Флуоресцентное мечение концов и инкапсуляция длинных РНК для одномолекулярной микроскопии FRET-TIRF

Краткое содержание

В данной статье описывается двухцветное мечение длинных РНК в конечных положениях и их поверхностная иммобилизация путем инкапсуляции в фосфолипидные везикулы для применения в одномолекулярной микроскопии FRET TIRF. Сочетание этих методов позволяет точно визуализировать и анализировать динамику РНК на уровне отдельных молекул.

Аннотация

Одномолекулярный резонансный перенос энергии Фёрстера (smFRET) превосходно подходит для изучения динамических биомолекул, позволяя точно наблюдать за их конформационными изменениями с течением времени. Для мониторинга динамики РНК с помощью smFRET мы разработали метод ковалентного мечения РНК на их концах парой флуорофоров FRET. Эта стратегия прямого мечения концевого мечения нацелена на 5'-фосфат путем активации карбодиимидом (EDC)/N-гидроксисукцинимидом (NHS) и 3'-рибозу путем окисления периодата, которые могут быть адаптированы к другим РНК независимо от их размера и последовательности для их изучения независимо от искусственных модификаций. Кроме того, активация 5'-EDC/NHS представляет общий интерес для всех нуклеиновых кислот с 5'-фосфатом. Использование коммерчески доступных химических веществ избавляет от необходимости синтезировать РНК-специфичные зонды.

Флуоресцентная микроскопия с полным внутренним отражением (TIRF) требует, чтобы исследуемые молекулы с поверхностной иммобилизацией находились в пределах затухающего поля, которое должно быть освещено. Изощренный способ удержания молекул РНК в исчезающем поле заключается в их инкапсуляции в фосфолипидные везикулы. Инкапсуляция сочетает в себе лучшее из обоих миров, связывая молекулу с поверхностью и обеспечивая свободную диффузию молекулы. Мы гарантируем, что каждый везикула содержит только одну молекулу РНК, что позволяет визуализировать одну молекулу. После двустороннего мечения и инкапсуляции интересующей РНК измерения smFRET позволяют получить динамическое и подробное представление о поведении РНК.

Введение

Резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) — это мощный и чувствительный метод для изучения меж- и внутримолекулярных взаимодействий биомолекул на наноуровне. Он основан на безызлучательном переносе энергии от возбужденной молекулы-донора к ближайшей акцепторной молекуле, который происходит на расстояниях, как правило, от 1 нм до 10 нм. Расстояние между донорным и акцепторным красителями определяет эффективность этого переноса энергии, что делает FRET бесценным инструментом для изучения молекулярной динамики, конформационных изменений и взаимодействий в широком спектре биологических систем ^1,2, включая РНК. Флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения (TIRF) оказалась мощным методом для исследований smFRET, поскольку она избирательно освещает молекулы только вблизи поверхности, что позволяет получать динамику FRET отдельных молекул с высоким пространственным и временным разрешением. Однако перед проведением экспериментов smFRET-TIRF интересующая молекула должна быть сначала флуоресцентно помечена соответствующей парой FRET, а затем иммобилизована на поверхности микроскопии. Описанный здесь протокол smFRET-TIRF был валидирован с использованием интрона Sc.ai5γ группы II дикого типа из митохондрий Saccharomyces cerevisiae, окруженного двумя его экзонными последовательностями (915 нуклеотидов)³. Более подробное представление об интронах флуоресцентного мечения II группы и их иммобилизации для микроскопии smFRET TIRF смотрите в нашем обзоре⁴.

Идеальная сайт-специфичная стратегия мечения РНК позволила бы точно встраивать донорные и акцепторные красители в заранее определенные позиции без изменения структуры или функции РНК, обеспечивая точные и эффективные измерения FRET. Это сложно из-за химического сходства между четырьмя нуклеотидами, что усложняет селективное мечение. При мечении концов донорные и акцепторные красители прикрепляются к концам РНК, нацеливаясь на 5'-фосфат и 3'-рибозу. Этот подход предлагает минимально инвазивный подход, в то же время предоставляя ценную информацию о структурной динамике и взаимодействиях. Способность интрона II группы к самосплайсингу в присутствии Mg²⁺ ограничивает использование ионозависимых ферментов металлов. В данной работе мы представляем подход к созданию длинных и каталитически активных РНК (рибозимов) с двойными концевыми метками, которые обходят необходимость в ферментах или синтезе специализированных зондов.

Распространенным подходом к связыванию молекул РНК с поверхностью для микроскопии TIRF является ковалентное связывание биотиновой группы непосредственно с РНК или гибридизация биотин-несущего антисмысловой олигонуклеотид (ASO)^5,6,7. Однако этот метод прямой иммобилизации может привести к образованию артефактов из-за взаимодействия РНК с поверхностью, что потенциально может привести к неправильному свертыванию РНК⁸. Элегантным решением для смягчения этих иммобилизационных артефактов является инкапсуляция РНК в наноразмерные фосфолипидные везикулы ^9,10,11, прикрепленные к поверхности. Эти везикулы, имеющие приблизительно 100 нм в диаметре, закреплены на поверхности через биотин-стрептавидиновую связь 12,13,14, что позволяет РНК свободно диффундировать внутрь, обеспечивая при этом обмен ионами через липидную мембрану ¹⁰. После ковалентного мечения большой функциональной РНК³ мы представляем подход к инкапсуляции таких РНК в фосфолипидные везикулы путем комбинации установленных протоколов поверхностной пассивации и инкапсуляции везикул, адаптированных для сохранения функциональности РНК 10,11,14. Этот подход к двусторонней маркировке и инкапсуляции позволяет достичь высокой скорости моноинкапсуляции функциональных РНК для микроскопии smFRET TIRF.

Протокол

1. Двойная маркировка РНК

Примечание: Следующий протокол описывает сайт-специфичное мечение РНК парой флуорофоров FRET путем ковалентного присоединения донорского красителя (sCy3) к 5'-фосфату и акцепторного красителя (Cy5) к 3'-рибозе. В качестве представляющей интерес РНК выбрана каталитически активная длинная РНК, интрон II группы рибозим. В таблицах 1 и на рисунке 1 обобщен этот протокол двусторонней маркировки. Выполняйте все действия с использованием флуорофоров в условиях темноты.

День 0	▪ Аликвота 50-75 мкг РНК на общий объем 55 мкл на 1,5 мл пробирки.
День 1	Активация 5'-фосфата
	▪ Добавьте 45 мкл свежеприготовленного раствора EDC-NHS, pH 6.0 к РНК в ddH2O до конечного объема 100 μл, хорошо перемешайте и инкубируйте в течение 4 ч при 25 °C и 500 об/мин.
	▪ Очистительный раунд 1: Ночное осаждение EtOH.
День 2	▪ Осадите 5'-активированную РНК, промойте и высушите.
	Насадка для красителя 5 футов
	▪ Ресуспендировать в 95 мкл 100 мМ MOPS, pH 7,5.
	▪ Добавьте 5 мкл 2 мМ раствора амин-функционализированного красителя.
	▪ Хорошо перемешайте и выдерживайте в течение 16 часов при температуре 25 °C и 500 об/мин.
День 3	▪ Этап очистки 2: осаждение EtOH.
День 4	▪ Осадите 5'-активированную РНК, промойте и высушите.
	Шаг блокировки
	▪ Ресуспендировать в 100 мкл 100 мМ Tris–HCl, pH 7,5 и инкубировать в течение 2 ч при 25 °C и 500 об/мин.
	▪ Этап очистки 3: Центробежная фильтрация.
	→ Элуируйте 5'-меченую РНК.
День 5	3'-Периодатное окисление
	▪ Инкубируйте РНК с 20 мМ NaIO4 в 50 мМ буфере NaOAc, pH 5,5 в конечном объеме 100 мкл в течение 2 ч при 25 °C и 500 об/мин.
	▪ Утолите избыток периодата: добавьте 30 μл 50% глицерина, хорошо перемешайте и выдерживайте в течение 30 минут при температуре 25 °C и 500 об/мин.
	▪ Этап очистки 4: Ночное осаждение EtOH.
День 6	▪ Осаждайте 3'-окисленную РНК, промойте и высушите.
	3'-Насадка для красителя
	▪ Ресуспендировано в 95 мкл 50 мМ NaOAc, pH 6,0.
	▪ Добавьте 5 мкл 2 мМ раствора гидразид-функционализированного красителя. Хорошо перемешайте и выдерживайте в течение 16 часов при температуре 25 °C и 500 об/мин.
День 7	▪ Круг очистки 5: осаждение EtOH.
День 8	▪ Осаждайте помеченную РНК, промойте и высушите.
	▪ Центробежная фильтрация.
	→ Элюируйте двустороннюю меченую РНК.

Таблица 1: Резюме протокола для двустороннего мечения РНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Рисунок 1: Экспериментальный процесс двустороннего мечения с нацеливанием на 5'-фосфат и 3'-рибозу. 5'-фосфат активируется с помощью EDC в присутствии NHS и впоследствии соединяется с аминофункционализированным красителем. 3'-диоловая часть РНК окисляется за счет активности периодата до диальдегида, который в дальнейшем вступает в реакцию с гидразид-функционализированным красителем. При двусторонней маркировке важно начать с 5'-маркировки, чтобы предотвратить перекрестную маркировку, а затем 3'-маркировки с промежуточным этапом блокировки. Сокращения: EDC = карбодиимид; NHS = N-гидроксисукцинимид; MOPS = 3-морфолинопропан-1-сульфоновая кислота; NaOAc = ацетат натрия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

1. 5'-концевая маркировка: нацеливание на 5'-фосфат с помощью активации EDC/NHS
   Примечание: Этот метод 5'-мечения применим не только к РНК, но и к любой одноцепочечной нуклеиновой кислоте, содержащей 5'-фосфат. Специфичность реакции определяется зависимостью от pH, что позволяет использовать только 5'-фосфат в качестве сайт-специфичного мишени, несмотря на присутствие нескольких фосфатов в остове РНК. При pH 6,0 уникальная реакционная способность 5'-фосфата по отношению к карбодиимидам обусловлена его специфическим состоянием протонирования, при котором два кислорода депротонированы, а один остается протонированным. Это делает 5'-фосфат реакционноспособным, в то время как полностью депротонированные фоновые фосфаты остаются нереакционноспособными, что позволяет селективно мечить 5'-конец с помощью таргетирования EDC/NHS.
   1. Приготовьте раствор EDC-NHS-NaOAc, pH 6,0. Смешайте 1,5 мг EDC и 2,0 мг NHS на аликвоту с 35 μL ddH₂O и 10 μL 0,5 M NaOAc, pH 6,0 (pH скорректирован с помощью ледяной уксусной кислоты).
   2. Аликвотируйте интересующую РНК примерно 50-75 мкг РНК на пробирку в 55 мкл ddH₂O. Добавьте к РНК 45 мкл смеси EDC-NHS-NaOAc, pH 6,0, достигнув общего объема 100 мкл с конечными концентрациями 78 мМ EDC, 174 мМ NHS и 50 мМ NaOAc, pH 6,0. Выдерживать в течение 4 ч при температуре 25 °C и встряхивать при 500 об/мин.
      Примечание: Здесь 70 мкг соответствует 250 пмоль транскрибируемой in vitro 915 нт РНК и 2,5 мкМ в конечном реакционном объеме 100 мкл.
   3. Раунд 1: Очистите 5'-фосфат-активированную РНК осаждением EtOH.
   4. Приготовьте в воде раствор сульфированного цианина3 амина (sCy3-амина) в концентрации 2 мМ.
   5. Ресуспендируйте активированную РНК-гранулу в 95 мкл 100 мМ буфера 3-морфолинопропан-1-сульфоновой кислоты (MOPS), pH 7,5 (pH скорректирован с помощью NaOH). Добавьте 5 мкл 2 мМ раствора sCy3-амина к активированной РНК. Соедините флуорофор с активированным 5'-фосфатом путем инкубации в течение 16 ч при 25 °C, встряхивая при 500 об/мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Храните буфер для швабры при температуре 4 °C в темноте. NaOH выбран для коррекции pH, чтобы интрон группы II рибозим оставался неактивным. Во флуорофоре должно быть не менее чем в 40 раз больше РНК.
   6. Раунд очистки 2: Увеличьте объем, добавив 200 мкл ddH₂O для улучшения сепарации. Очистите меченную 5'-фосфатом РНК с помощью осаждения EtOH и повторяйте до тех пор, пока надосадочная жидкость не станет бесцветной (обычно требуется два раунда).
   7. Этап блокирования: Ресуспендировать РНК в 100 мкл 100 мМ Tris-HCl, pH 7,5, и инкубировать в течение 2 ч при 25 °C и 500 об/мин. Только для 5'-концевой одиночной мечения пропустите этап блокирования, ресуспендируйте РНК в ddH₂O и перейдите к шагу 1.1.8. Однако, для простоты, если используется двойная маркировка, отделите 5'-концевой блок управления с одной меткой только после шага 1.1.9.
      Примечание: Этот этап служит для блокирования активированных 5'-фосфатов, которые не были связаны с флюорофором, функционализированным амином, путем реакции с относительно меньшим первичным источником аминов (например, Tris) для минимизации риска перекрестного мечения с функционализированным гидразидом флуорофором, который используется для протокола 3'-концевого мечения.
   8. Раунд очистки 3: Удалите свободные красители путем промывки меченой РНК центробежной фильтрацией в общей сложности не менее 10 мл ddH₂O, затем выведите в ddH₂O.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Молекулярный порог фильтра должен составлять менее половины размера нуклеиновой кислоты. Вместо ddH₂O. Элюирование должно соответствовать инструкциям производителя, гарантируя, что образец не будет раскручен до полного высыхания.
   9. Определение концентраций РНК и конъюгатных красителей с помощью УФ-ВИД спектроскопии.
2. 3'-концевое мечение: нацеливание на 3'-рибозу путем окисления периодата
   1. Аликвотируйте меченую 5'-концевую РНК в_ddH2O для получения примерно 50-75 мкг РНК на пробирку в 90 мкл. Если объем элюирования на предыдущей стадии был высоким, что приводило к низкой концентрации, сконцентрируйте РНК путем осаждения и повторного суспендирования гранулы в ddH₂O. Добавьте 5 мкл 1,0 М буфера NaOAc, pH 5,5 (что соответствует 50 мМ NaOAc, pH 5,5 для 100 μL реакционного объема).
      Примечание: Подобно 5'-концевой одномеченой РНК, мы обычно получаем 3'-концевую одномеченую РНК в качестве контроля. Для этого немеченую РНК аликотируют так, чтобы она содержала примерно 50-75 мкг РНК на пробирку в 86 мкл_ddH2O.
   2. Добавьте 4 мкл свежеприготовленного 500 мМ раствора метапериодата натрия (NaIO₄) (что соответствует 10 мМ NaIO₄ на 100 мкл реакционного объема). Для 3'-эндовой одиночной маркировки добавьте 8 мкл стокового раствора NaIO₄ (что соответствует 20 мМ NaIO₄ для реакционного объема 100 мкл). Тщательно перемешайте и инкубируйте в течение 2 часов при температуре 25 °C, встряхивая при 500 об/мин в темноте, так как NaIO₄ светочувствительна.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не изменяйте порядок добавления и не увеличивайте время инкубации в дальнейшем, так как это может вызвать фотообесцвечивание прикрепленного донорского красителя. Используемая концентрация NaIO₄ уменьшается вдвое при двустороннем мечении, чтобы свести к минимуму гашение уже прикрепленного красителя на 5'-конце.
   3. Остановите реакцию, добавив 30 мкл 50% глицерина. Инкубировать в течение 30 минут при температуре 25 °C, встряхивая при 500 об/мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Глицерин служит диолом для гашения избытка периодата.
   4. Этап очистки 4: Добавьте 400 μL ледяной смеси осадков EtOH-NaOAc и выполните осаждение этанола.
   5. Ресуспендируйте окисленную РНК-гранулу в 95 мкл 50 мМ NaOAc, pH 6,0.
   6. Присоединение гидразид-краситель: Приготовьте раствор флуорофора, растворив несколько кристаллов гидразида цианина5 (Cy5-гидразида) в ДМСО, а затем разбавьте ddH₂O до концентрации 2 мМ. Если выбранный флуорофор является водорастворимым, приготовьте раствор в ddH₂O. Добавьте 5 мкл 2 мМ раствора гидразида Cy5 к окисленной РНК. Хорошо перемешайте и выдерживайте в течение 16 часов при температуре 25 °C, встряхивая при 500 об/мин.
      Примечание: Флуорофор должен иметь как минимум 40-кратный избыток РНК.
   7. Раунд 5 очистки: Очистите РНК с двойным концом (или 3'-концевую одинарную меченую РНК) с помощью осаждения EtOH и центробежной фильтрации, аналогично шагам 1.2.6 и 1.2.8 соответственно, и элуируйте в ddH₂O.
   8. Рассчитайте концентрацию РНК и конъюгированного красителя с помощью УФ-ВИД спектроскопии.
   9. Охарактеризовать меченую РНК с помощью аналитических анализов на основе геля, ансамблевофлуоресцентной спектроскопии (см. раздел «Репрезентативные результаты ») и/или аналитической ВЭЖХ, как показано в другом месте³.

2. Подготовка микрофлюидной камеры

ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем работать с шестью или восемью камерами одновременно. Ультразвуковая обработка проводится при комнатной температуре, если не указано иное. Этот протокол ограничивает использование органических растворителей, таких как ацетон, для предотвращения солюбилизации следовых примесей. Альтернативные варианты см. в ссылках^15,16.

1. Чистка
   1. Просверлите четыре отверстия в кварцевых предметных стеклах алмазным бурильщиком по схеме, приведенной на рисунке 2А , чтобы сформировать два канала.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что стеклянные стекла могут легко сломаться во время сверления, они являются экономичной альтернативой кварцевым предметным стеклам для объективной микроскопии TIRF, где покровное стекло является поверхностью изображения (Рисунок 2B). Это не вариант для установок TIRF на основе призмы, где предметное стекло микроскопии является поверхностью изображения из-за фоновой флуоресценции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы утилизируйте использованные микрофлюидные камеры¹⁶. Для этого погрузите использованные камеры на ночь в ацетон (оберните банку для окрашивания Coplin алюминиевой фольгой, чтобы свести к минимуму испарения) в вытяжном шкафу, а затем проведите ультразвуковую обработку в течение 5 минут. Разберите камеру и выбросьте покровные листы и наклейки. Если разборка не получается сразу, обработайте камеру ультразвуком в ацетоне еще 10 мин. Перейдите к шагу 2.1.2.
   2. Поместите просверленные кварцевые предметные стекла и примерно в два раза больше покровных стекол (так как они могут легко сломаться) в стеклянную банку для окрашивания Coplin с крышкой. Прополощите 3x с ddH₂O. Сокатывайте в ddH₂O в течение 5 минут, затем промойте 3x ddH₂O.
   3. Обработать ультразвуком в 10% растворе для чистки лабораторной посуды (см. Таблицу материалов) в течение 30 мин при температуре 50 °C. Прополощите не менее 3 раз с ddH₂O, пока пузырьки моющего средства не исчезнут. Ультразвуком в ddH₂O в течение 5 мин. Промойте 3 раза с ddH₂O.
   4. Обработать ультразвуком в 1 М растворе KOH в течение 30 минут, затем оставить на ночь. Смойте 3x с ddH₂O. Сокатывайте в ddH₂O в течение 5 минут. Промойте 3 раза с ddH₂O.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что коррозия из-за чрезмерной инкубации является проблемой, ранее поднятой Chandradoss et ^al.15, мы рекомендуем эту длительную инкубацию, которая позволяет избежать травления пираньей.
   5. Высушите слайды и покровные стекла с помощью N₂(g).
   6. Высохшие предметные стекла и покровные стекла обработать кислородным плазменным очистителем в течение 30 минут в соответствии с инструкциями производителя.
2. Аминосиланизация
   1. Приготовьте 3% раствор APTES-EtOH, тщательно перемешав 288,5 мл абсолютного EtOH, 1,5 мл ddH₂O и 9 мл (3-аминопропил)триэтоксисилана (APTES) в колбе Эрленмейера объемом 500 мл.
   2. Поместите чистые предметные стекла и покровные стекла в банку для окрашивания Coplin, погрузите в 3% раствор APTES-EtOH, окуните ультразвуком на 1 минуту и инкубируйте в течение 30 минут.
   3. Промойте 3 раза абсолютным EtOH, затем 3 раза ddH₂O.
   4. Высушите слайды и покровные стекла под потоком N₂(g).
3. Поверхностная пассивация и биотинилирование
   1. Подготовьте влажную коробку, заполнив пустую коробку с наконечником для пипетки до половины ddH₂O. Поместите предметные стекла внутрь коробки стороной для обработки вверх.
   2. Приготовьте смесь bPEG-mPEG в стерильно чистой микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл, осторожно смешав 2 мг биотина-полиэтиленгликоля-сукцинимидилвалерата 5000 (биотин-PEG-SVA) и 80 мг метоксиполиэтиленгликоля-сукцинимидилвалерата (mPEG-SVA) в 640 мкл 100 мМ буфера бикарбоната натрия (NaHCO₃), pH 8,3. Центрифугируйте смесь bPEG-mPEG при давлении 16 000 × г в течение 1 минуты, чтобы удалить пузырьки воздуха.
   3. Осторожно удалите надосадочную жидкость и добавьте каплю объемом 30 мкл в центр предметного стекла, чтобы покрыть оба канала. Поместите дополнительную каплю на одну сторону предметного стекла, чтобы получить дополнительное покровное стекло PEGylated, так как они легко ломаются, и полезно иметь запасной. Наконец, накройте каплю чистым покровным стеклом, закройте влажную коробку и выполните PEGylation на ночь в темноте.
   4. Тщательно промойте ПЭГ-пассивированные и биотинилированные стекла и покровные стекла с помощью ddH₂O. Обратите внимание на изменение гидрофобности обработанных поверхностей. Высушите под потоком N₂(g).
4. Микрофлюидная камера в сборе
   1. Вырежьте двустороннюю наклейку, чтобы создать каналы. Прикрепите наклейку к предметному стеклу, убедившись, что она покрывает интересующую область. Аккуратно поместите покровное стекло сверху, выровняв его так, чтобы PEGилированные поверхности были обращены друг к другу.
   2. Поместите каждую собранную камеру в центрифужную пробирку объемом 50 мл, заполните пробирки N₂(g) и храните при температуре -20 °C до 1 месяца.

Рисунок 2: Одномолекулярная микроскопия FRET-TIRF. (A) Микрофлюидная камера для визуализации TIRF. (B) РНК, меченная FRET, инкапсулирована в биотинилированный фосфолипидный везикулу и иммобилизована на стеклянной поверхности, покрытой стептавидином. При этом интересующая молекула удерживается в затухающем поле (сером градиенте), которое создается падающим светом, полностью отражающимся под критическим углом в микроскопии TIRF. Здесь оба флуорофора впоследствии возбуждаются по схеме ALEX. Сокращения: FRET = Förster Resonance Energy Transfer; TIRF = полная флуоресценция внутреннего отражения; ALEX = альтернативное лазерное возбуждение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

3. Инкапсуляция фосфолипидных везикул

1. Приготовление липидного торта
   ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда работайте с хлороформом под вытяжным шкафом.
   1. С помощью стерильной иглы проделайте отверстия в крышке (изнутри наружу) стерильно чистых микроцентрифужных пробирок объемом 2,0 мл, как показано на рисунке 3A.
   2. Готовьте стоковый раствор 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-кап биотинила (bPE) путем растворения не менее 2 мг bPE в соответствующем количестве хлороформа до конечной концентрации 1 мг/мл.
   3. Готовьте стоковый раствор 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DMPC) путем растворения не менее 10 мг DMPC в соответствующем количестве хлороформа до конечной концентрации 10 мг/мл.
   4. Приготовьте смесь bPE-DMPC (сохраняя соотношение 1:99 мас./масса), смешав 100 μL bPE и 990 μL стоковых растворов DMPC. Распределите 109 мкл смеси bPE-DMPC на 2 мл пробирки.
   5. Поместите картонную ячейковую перегородку коробки для хранения микротрубок в колбу Schlenk, служащую держателем пробирки. С помощью длинного пинцета поместите пробирки, содержащие липидную смесь, в держатель пробирки в колбе Schlenk объемом 500 мл (рис. 3B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что они стоят вертикально и не наклонены.
   6. Выпарить хлороформ при слабом потоке N₂(g) в течение ночи (или не менее 2 часов до полного испарения растворителя).
   7. Заклейте трубки парапленкой, чтобы закрыть отверстия. Хранить липидные лепешки при температуре -20 °C до 1 месяца.
2. Инкапсуляция РНК
   1. Приготовьте следующие буферы и растворы, регулируя концентрации K⁺ и Mg²⁺ в соответствии с интересующей биологической системой.
      1. Подготовьте стандартный буфер 5x (5x SB): 2,5 M KCl, 400 mM MOPS; отрегулируйте pH до 6,9 с помощью стерильного фильтра KOH и храните при температуре 4 °C в темноте (соответственно 1x SB: 500 мМ KCl, 80 мМ MOPS, pH 6,9).
      2. Приготовьте антимигающий буфер (AB): 100 мМ MgCl₂, Trolox, 1x SB, стерильный фильтр, и храните при 4 °C в темноте до 1 недели.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте кончик шпателя Trolox для конечного объема 10 мл, перемешайте и отрегулируйте pH.
   2. Соберите экструдер с помощью мембраны из поликарбоната (ПК) длиной 100 нм и дренажного диска из полиэстера (ПЭ) толщиной 10 мм, уравновесьте шприц и мембраны с помощью AB и нагрейте до 30 °C (или значительно выше температуры стеклования DMPC в 24 °C).
   3. Смешайте 5 мкл 1 мкМ меченой с двух сторон РНК и 45 мкл AB (до общего объема 50 мкл).
   4. Увлажните липидный жмых этим раствором РНК. При 30 °C перемешивайте в течение 5 минут, встряхивая при 1 400 об/мин, затем в течение 15 минут при 700 об/мин. Центрифугируйте в течение 2 мин при 13 000 г и осторожно переложите надосадочную жидкость в новую пробирку.
   5. Разбавьте образец 250 μл AB.
   6. Наполните шприц РНК-липидной суспензией. Экструдируйте 35 раз при 30 °C нагревательный блок, чтобы инкапсулировать РНК с двойным концом в фосфолипидные везикулы диаметром 100 нм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Распределение везикул по размерам после использования экструдера может быть проверено с помощью динамического рассеяния света (DLS), как показано в ссылке¹¹.

Иллюстрация 3: Приготовление липидного кека. (A) Крышки трубок вытыкаются для обеспечения испарения растворителя. (В) Пробирки, содержащие липидную смесь, помещают в колбу Шленка, и хлороформ выпаривают с получением липидного пирога. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

4. Микроскопия smFRET-TIRF

1. Поверхностная иммобилизация
   1. Приготовьте следующие буферы и растворы.
      1. Приготовьте сахаро-антимигающий буфер (SAB): 1% D-глюкозы (w/v) в AB, стерильном фильтре и храните при температуре 4 °C в темноте до 1 недели.
      2. Приготовьте 100x OSS: 100x Система очистки кислорода (OSS): 3 мг глюкозооксидазы (соответствует 1,7 U), 10 мкл каталазы (соответствует 22 U) в 90 мкл 1x SB, храните при 4 °C в темноте до 1 недели.
      3. Приготовьте буфер для визуализации (IB), смешав 198 μL SAB и 2 μL 100x OSS раствора.
   2. Дайте микрофлюидной камере нагреться до комнатной температуры. Промойте камеру 2x 200 μL 1x SB.
   3. Заполните камеру 50 мкл 20 мкл раствора стрептавидина в концентрации 20 мкл/мл и инкубируйте в течение 5 минут.
   4. Промойте камеру 200 мкл 1x SB, а затем 100 мкл AB.
   5. Инкапсулированную РНК обездвижить на поверхности, добавив 75 мкл везикулярной суспензии, и инкубировать в течение 10 минут.
   6. Промойте камеру 200 мкл свежеприготовленного IB и инкубируйте в течение 5 минут.
   7. Теперь камера готова к сбору данных (рис. 2B). Чтобы предотвратить испарение во время длительных измерений, загерметизируйте отверстия, как показано на рисунке 2A. Если утечки из канала в канал вызывают беспокойство, загерметизируйте неиспользуемый канал перед началом протокола иммобилизации поверхности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем проводить холостые измерения в качестве проверки чистоты микрофлюидных камер и фосфолипидных везикул на предмет флуоресцентных загрязнений.

Результаты

Мы представляем сайт-специфичную одно- и двойную флуоресцентную маркировку 915-нт РНК, представляющей интерес для митохондриального интрона дрожжей Sc.ai5γ группы II, окруженную экзонными последовательностями. Пара флуорофоров FRET располагается на концах РНК посредством активации 5'-фосфата EDC/NHS и окисления периодата 3'-рибозы с последующим присоединением соответствующего красителя. Затем мы верифицировали конъюгаты РНК-красителя с помощью флуоресцентного гель-электрофореза, как показано на рисунке 4A. Совместная миграция РНК и флуорофоров на агарозном геле подтверждает успешное мечение. Далее, как показано на рисунке 4B, была использована ансамблевая флуоресцентная спектроскопия для определения характеристик интрона II группы с двойной меткой. Перенос энергии, то есть FRET, наблюдался при возбуждении донорского красителя, что доказывает двойную маркировку РНК. Примечательно, что в соответствии с расстояние-зависимым характером FRET, сворачивание интронной РНК группы II в присутствии ионов металлов приводило к увеличению эффективности FRET, о чем свидетельствует снижение донорской эмиссии (зеленая стрелка) и соответствующее увеличение акцепторного излучения (красная стрелка). Это указывает на то, что данная маркировка FRET отслеживает конформационные изменения рибозима.

Рисунок 4: Характеристика конъюгатов РНК-красителя. (A) Аналитический анализ одно- и двухфлуоресцентно меченых РНК на основе геля показывает комиграцию красителей с РНК на 2% агарозном геле. На совместную локализацию флуорофоров в двойном меченом образце указывает желтая полоса на объединенном изображении (внизу) каналов Cy3 (вверху, зеленый) и Cy5 (средний, красный), визуализированных при освещении 532 нм и 635 нм соответственно. Дорожка 1: 5'-sCy3 мечена только РНК, линия 2: 3'-Cy5 мечена только РНК, а полоса 3: двухконечная (5'-sCy3 и 3'-Cy5) меченая РНК. (B) Ансамблевая флуоресцентная спектроскопия подтверждает двойную маркировку. Перенос энергии при донорском возбуждении (λex = 515 нм, λem = 670 нм) подтверждает, что оба красителя успешно связаны с РНК. Серая кривая представляет профиль излучения предкаталитической РНК, в то время как черная кривая демонстрирует повышенную эффективность FRET в свернутой интронной РНК группы II (инкубированной с 500 мМ KCl при 70 °C в течение 3 мин, охлажденной до 42 °C в течение 5 мин с последующим добавлением 100 мМ MgCl₂). Этот рисунок был адаптирован из Ahunbay et al.³ Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Имея в руках флуоресцентный интрон II группы II с двойным мечением, мы теперь можем исследовать его динамику на уровне одной молекулы. После инкапсуляции в фосфолипидные везикулы меченая РНК иммобилизуется на поверхности микроскопии при очень низкой поверхностной плотности для достижения одномолекулярного разрешения для smFRET-TIRF. Как видно на рисунке 5А, несколько отдельных молекул могут быть отслежены одновременно. Микроскопия TIRF позволяет в режиме реального времени отслеживать эффективность FRET и ее изменения с течением времени. На рисунке 5B показаны статические и динамические одномолекулярные следы FRET меченой и инкапсулированной РНК. Типичная динамическая трассировка демонстрирует антикорреляцию между сигналами донора и акцептора, которая колеблется в эффективности FRET. Когда акцепторная эмиссия при донорном возбуждении увеличивается, донорская эмиссия соответственно уменьшается, что свидетельствует о динамическом изменении межкраевого расстояния. Эта антикорреляция предполагает конформационные изменения в молекуле РНК.

Рисунок 5: Высокодинамичное поведение интронной РНК группы II, выявленное с помощью smFRET. Меченая с двойным концом интронная РНК группы II инкапсулируется в фосфолипидный везикулу и иммобилизуется на поверхности для визуализации с помощью объективного микроскопа TIRF. (A) Объединенное изображение отдельных меченых молекул РНК, демонстрирующих донорную эмиссию (sCy3, зеленый) и акцепторную эмиссию (Cy5, красный) при возбуждении с длиной волны 532 нм. (B) Типичные траектории smFRET (слева) статической молекулы РНК, где интенсивности донора и акцептора не колеблются во времени, и (справа) динамической молекулы РНК, где интенсивности донора и акцептора антикоррелятны, с эффективностью FRET выделена желтым цветом. Отдельные молекулы локализуются и анализируются с помощью MASH-FRET¹⁷. Применяются коррекции прямого возбуждения, просвечивания и γ-факторной коррекции. Сокращения: smFRET = одномолекулярный резонансный перенос энергии Фёрстера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

FRET на уровне отдельных молекул уникален, поскольку он позволяет наблюдать и анализировать отдельные молекулы, выявляя неоднородность образца и захватывая переходные состояния, которые могут быть скрыты при ансамблевых измерениях ^1,2. Наблюдение за отдельными молекулами РНК с помощью smFRET позволяет с высоким разрешением получить представление об их путях сворачивания и динамике. Этот протокол описывает химическое двустороннее мечение РНК и ее поверхностную иммобилизацию с помощью инкапсуляции фосфолипидных везикул, что в совокупности позволяет отслеживать динамические конформационные изменения с помощью микроскопии smFRET-TIRF.

Изучение динамики РНК — постоянно развивающаяся область с потребностью в новых сайт-специфичных стратегиях флуоресцентного мечения. Мы помечаем концы РНК, нацеливаясь на 5'-фосфат карбодиимидами и 3'-рибозный сахар с периодатом. Эти подходы были описаны ранее (5'-end^18,19 и 3'-end 19,20,21,22), но ранее не применялись к РНК аналогичного размера интрону Sc.ai5γ группы II группы дикого типа, которая требовала оптимизации. Активация 5'-фосфата карбодиимидом (например, EDC) обратима. Таким образом, имидазол использовали для необратимой реакции с промежуточным продуктом O-ацилизомочевины с образованием высокореакционноспособного фосфоримидазолида^19,20. Тем не менее, в настоящее время известно, что при более высоком pH карбодиимиды могут модифицировать нуклеиновые основания, в частности гуанины и урацилы, что в последнее время привело к их использованию в качестве структурных зондирующих агентов^.

Чтобы избежать перекрестной реактивности, решающее значение имеет очистка активированной РНК от EDC до повышения pH до 7,5 на этапе связывания красителя. Однако, когда мы ввели стадию очистки между активацией и присоединением красителя²⁵, мы получили очень низкие выходы. Аналогично, при мечении белков поверхностно доступные остатки лизина могут быть активированы карбодиимидами. Однако вместо имидазола, который предотвращает реверсивную активацию, обычно используется NHS. Мы также приняли эту стратегию, заменив промежуточный продукт фосфоримидазолида на промежуточный продукт NHS-фосфата. Таким образом, мы добились контроля pH, а также увеличенной плотности мечения при более низких температурах и более коротком времени инкубации, т. е. 25 °C в течение 4 ч по сравнению с 37 °C в течение 16 ч. Разработанная для РНК, эта стратегия 5'-мечения может быть применена к любой другой одноцепочечной нуклеиновой кислоте с 5'-фосфатом.

Активация 5'-фосфата и окисление 3'-рибозы были взаимоисключающими, поскольку химические вещества не являются ортогональными. Чтобы преодолеть эту проблему и избежать перекрестной маркировки, мы начали с 5'-конца, за которым последовал этап блокировки для ингибирования активированных, но не помеченных сайтов, прежде чем приступить к 3'-концевой маркировке. При окислении 3'-диола избыток метапериодата натрия (NaIO₄) может погасить уже прикрепленный флуорофор на 5'-конце. Поэтому мы снизили концентрацию NaIO₄ , используемого для одиночного мечения, с 20 мМ до 10 мМ.

Мы рекомендуем работать с несколькими аликвотами параллельно, а не масштабировать реакции. Этот протокол требует нескольких этапов осаждения этанола (EtOH). При работе с несколькими аликвотами параллельно готовят осадочную смесь (30 мл 100% абсолютного EtOH и 1 мл 3 М NaOAc, pH 5,2). NaCl не используется из-за его низкой растворимости в EtOH. Осаждение РНК с 3,1 об. этой смеси путем ночной инкубации при -20 °C с последующим центрифугированием. Дважды промойте гранулу РНК с 500 мкл ледяного 70% EtOH, после каждого раза отжимайте при 4 °C и сушите под вакуумом. Осаждение EtOH использует преимущества нерастворимости РНК и растворимости свободных красителей в 70% этаноле. Центробежная фильтрация эффективно удаляет свободные красители благодаря их значительному отличию в размерах от РНК и способствует буферному обмену, устраняя соли. В дополнение к методам осаждения EtOH и центробежной фильтрации, свободные красители также могут быть удалены с помощью методов гелевой экстракции и/или хроматографии (например, ВЭЖХ); Тем не менее, масштаб должен быть соответствующим образом адаптирован. Не делайте вихревые длинные РНК для ресуспенда, так как это может привести к механическому сдвигу²⁶. Оптимальное время для приостановки протокола — когда РНК гранулирована. Мы используем трубки с низким связыванием ДНК для улучшения восстановления нуклеиновых кислот. Несмотря на то, что конечный объем реакции составляет 100 мкл, для лучшей очистки осаждением EtOH предпочтительны пробирки объемом 1,5 мл (и не меньше).

После удаления непрореагировавших свободных красителей с помощью осаждения и центробежной фильтрации мы подтвердили мечение с помощью флуоресцентного гелевого электрофореза (рис. 4А), УФ-ВИД спектроскопии, аналитической ВЭЖХ³. Тем не менее, важно отметить, что эти методы не могут различить молекулу РНК, несущую как флуорофоры, так и смесь РНК, каждая из которых помечена одним цветом. Точно так же они не могут быть использованы для определения того, несет ли молекула РНК несколько флуорофоров одного цвета. Масс-спектрометрия не может быть использована из-за ограничений по размеру. Ансамбль³ и одномолекулярная FRET-спектроскопия подтверждают двойное флуоресцентное мечение, как показано на рисунках 4B и 5B. Стехиометрия 0,5 (соотношение sCy3 и Cy5 1:1) в экспериментах smFRET подтверждает равное сопряжение двух флуорофоров. Одной из проблем была двойная маркировка на 3'-конце путем маркировки обоих альдегидов вместо предложенной циклизации. Отсутствие видов со стехиометрией 0,25 (соотношение sCy3 к Cy5 1:2) в экспериментах smFRET позволяет предположить, что прикрепление красителя стерически препятствует и предотвращает прикрепление второго красителя.

При таком двойном флуоресцентном мечении изменения сигнала FRET можно объяснить структурными перестройками в процессе сворачивания РНК и катализа. Для поддержания флуоресцентно меченой РНК в затухающем поле при визуализации одномолекулярного TIRF инкапсуляция предпочтительнее прямого поверхностного связывания. Этот подход включает в себя захват отдельных молекул РНК в липидных бислоях везикул, создавая контролируемую среду, способствующую наблюдению за их динамическим поведением. Описанный протокол обогащает моноинкапсуляцию, как показывает фотообесцвечивание за один этап¹¹. Чтобы понять сворачивание и функцию РНК, необходимо соединить разрыв in vitro и in vivo ²⁷. Агенты молекулярного скученности могут имитировать условия внутри клеток для усиления катализа РНК интронами группы II ^7,28. С другой стороны, инкапсуляция создает ограниченное микроокружение, которое способствует сворачиванию РНК²⁹, приближая наше понимание структуры и динамики РНК к реалистичному клеточному контексту.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
<мечение сильно>РНК
1,5  mL DNA LoBind пробирки	Eppendorf
1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид (EDC-HCl или EDC)	Thermo Scientific	11844071	Pierce EDC, формат без взвешивания. Магазин в  -20 °°; C
3-морфолинопропан-1-сульфоновая кислота (MOPS)	Sigma-Aldrich	69947	BioUltra, для молекулярной биологии, ≥ 99,5% (титрования)
Уксусная кислота (ледяная)	Sigma-Aldrich	1.00063	100%, безводный для анализа EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur
Центробежная фильтрационная установка	Sartorius	VS0132	Vivaspin 500, MWCO 50.000, PES, 500 μ L
Cyanine5 гидразид (Cy5-гидразид)	Lumiprobe	23070	5 мг, номер CAS 1427705-31-4
Диметилсульфоксид (ДМСО)	New England Biolabs	12611P	Молекулярная биология класс
этанол	VWR Chemicals	20821.296P	Абсолют ≥ 99,8%
Глицерин	Sigma-Aldrich	G5516	для молекулярной биологии, ≥ 99,0%
Соляная кислота (HCl)	Sigma-Aldrich	1.00317	дымка 37%, для анализа EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur
N-гидроксисукцинимид (NHS)	Sigma-Aldrich	130672	98%
ацетата натрия (NaOAc)	Sigma-Aldrich	S8750	безводный, ReagentPlus, ≥ 99,0%
Метапериодат натрия (NaIO4)	Thermo Fisher Scientific, Life Technologies	20504	Линейка продуктов Pierce
Сульфо-цианин3 амин (sCy3-амин)	Lumiprobe	213C0	5 мг, номер CAS 2183440-43-7
Трис(гидроксиметил)аминометан (Tris)	Biosolve	200923	Молекулярная биология класс
<сильный>Камерный препарат
3-аминопропил)триэтоксисилан (APTES)	Sigma-Aldrich	440140	99%
Ацетон	Sigma-Aldrich	1.00014	для анализа EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur
биотин-полиэтиленгликоль-сукцинимидилвалерат (биотин-PEG-SVA, bPEG) и метоксиполиэтиленгликоль-сукцинимидилвалерат (mPEG-SVA)	Laysan Bio, Inc.		BIO-PEG-SVA, MW 5,000 и MPEG-SVA, MW 5,000 - Комбинированный комплект
покровных колпачков	Carl Roth	H876.2	24 x 24 мм, 0.13-0.16  толщина
мм Deconex 11 универсальный	Borer Chemie AG	17416492	Раствор для чистки лабораторной посуды
Корончатое сверло с алмазным покрытием	Crystalite corporation		толщина 1 мм
Алмазный сверлильный станок
Этанол	VWR Химикаты	20821.296P	Absolute ≥ 99,8%
Стеклянная баночка для окрашивания с крышкой
Imaging Spacer	Grace Bio-Labs	654008	SecureSeal, 8 лунок,  9  мм и раз; 0.12  мм
Кислородный плазменный очиститель	Zepto One		Diener
Гидроксид калия (KOH)	Sigma-Aldrich	P9541	для молекулярной биологии, ≥ 99,0%
Кварцевые слайды	G. Finkenbeiner, Inc.		7.5  х  2.5  см, толщина 1 мм
Гидрокарбонат натрия (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6297	BioXtra, 99,5-100,5%
<сильно>Приготовление липидного кека
16:0 Biotinyl Cap PE, bPE (1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-(кап биотинил) (натриевая соль), C53H98N4O11PNaS)	Avanti Polar Lipids	870277P	Стабильно в течение 1 года при -20 ° C
14:0 PC, DMPC (1,2-дитетрадеканоил-sn-глицеро-3-фосфохолин или 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфохолин, C36H72NO8P)	Avanti Polar Lipids	850345P
2,0 мл микроцентрифужные пробирки, Safe-Lock	Eppendorf	0030120094	автоклав для стерилизации
500  mL колба
Chloroform	Merck	1.02445	для анализа EMSURE ACS, ISO, Reag. Ph Eur
Parafilm
Поверхностная иммобилизация путем инкапсуляции
(±)-6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновая кислота (Trolox®)	Thermo Fischer	53188-07-1	97%
3-морфолинопропан-1-сульфоновая кислота (MOPS)	Sigma-Aldrich	69947	BioUltra, для молекулярной биологии, ≥ 99,5% (титрование). Хранить при +4 °deg; C в темноте.
Клейкие уплотнительные вкладки	Grace Bio-Labs	629200
Каталаза	Sigma-Aldrich	9001-05-2, C30	из печени крупного рогатого скота, водная суспензия, 10 000-40 000 единиц/мг белка
D-глюкоза	Sigma-Aldrich	G7528	≥ 99,5% (GC), BioXtra
Экструдер поликарбонат (ПК) мембрана	Avanti Polar Lipids	610005-1EA	0,1 μ m, 19 мм
Набор экструдеров с нагревательным	блоком Avanti Polar Lipids	610000
Глюкозооксидаза	Sigma-Aldrich	9001-37-0	от Aspergillus niger, тип VII,  лиофилизированный порошок, > 100 000 единиц/г твердого вещества (без добавления кислорода)
Хлорид магния (MgCl2)	Sigma-Aldrich	7786-30-3, M1028	для молекулярной биологии, 1,00 M ± 0,01 M раствор
Полиэфирный (PE) дренажный диск, мембрана	Whatman, Cytiva	230300	10 мм
Хлорид калия (KCl)	Sigma-Aldrich	60128	BioUltra, для молекулярной биологии, ≥ 99,5% (AT)
Гидроксид калия (KOH)	Sigma-Aldrich	P9541	для молекулярной биологии, ≥ 99,0%
Стрептавидин	Термо Фишер	434301