среды и 3 мкл миРНК в пробирке с низким удержанием для приготовления раствора А.
      3. Смешайте 100 μл восстановленной сывороточной среды и 5 μл реагента для трансфекции в пробирке с низким удержанием для приготовления раствора В.
      4. Смешайте раствор А и раствор В, затем инкубируйте смесь при комнатной температуре (RT) в течение 5 минут.
      5. Добавьте смесь растворов А и В в среду, используемую для культивирования клеток HeLa. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C с 5%_CO2 и контролируемой влажности в течение 24 часов.
   3. День 3
      1. Промойте клетки PBS и подвергните их воздействию 500 μL 0,25% трипсина и 1 mM раствора ЭДТА при 37 °C с 5% CO₂ и контролируемой влажностью в течение 5 минут.
      2. Добавьте к клеткам 2,5 мл питательной среды и используйте переводную пипетку Пастера с прикрепленным наконечником пипетки объемом 200 мкл для приготовления суспензии для одиночных клеток.
      3. Посчитайте ячейки с помощью счетчика ячеек и засейте 1 × 10⁶ клеток на пластине 10 см. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C с 5%_CO2 и контролируемой влажности в течение 24 часов.
         Необходимо подготовить не менее 1 × 10⁶ клеток для сбора ВВ из питательной среды, необходимой для иммуноблоттингового анализа.
   4. День 4
      1. Готовят питательную среду (см. шаг 1.1.1.1), содержащую либо носитель (ДМСО), либо 100 нМ бафиломицина А1 (Baf).
      2. Подвергнуть клетки воздействию среды, содержащей либо носитель, либо 100 нМ Baf, и инкубировать их при 37 °C с 5%_CO2 и контролируемой влажностью в течение 24 часов.
   5. День 5
      1. Соберите всю питательную среду с 10-сантиметровой пластины, переложите ее в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при температуре 3000 × г в течение 10 минут при 4 °C для удаления клеточного мусора.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Остальные ячейки в 10-сантиметровой пластине будут использоваться в разделе 1.2.1.
      2. Для выделения фракции P1 EV надосадочную жидкость после центрифугирования при 3 000 × г перенесите в центрифужную пробирку, а затем центрифугируйте при 20 000 × г при 4 °C в течение 1 ч.
      3. Для выделения фракции P2 EV надосадочную жидкость после центрифугирования при 20 000 × г переносят в ультрацентрифужную пробирку, а затем центрифугируют при 110 000 × г при 4 °C в течение 1 ч.
      4. После вытирания излишков влаги внутри пробирки лабораторной салфеткой повторно суспендируйте оставшиеся гранулы в центрифужной пробирке в 50 мкл 2x буфера для проб [2,5% SDS, 125 мМ буфера Tris-HCl (pH 6,8), 30% глицерина, 10% 2-меркаптоэтанола, 0,4% бромофенола синего] для приготовления фракции P1 EV.
      5. Удалите надосадочную жидкость путем декантации, сотрите лишнюю влагу внутри пробирки с помощью лабораторной салфетки, а затем повторно суспендируйте оставшиеся гранулы в ультрацентрифугирующей пробирке в 50 мкл 2x буфера для образцов для приготовления фракции P2 EV.
      6. Инкубируйте фракции P1 и P2 EV при 100 °C на тепловом блоке в течение 10 минут.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Не встряхивайте пробирки после центрифугирования при концентрации 20 000 × г и 110 000 × г , чтобы случайно не выбросить оставшиеся гранулы. Наклонив трубку для переноса надосадочной жидкости, сохраняйте положение трубки, чтобы предотвратить повторное погружение гранулы в оставшуюся надосадочную жидкость.
2. Приготовление клеточной фракции из культивируемых клеток HeLa
   1. День 5
      1. После переноса питательной среды из 10-сантиметрового планшета в пробирку объемом 15 мл промойте клетки в 10-сантиметровой чашке PBS и подвергните их воздействию 2 мл 0,25% трипсина и 1 мМ раствора ЭДТА при 37 °C с 5%_CO2 и контролируемой влажностью в течение 5 мин.
      2. Добавьте к клеткам 8 мл питательной среды, затем с помощью пипетки Пастера с наконечником пипетки объемом 200 мкл пипетки пипетки и приготовьте суспензию для одиночных клеток.
      3. Перенесите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при 1000 × г в течение 10 мин при 4 °C.
      4. Удалите надосадочную жидкость с помощью аспиратора, добавьте PBS в клеточную гранулу, а затем центрифугируйте при 1000 × г в течение 5 минут при 4 °C.
      5. Удалите PBS с помощью аспиратора и обработайте клеточную гранулу ультразвуком в 1 мл буфера A68 [10 мМ буфера Tris-HCl, pH 7,5, 0,8 M NaCl, 1 мМ этиленгликоля бис(β-аминоэтиловый эфир)-N,N,N,N-тетрауксусной кислоты (EGTA)], содержащей 1% саркозил.
      6. Измерьте концентрацию белка в клеточном лизате с помощью набора для анализа белка BCA.
      7. Смешайте 300 мкл клеточного лизата со 100 мкл 4x буфера для образцов и инкубируйте смесь при 100 °C на тепловом блоке в течение 10 мин для приготовления клеточной фракции.

2. Иммуноблоттинг-анализ

1. Разделите эквивалентные количества белков в образцах с помощью SDS-PAGE¹⁸.
2. Перенесите разделенные белки на мембраны из поливинилидендифторида (PVDF).
3. После переноса заблокируйте мембраны блокирующим агентом на 20 минут.
4. Инкубируйте заблокированную мембрану в течение ночи с указанным первичным антителом в трис-буфере, содержащем 10% (v/v) сыворотки теленка, в режиме ЛТ.
5. Промывайте мембрану Трис-буфером в течение 5 с, а затем инкубируйте ее с биотин-конъюгированным вторичным антителом при ЛТ в течение 2 ч.
6. Промывайте мембрану Трис-буфером в течение 5 с, а затем инкубируйте ее с Трис-буфером, содержащим 0,4% (v/v) растворы A и раствор B из набора при RT в течение 1 ч.
7. Промойте мембрану PBS, а затем инкубируйте ее с PBS, содержащим 0,04% (w/v) диаминобензидина, 0,8% (w/v) NiCl₂·6H₂O и 0,3% (v/v) H₂O₂ для колориметрического обнаружения полос.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для детектирования сигналов также приемлем метод хемилюминесценции.
8. Оцифровать изображение мембраны с помощью сканера и подвергнуть его денситометрическому анализу с помощью Фиджи.
   1. Откройте оцифрованное изображение с помощью Fiji и преобразуйте цветное изображение RGB в 8-битное изображение, нажав Изображение | Тип | 8-битный.
   2. Нажмите на инструмент прямоугольника и отрегулируйте размер прямоугольника, перетащив его, чтобы окружить полосы. Определите канал для анализа, нажав кнопку Анализ | Гели | Выберите Первая полоса.
   3. Расположите прямоугольник на втором и последующих каналах и определите каналы для анализа, нажав кнопку Анализ | Гели | Выберите «Следующая полоса».
   4. После распознавания конечного канала измерьте денситометрию поперек прямоугольника, нажав кнопку Анализ | Гели | Сюжетные дорожки.
   5. Окружите сигнальную область полосы прямой линией, щелкните инструмент «палочка» и щелкните в этой области, чтобы рассчитать интенсивность сигнала полосы.

3. Анализ количества аутофагосом и аутолизосом

1. День 1
   1. Подсчитайте количество клеток HeLa с помощью счетчика клеток и засейте 1 ×^{10 5} клеток HeLa, экспрессирующих LAMP1-GFP и mCherry-LC3, на чашке диаметром 3,5 см. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C с 5%_CO2 и контролируемой влажности в течение 24 часов.
2. День 2 (по желанию)
   1. Выполняйте действия, описанные в разделе 1.1.2, в посуде диаметром 3,5 см.
3. День 3
   1. Выбросьте питательную среду из посуды диаметром 3,5 см.
   2. Промойте камеры PBS, подвергните их воздействию 400 μL 0,25% трипсина и 1 mM раствора ЭДТА и инкубируйте при 37 °C с 5%_CO2 и контролируемой влажностью в течение 5 минут.
   3. Добавьте к клеткам 1,6 мл питательной среды, и пипетируйте их с помощью пипетки Пастера для переноса для приготовления одноклеточной суспензии.
   4. Подсчитайте количество ячеек с помощью счетчика ячеек и засейте 1 × 10⁴ ячейки на 8-камерный покровный лист. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C с 5%_CO2 и контролируемой влажности в течение 24 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Две лунки камерного покровного стекла подготавливаются для контрольных и монтажных камер STX6, соответственно, после обработки ДМСО или Baf, как описано в разделе 3.4.2.
4. День 4
   1. Приготовьте питательную среду без фенола красного (DMEM без фенола красного, 10% FBS, 1% пенициллина/стрептомицина), содержащую либо носитель (ДМСО), либо 100 нМ Baf, растворенный в ДМСО.
   2. Заменяйте питательную среду средой без фенольного красного, содержащей либо носитель, либо 100 нМ Baf, и инкубируйте в течение 4 ч.
      Примечание: Чтобы оценить влияние Baf на количество аутофагосом и аутолизосом, подготовьте клетки, обработанные носителем, в качестве контроля.
   3. Окрашивание ядер 0,33 мкг/мл Hoechst 33342 в течение 30 мин перед наблюдением.
   4. Проведите визуализацию живых клеток с помощью объектива с 60-кратным увеличением на конфокальном лазерном микроскопе и сделайте десять разных кадров.
      1. Откройте объединенное изображение RGB на Фиджи и разделите его на соответствующие красный, зеленый и синий компоненты изображения, нажав на Изображение | Цвет | Разделение каналов.
      2. Установите постоянный порог для красного и зеленого сигналов на каждом изображении, нажав Изображение | Настройка | Пороговое значение для каждого эксперимента.
      3. Подсчитайте количество областей, положительных для красных или зеленых сигналов, нажав «Анализировать» | Анализируйте частицы. Установите флажок «Суммировать », затем нажмите «ОК». Запишите значения из подсчета , чтобы определить везикулы, связанные с аутофагосомами и лизосомами.
      4. Чтобы наложить зеленое изображение на красное изображение, установите режим передачи в положение И , нажав Редактировать | Управление вставкой. Скопируйте зеленое изображение, а затем вставьте его на красное изображение, чтобы объединить их, выделив области, которые положительно влияют как на красный, так и на зеленый сигналы.
      5. Чтобы определить числа автолизосом, подсчитайте количество областей, положительных как для красных, так и для зеленых сигналов, нажав «Анализировать» | Анализируйте частицы. Установите флажок Суммировать , нажмите OK и запишите значения в разделе Количество , чтобы определить везикулы, связанные с аутофагосомами и лизосомами.
   5. Разделите общее количество аутолизосом и аутофагосом на общее количество клеток, чтобы рассчитать количество аутолизосом и аутофагосом на клетку.
      Примечание: Насчитайте, по крайней мере, 35 клеток в каждом из трех независимых экспериментов.

4. Анализ на образование омегасом

1. День 1
   1. Подсчитайте количество клеток HeLa с помощью счетчика клеток и высадите 1 × 10⁵ клеток на чашку диаметром 3,5 см. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C с 5%_CO2 и контролируемой влажности в течение 24 часов.
2. День 2 (по желанию)
   1. Выполните действия, описанные в разделе 1.1.2.
3. День 3
   1. Приготовьте одноклеточную суспензию, как описано в шагах 3.3.1-3.3.2.
   2. Посчитайте ячейки с помощью счетчика ячеек, и высадите 1 ×^{10 5} клеток на чашку диаметром 3,5 см. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C с 5%_CO2 и контролируемой влажности в течение 24 часов.
4. День 4
   1. Смешайте 1 г pEGFP-C1-hAtg13, 3 мкл реагента для трансфекции ДНК и 100 мкл восстановленной сывороточной среды в пробирке с низким уровнем удерживания. Выдержите смесь в течение 20 минут, затем добавьте ее в культивированную среду.
   2. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C с 5%_CO2 и контролируемой влажности в течение 24 часов.
5. День 5
   1. Трипсинизируйте клетки, как описано в шагах 3.3.1-3.3.2.
   2. Добавьте в клетки 2,5 мл питательной среды. Пипеткой смеси с помощью переводной пипетки Пастера для приготовления одноклеточной суспензии.
   3. Подсчитайте ячейки с помощью счетчика ячеек и засейте 1 ×^{10 4} ячейки на 8-камерном покровном листе. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C с 5%_CO2 и контролируемой влажности в течение 24 часов.
6. День 6
   1. Выполните шаги 3.4.1-3.4.4 для проведения визуализации живых клеток из шага 4.5.3 с использованием конфокального лазерного микроскопа. Захватите десять разных кадров изображений.
      1. Выполните шаги 3.4.4.1-3.4.4.3, чтобы разделить объединенные изображения RGB на соответствующие красные, зеленые и синие компоненты, установить постоянный порог для зеленых сигналов в каждом изображении и определить интенсивность сигнала GFP. Запишите значения из раздела Total Area (Общая площадь ), чтобы определить интенсивность сигнала GFP-ATG13.
      2. Разделите общую интенсивность сигнала на количество исследованных клеток, чтобы рассчитать интенсивность сигнала на ячейку.
         Примечание: Насчитайте, по крайней мере, 34 клетки в каждом из трех независимых экспериментов.

Результаты

Как было показано в предыдущих исследованиях, обработка Baf повышала уровни TSG101 (P1: P < 0,01, P2: P = 0,012, что определяется по двустороннему ANOVA в EZR¹⁹) и LC3-II (P1: P < 0,01, P2: P < 0,01, как определяется по двустороннему ANOVA в EZR¹⁹) в фракции, богатой EV. Примечательно, что обработка Baf также повышала уровни STX6 (P1: P < 0,01, P2: P < 0,01, как определено по двустороннему ANOVA в EZR¹⁹) во фракции EV (рис. 1A), что позволяет предположить, что STX6 может быть компонентом EV. Пролиферирующий клеточный ядерный антиген (PCNA) не наблюдался во фракции EV. Иммуноблоттинг STX6 в клеточной фракции показал, что уровни STX6 снижались вдвое с его нокдауном миРНК (рис. 1B). Нокдаун STX6 не влиял на уровни TSG101 в клетке и фракциях EV как в условиях обработки автомобиля, так и в условиях обработки Baf (рис. 1C). Однако нокдаун STX6 повышал уровни LC3-II в клеточной фракции в условиях, обработанных носителем, но не в условиях, обработанных Baf. Нокдаун STX6 также повышал уровень LC3-II во фракции EV в условиях, обработанных Baf (рис. 1D). Эти результаты свидетельствуют о том, что методы, используемые для выявления LC3-II у ВВ с помощью иммуноблоттинга, являются достаточно чувствительными, даже если эффективность нокдауна незначительна. Кроме того, эти результаты указывают на то, что нокдаун STX6 увеличивает количество внутриклеточных аутофагосом и усиливает внеклеточное высвобождение везикул, связанных с аутофагосомами, при лечении Baf.

Для дальнейшего изучения того, влияет ли нокдаун STX6 на количество внутриклеточных аутофагосом и аутолизосом, аутофагосомы и лизосомы были визуализированы с помощью маркера аутофагосом mCherry-LC3 и маркера лизосом LAMP1-GFP. Конфокальная визуализация живых клеток выявила GFP- и mCherry-положительные везикулы в клетках HeLa, экспрессирующих LAMP1-GFP и mCherry-LC3 (рис. 2A). Аутолизосомы были идентифицированы как GFP- и mCherry-положительные везикулы, в то время как аутофагосомы были идентифицированы как GFP-отрицательные и mCherry-положительные везикулы. Нокдаун STX6 увеличивал количество аутофагосом и аутолизосом в условиях, обработанных транспортным средством (рис. 2B, C). Тем не менее, нокдаун STX6 не влиял на количество аутофагосом и аутолизосом в условиях, обработанных Baf (рис. 2B, C).

Чтобы определить, является ли увеличение числа внутриклеточных аутофагосом из-за нокдауна STX6 результатом усиленного формирования аутофагосом, с помощью интенсивности сигнала маркера омегасом GFP-ATG13 изучали образование омегасом, процесс, необходимый для формирования аутофагосом. Конфокальная визуализация живых клеток позволила получить собранное изображение GFP-ATG13, указывающее на образование омегасом (рис. 3A). Нокдаун STX6 снижал интенсивность сигнала GFP-ATG13 (P = 0,023, что определяется по двустороннему ANOVA в EZR¹⁹). В то время как нокдаун STX6 не оказывал существенного влияния на интенсивность сигнала GFP-ATG13 в условиях, обработанных транспортным средством, он значительно снижал сигнал в условиях, обработанных Baf (рис. 3B). В совокупности эти результаты указывают на то, что нокдаун STX6 увеличивает высвобождение положительных везикул LC3-II, связанных с накоплением везикул, связанных с аутофагосомами.

Рисунок 1: Результаты иммуноблоттинга клеточных, P1 и P2 фракций из клеток HeLa, трансфицированных либо контрольной группой, либо миРНК STX6 под воздействием носителя или Baf. Клетки HeLa обрабатывали транспортным средством (DMSO) или 100 нМ Baf в течение 24 ч после трансфекции контролем или миРНК STX6. Были выделены ячейки, фракции P1 (20 000 × г гранул) и P2 (110 000 × г гранул). (A) Репрезентативные иммуноблоттинговые изображения каждой фракции, показывающие STX6, TSG101, LC3 и PCNA. (Б-Г) Денситометрический анализ на (B) STX6, (C) TSG101 и (D) LC3-II проводили по изображениям иммуноблоттинга. Интенсивность сигнала нормализовали к контрольным или трансфицированным миРНК клеткам STX6, обработанным носителем или Baf. Гистограммы представляют средние значения ± S.E.M. (N = 3). * указывает на P < 0,05 по двустороннему непарному t-критерию в Excel. Сокращения: STX6 = синтаксин 6; Baf = бафиломицин А1; ДМСО = диметилсульфоксид; TSG101 = ген восприимчивости к опухоли 101; LC3 = ассоциированные с микротрубочками белки 1A/1B легкой цепи 3B; PCNA = ядерный антиген пролиферирующей клетки; S.E.M. = стандартная ошибка среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Анализ конфокального изображения клеток HeLa, совместно экспрессирующих Lamp1-GFP и mCherry-LC3, трансфицированных с помощью контрольной или STX6 миРНК в условиях, обработанных носителем и Baf. (A) Конфокальные изображения клеток HeLa, стабильно экспрессирующих LAMP1-GFP и mCherry-LC3, трансфицировали с помощью контрольной миРНК или миРНК STX6 в течение 48 ч с последующим воздействием ДМСО или 400 нМ Baf в течение 4 ч. Масштабная линейка = 20 мкм. (B,C) Кнатификация (B) аутофагосом (LAMP1-GFP отрицательные и mCherry-LC3 положительные точки) и (C) аутолизосом (LAMP1-GFP и mCherry-LC3 двойные положительные точки) проводилась с использованием программного обеспечения Fiji. Данные на гистограммах представлены в виде средних значений ± S.E.M. (N = 3). * указывает на P < 0,05 на основе двустороннего непарного t-критерия в Excel. Сокращения: Lamp1 = лизосомно-ассоциированный мембранный белок 1; LC3 = ассоциированные с микротрубочками белки 1A/1B легкой цепи 3B; STX6 = синтаксин 6; Baf = бафиломицин А1; GFP = зеленый флуоресцентный белок; S.E.M. = стандартная ошибка среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Конфокальная визуализация клеток HeLa, экспрессирующих GFP-ATG13, трансфицированных либо контрольной миРНК, либо миРНК STX6 и подвергнутых лечению носителем или Baf. (A) Клетки HeLa трансфицировали контрольной миРНК или миРНК STX6 с последующей трансфекцией pEGFP-C1-hAtg13 и обрабатывали ДМСО или 400 нМ Baf в течение 4 ч. Масштабная линейка = 20 мкм. (B) Относительная интенсивность сигнала определялась путем нормализации сигнала в каждом состоянии до сигнала контрольных клеток, трансфицированных миРНК, обработанных Baf. Гистограмма показывает данные в виде средних значений ± S.E.M. (N = 3). * указывает P < 0,05 по двухстороннему непарному t-критерию в Excel. Сокращения: hAtg13 = ген, связанный с аутофагией человека 13; STX6 = синтаксин 6; Baf = бафиломицин А1; ДМСО = диметилсульфоксид; S.E.M. = стандартная ошибка среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительный рисунок S1: Иммуноблоттинг клеточных, P1 и P2 фракций из клеток HeLa, трансфицированных контрольной миРНК и обработанных Baf. Клетки HeLa трансфицировали контрольной миРНК и подвергали воздействию 100 нМ Baf в течение 24 ч. Затем были получены фракции: ячейка, Р1 (20 000 × г гранул) и Р2 (110 000 × г гранул). Репрезентативные иммуноблоттинговые изображения ULK1 и PCNA, показывающие их уровни в каждой фракции для сравнения. Сокращения: Baf = бафиломицин А1; ULK1 = unc-51, как аутофагия, активирующая киназу 1; PCNA = ядерный антиген пролиферирующей клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Исследование иммуноблоттинга выявило уровни LC3-II и TSG101 в клеточной фракции, богатой микровезикулами фракцией P1 EV и богатой экзосомами фракцией P2 EV. Визуализация живых клеток была использована для изучения аутофагосом, аутолизосом и омегасом, что дало представление о том, влияет ли нокдаун STX6 на аутофагию. Эти комбинированные результаты свидетельствуют о том, что нокдаун STX6 влияет на высвобождение LC3-II положительных EV, потенциально связанных с нарушением регуляции пути аутофагии. Ключевым преимуществом этого метода является его способность различать большие и маленькие электромобили, поступающие из разных источников. Анализ проточной цитометрии с использованием специфических маркеров микровезикул, экзосом или аппарата Гольджи может дополнительно прояснить, как нокдаун STX6 влияет на высвобождение положительных везикул LC3-II.

Тем не менее, ограничением исследования иммуноблоттинга является то, что остается неясным, связано ли наблюдаемое повышение уровней LC3-II во фракции EV после нокдауна STX6 при лечении Baf увеличением количества высвобождаемых положительных везикул LC3-II или повышением уровня LC3-II на EV. Чтобы различить эти возможности, подсчет везикул с помощью анализа отслеживания наночастиц или анализа проточной цитометрии может помочь определить, увеличивается ли количество положительных везикул LC3-II или повышаются уровни LC3-II на везикулу.

Важнейшим этапом протокола является фракционирование культивируемой среды для получения фракции EV. EV наблюдаются как крошечные гранулы в центрифужной трубке. Для приготовления сопоставимой фракции EV важно осторожно перенести или отбросить надосадочную жидкость после центрифугирования, чтобы избежать разбавления концентрации белка в гранулах EV. Для изучения контаминации из клеточной фракции во фракцию EV сравнивали уровни цитоплазматического белка, unc-51-подобной киназы, активирующей аутофагию 1 (ULK1), и ядерного белка PCNA между фракциями в этом исследовании (дополнительный рисунок S1). Концентрация белка в клеточной фракции обычно отражает количество клеток, но на концентрацию клеточного белка влияют стадии^{клеточного цикла 20} или нарушения протеостаза²¹. Аутофагия имеет решающее значение для поддержания протеостаза²². Нарушение регуляции аутофагии при нокдауне STX6 или лечении Baf может изменить концентрацию белка независимо от количества клеток.

Нокдаун STX6 достигается за счет трансфекции миРНК, а сверхэкспрессия GFP-ATG13 достигается за счет трансфекции ДНК. Эффективность трансфекции зависит от типа, плотности и количества клеток. Эффективное выравнивание последовательностей миРНК также может влиять на эффективность нокдауна. Корректировки необходимы, когда эффективность трансфекции низкая.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что нокдаун STX6 повышал уровень маркера аутофагосом LC3-II во фракции EV в условиях, обработанных Baf, но не влиял на уровни TSG101. Это говорит о том, что STX6 подавляет высвобождение везикул, полученных из аутофагосом, но не из MVBs, когда ингибируется слияние аутофагосом и лизосом.

Нокдаун STX6 также повышал уровень LC3-II в клетках в условиях роста, предполагая, что STX6 регулирует аутофагию. Действительно, нокдаун STX6 увеличивал количество аутофагосом и аутолизосом, в то время как он не усиливал образование омегасом. Созревание аутолизосом вызывает аутофагическую реформацию лизосом²³. Возможно, что STX6 опосредует процесс созревания аутолизосом, и потеря его функции может увеличить количество незрелых аутолизосом, что приводит к нарушению регуляции слияния аутофагосом и лизосом из-за подавления реформирования аутофагических лизосом.

Обработка Baf повышала уровень STX6 во фракции EV, даже когда его экспрессия была снижена. Предыдущие исследования показали, что связанные с аутофагосомами везикулы высвобождаются в виде ВВ при ингибировании лизосомальной функции^13,14. Известно, что STX6 локализуется в аутофагосом-ассоциированных везикулах, таких как стрептококк группы А (GAS), содержащий аутофагосомоподобные вакуоли²⁴. Таким образом, STX6 может быть локализован в аутофагосом-ассоциированных везикулах, которые высвобождаются в виде EV при ингибировании слияния аутофагосом и лизосомы.

Распространение патологии TDP-43 тесно связано с прогрессированием БАС и FTLD-TDP³. Хотя остается неясным, как патология TDP-43 распространяется по головному и спинному мозгу, путь EV может опосредуть ее распространение. Предыдущие исследования показали, что нарушение регуляции пути аутофагии-лизосом приводит к высвобождению LC3-II положительных EV, содержащих TDP-43¹³. Настоящее исследование предполагает роль STX6 в регуляции высвобождения EV при ингибировании слияния аутофагосом и лизосом. Методология оценки уровней LC3-II в клетках и фракций EV с помощью иммуноблоттинга должна оказаться полезной в будущих исследованиях.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,25 % трипсин ЭДТА	Fujifilm Wako	201-16945
10 см Тарелка	Thermo Fisher Scientific	150464
15 мл Туба	Thermo Fisher Scientific	339650
200 μ L наконечник для пипетки	Nippon Genetics	FG-301	пипетирование
2-меркаптоэтанола	Nacalai Tesque	21417-52	материал для пробного буферного раствора
3,3'-диаминобензидина тетрагидрохлорида	Nacalai Tesque	11009-41	материал для DAB раствора
3,5 см Dish	Thermo Fisher Scientific	150460
6 см Тарелка	TrueLine	TR4001
Алюминиевые блочные термостатические ванны (сухие термованны)	EYELA	273860
Аспиратор	SANSYO	SAP-102	ингаляционный раствор
Avanti JXN-30	Beckman Coulter	B34193
Бафиломицин A1	Адипоген	BVT-0252
Биотин-конъюгированный козий антикролик IgG	Антитела Вектор Лаборатории	BA-1000	2-е антитело для иммуноблоттинга
биотин-конъюгированное Horse Antimouse IgG антитела	Vector Laboratories	BA-2000	2-е антитело для иммуноблоттинга
Блокирующее One	Nacalai Tesque	03953-95	материал для иммуноблоттинга
Bromophenol Blue	Nacalai Tesque	05808-61	материал для образец буферного раствора
Calf Serum	cytiva	SH30073.03
CanoScan LiDE 220	Canon	CSLIDE220	Scanner
Центрифуга 5702 R	eppendolf	5703000039
предметные стекла для подсчета двухкамерных	био-рад	1450015J	подсчет клеток
Цифровой сонификатор 450	BRANSON
Диметилсульфоксид	nacalai tasque	09659-14	транспортное средство
DMEM High Glucose	Nacalai Tesque	08458-45	питательная среда
DMEM без фенола красного	Nacalai Tesque	08489-45	питательная среда
EGTA	Dojindo	348-01311	материал для решения А68
Excel	Microsoft	версия 16.16.27	сатинистический анализ
EZR	Ссылка No 24	версия 1.68	сатисальный анализ
FBS	Sigma	173012	Культуральная среда
	Фиджи NIH		Инструмент анализа изображений
Глицерин	Nacalai Tesque	09886-05	материал для буферного раствора для проб
Hoehst33342	Dojindo	H342
Перекись водорода	Fujifilm Wako	080-0186	материал для DAB раствор
Kimwipe S-200	NIPPON PAPER CRECIA	62011	чистящая салфетка
Трубка с низким удержанием	Nippon Genetics	FG-MCT015CLB	миРНК и трансфекция ДНК
LSM780 Конфокальный лазерный микроскоп Carl	Zeiss
Моноклональная мышь Anti-LC3 Антитело	MBL	M186-3	1-е антитело для иммуноблоттинга
Гексагидрат хлорида никеля(II)	Fujifilm Wako	149-01041	материал для раствора DAB
N-лауроилсаркозин Натриевая соль	Nacalai Tesque	20117-12
Optima XE-90 Ультрацентрифуга	Beckman Coulter	A94471
Opti-MEM I Уменьшенная сыворотка Medium	Thermo Fisher Scientific	31985-070	Трансфекция миРНК и ДНК
pEGFP-C1-hAtg13	Addgene	22875
Пенициллин/стрептомицин	Nacalai Tesque	26253-84	Культуральная среда
Наборы для анализа белка BCA Pierce Thermo	Fisher Scientific	23225
Поликлональное антитело кролика против PCNA	BioAcademia	70-080	1-е антитело для иммуноблоттинг
Поликлональный кролик Анти-синтаксин 6 Антитело	БелокTech	10841-1-AP	1-е антитело для иммуноблоттинга
Поликлональный кролик Anti-TSG101 Антитело	БелокTech	28283-1-AP	1-е антитело для иммуноблоттинга
Поликлональный кролик Anti-ULK1 Антитело	ProteinTech	20986-1-AP	1-е антитело для иммуноблоттинга
Поливинилидендифторид Мембрана	Milliore	IPVH00010	материал для иммуноблоттинга
R R	разработка основной команды	версии 4.4.1	сатистиальный анализ
RNAiMAX	Thermo Fisher Scientific	13778	миРНК реагент для трансфекции миРНК
STX6	Thermo Fisher Scientific	HSS115604	миРНК для трансфекции
хлорид натрия	Nacalai Tesque	31320-05	материал для буфера Tris и раствора A68
Sodium Dodecyl Sulfate	Fujifilm Wako	192-13981	материал для буферного раствора
SPARK Microplate Reader	TECAN
Stealth RNAi Negative Control Duplexes, Med GC	Thermo Fisher Scientific	12935300	миРНК трансфекция сахарозы
	Fujifilm Wako	193-00025	материал для решения A68
TC20 Автоматический счетчик клеток с термопринтером	Bio-Rad	1450109J1	подсчет клеток
Термобат	TOKYO RIKAKIKAI	MG-3100	инкубационный
TransIT-293	Mirus Bio	MIR 2700	реагент для трансфекции ДНК
TransIT-LT1	Mirus Bio	MIR2300	реагент
для трансфекции ДНКТрис(гидроксиметил)аминометан	Nacalai Tesque	35406-75	материал для Трис-буфера, буфера для образцов и раствора А68
Трипановый синий краситель 0,40%	Bio-Rad	1450021	подсчет клеток
Ультра-Прозрачная Открытая Пробирка, 16 x 96мм	Beckman Coulter	361706	сбор для фракции P1 EV
Ultra-Clear Tube, 14 x 89 мм	Beckman Coulter	344059	сбор для фракции P2 EV
Vectastain ABC Standard Kit	Vector Laboratories	PK-4000	иммуноблоттинг
Бутылка для мытья	одна	1-4640-02	Моющая мембрана
μ-Slide 8 Well Высокий	уровень ibidi	80806