Оценка подвижности нейронных стволовых клеток Использование агарозном геле основе микрожидкостных устройств

Краткое содержание

Мы показываем, что за выражение эпидермального фактора роста рецепторов (EGFR) повышает подвижность нервных стволовых клеток (NSCs) с использованием новых агарозном гель на основе микрожидкостных устройств. Эта технология может быть легко адаптированы к другим млекопитающих ячейку, где ячейка источников не хватает, например, человека нервные стволовые клетки, и повернуться время имеет решающее значение.

Аннотация

Хотя микрожидкостных технология выходит на новый уровень зрелости для макромолекулярных анализы, клеточных анализов все еще ​​находятся на младенческой стадии ^1. Во многом это связано с трудностью, с которой можно создавать ячейки-совместимым и устойчивым микроокружения с использованием обычных технологий микротехнологий и материалов. Мы решению этой проблемы путем введения новых материала микроструктур, агарозном геле, в качестве базового материала для микрожидкостных устройств. Агарозном геле очень податлива, и проницаемой для газа и питательные вещества, необходимые для выживания клеток, и таким образом является идеальным материалом для клеточных анализов. Ранее нами было показано, что гель агарозы устройств на базе добились успеха в изучении бактерий и нейтрофилов миграции клеток ^2. В этом докладе, три параллельных микрожидкостных каналов по образцу в мембраны агарозном геле толщиной около 1 мм. Постоянные потоки со средствами массовой информации / буфер ведутся в двух боковых каналов с помощью перистальтического насоса. Клетки хранятся в центральном канале для наблюдения. Так как питательные вещества и химические вещества в боковых каналов постоянно диффундирующих из стороны в центральный канал, химической среде центрального канала легко управляется с помощью потока вдоль боковых каналов. С помощью этого устройства, мы показываем, что движение нервных стволовых клеток можно наблюдать оптически с легкостью в различных условиях химической и экспериментальные результаты показывают, что за выражение эпидермального фактора роста рецепторов (EGFR) повышает подвижность нервных стволовых клеток. Подвижность нервных стволовых клеток является важным биомаркеров для оценки агрессивности клетки, тем самым онкогенными в ^{3 раза.} Расшифровка механизма, лежащего НСК моторики даст понимание как нарушение развития нервной системы и в рак мозга вторжения стволовых клеток.

Протокол

Процедура

Покрытие слайды с фибронектин

До сборки микрожидкостных устройств, стерилизовать стеклянные слайды с фибронектина. Пальто слайдов в biohood для поддержания стерильности. Совместите стерильной Spacer PDMS по краям слайд и отметьте сторона, которая сталкивается с постоянным маркером. Внесите 1 мл 5 мкг / мл раствора фибронектина (Sigma) внутри прокладки PDMS за полноту стекло. Оставьте в покое на слайдах час, затем полностью высохнуть использованием N ₂ пистолета. Слайды можно хранить при температуре ⁴ ° С в течение последующих экспериментах.

Сборка устройства

Весь протокол сборке устройства осуществляется в biohood в стерильных условиях, с использованием следующих процедур:

1. Чистый кремний мастер с микроканалов по образцу он, протирая его вниз с 70% этанола и сушка с N ₂ пистолета. Место стерильной Spacer PDMS 1 мм высоту с помощью щипцов вокруг рельефа мастера.
2. Подготовка агарозном геле, используемые в устройстве весом 0,3 г агарозы порошка (Fisher Scientific) и 10 мл CO _{2-независимые} средства массовой информации (Invitrogen) в 50 мл стакан. Перемешать смесь с лопаточкой и тепла в микроволновой печи в течение 20 секунд на высоте. Если нерастворенных гранулах присутствуют, нагревайте смесь в течение еще 10 секунд и водоворот горячую смесь, чтобы избавиться от последних оставшихся гранул. Повторите процесс с отоплением время 8 секунд, а затем 5 секунд.
3. Быстро влить раствор агарозы на кремний мастер окружении распорку PDMS и сразу же покрытие смесь агарозы стерильным предметное стекло. Применять постоянно, мягкое давление на слайд в течение 2 минут, чтобы обеспечить, что будет агарозном геле же постоянной высотой 1 мм, как распорки PDMS.
4. После агарозном гелях, шелушиться узорной агарозном геле с распоркой PDMS от мастера кремния и передачи фибронектина покрытием предметное стекло с микроканалов в агарозном геле перед горкой. Используйте калибра 16 наконечника шприца для пробивки отверстий в резервуар регионов микроканалов для входа и выхода доступов. Добавить 500 мкл СО _{2-независимые} средства массовой информации к узорной агарозном гель на слайд, чтобы предотвратить высыхание микроканалов.
5. Вымойте акриловые многообразием используемых в устройстве с 70% этанола и смыть водой DI. Совместите отверстия в многообразии с отверстиями кулаком в агарозном геле с микроканалов. Затем выровняйте многообразие с гелем, PDMS распорка, и фибронектина слайд с металлической рамы устройства. Место винты в устройство и подтянуть к точке сопротивления с помощью отвертки. Это делается для того, чтобы устройство не затягивать слишком туго, в той мере, деформирующего микроканалов в агарозы. Затяните винты по часовой стрелке, чтобы гель внутри устройства нет смены. Проверьте устройство на предмет утечек и завалов в микроканалов использованием 1 мл шприца. Шприц оснащен Tygon труб с гелем загрузки пипетки на конце трубки для введения CO _{2-независимых} СМИ в микроканалов. Микроканальных считается успешно формируется, когда средства массовой информации наблюдается только выход из выхода микроканальных, когда средства массовой информации вводят в соответствующий вход. Теперь устройство готово к использованию.

Подготовка и посев клеток в устройстве

Когда клетки достигают 70% слияния (плотность клеток около 100000 клеток / мл), они готовы быть посеяны в устройство.

Тема клетки к двум DPBS (Invitrogen) стирок. Добавить 200 мкл трипсина-EDTA (Invitrogen), чтобы отделить клетки. Передача клетки 15 мл центрифугу пробирку, содержащую 5 мл М2 средах, содержащих сыворотку для инактивации трипсина. Центрифугировали питательной среды с клетками в 1000 оборотов в минуту в течение 5 минут. Наддувом от супернатант и ресуспендируют осадок клеток 5 мл DPBS. Центрифуга DPBS клетки снова на тех же условиях. Наддувом от супернатант снова, и ресуспендируют осадок клеток в 500 мкл СО _{2-независимых} СМИ.

Семенной полученной суспензии клеток в центре микроканальных из устройства через гравитацию управляемых потоков. Добавить входе и выходе из центра микроканальных с 60 мкл клеточной суспензии и 20 мкл СО _{2-независимой} среды, соответственно. Соблюдайте центр микроканальных при микроскопии светлого искать клеточной адгезии. Клетки обычно придерживаются через 10 минут. После клетки придерживаться дне канала на должном плотности, pipeted оставшиеся клеточной суспензии на входе и средств массовой информации в розетку. Место 60 мкл СО _{2-независимые} средства массовой информации в обеих входе и выходе из центрального канала. Место PDMS охватывает более-йЦентр электронной входе и выходе, чтобы минимизировать испарения средств массовой информации из центрального канала.

Изображения клеток в устройстве

До сборки устройства, поток стерильного перистальтической трубки через метеостанции микроскопа (Olympus X81) и соединиться с перистальтического насоса (Watson-Marlow 205U/CA). Флеш PBS через шланг в размере 4 оборотов в минуту. После сборки аппарата, подготовить соответствующие концентрации эпидермального фактора роста (ЭФР) (Sigma) решения в СО _{2-независимые} средства массовой информации в 15 мл пробирок центрифуги. Vortex ЭФР решения в течение 5 секунд и соединиться с трубкой. Подключение трубки, отмеченные соответствующие концентрации ЭФР к устройству. Она занимает около часа EGF диффундировать через канал хребта и создать устойчивый градиент химического вещества.

ПО для обработки изображений, Slidebook, используется, чтобы взять набор изображений в каждые 10 минут в течение 5 часов в экспериментальных перспективе. Ху автоматизированных этапе программируются таким образом, что две подзоны (каждый площадью x400μm 400μm) того же центрального канала, и в общей сложности три канала центра отображаемого в данный момент времени. Клетки в разных каналах центр (обычно 3 за один проход) имеют различные концентрации EGF, как отмечено на трубы.

Материалы и оборудование

Клеточные линии: C17.2 клетки NSCs происходит от внешнего зародышевого слоя послеродовой мозжечка мыши ^{6, 7.} С помощью этой клеточной линии, мы разработали два других мышиных стволовых клеток линий с использованием метода трансфекции ретровируса. Эти два стабильно трансфицированных клеточные линии (1) wtEGFR - что чрезмерная выражает человека дикого типа EGFR, и (2) ΔEGFR - то есть конститутивно EGFR мутанта. Для облегчения обнаружения ретровирусов нести позвоночника с геном интересов следуют внутренний сайт для связывания рибосом (IRES) и зеленый флуоресцентный белок (GFP).

Клеточные культуры: мыши C17.2 NSCs и их вариантов были выращены в 6-луночный планшет в M2 СМИ (DMEM (Invitrogen) с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) (Invitrogen), 5% лошадиной сыворотки (ГС) (Invitrogen ), и 1% пенициллина / стрептомицина (Invitrogen).) Клетки при температуре 37 ^° С в 80% воздуха и 5% СО _2.

Микрожидкостных устройств: пластиковые многообразие, прокладку PDMS и рамкой из нержавеющей стали для хранения устройства на месте.

Изображений

Перевернутой флуоресцентного микроскопа (Olympus IX-81) используется, в связи с усилением CCD камера (Orca, Хамамацу). Микрожидкостных устройство устанавливается на автоматизированные стадии XYZ, и сцена окружена экологические камеру, которая поддерживает температуру 37 ^° С. Существуют, как правило 3-4 устройств на одном чипе, который будет снят в той же точке времени, используя автоматизированные стадии XYZ.

Поток поддержания

Перистальтического насоса с 8 параллельных линий (Watson-Marlow 205U/CA) авто используется для поддержания потоков во всей раковине и источника каналов.

Рис. 1 Подвижность из трех штаммов НСК (родительские, wtEGFR и D EGFR) в различных концентрациях ЭФР Все траектории взяты из отслеживания фильм 5 часов (за исключением wtEGF 100ng/ml, 4hour), и происхождение всех треков перемещены в (0,0) для сравнения цели.

Рис. 2 Корреляция уровня экспрессии EGFR и подвижность (а) два изображения NSCs wtEGF на поверхности микрожидкостных канал с 100ng/ml ЭФР. Левого изображения флуоресцентного изображения, а права передаются яркое изображение области. Шкалы является 100 мкм, а Ширина канала составляет 400 мкм. Клетки разделяются на две популяции по яркости GFP выражены. Клетки в синих кругов диммер, таким образом, имеют меньший уровень экспрессии EGFR, и ячейки в красных кругах brigher, таким образом, имеют более высокий уровень EGFR выражения. (Б) Траектории клеток с низким и высоким уровнем экспрессии EGFR. Эти траектории взяты из четыре часовых фильма.

Обсуждение

Рис. 1 показаны траектории трех штаммов НСК, родительских клеток, wtEGFR и ΔEGFR (контроль). Каждый набор траекторий, были получены от 5 часов фильма. Для родительских клеток, клеточной подвижности пик, когда концентрация ЭФР ~ 10ng/ml, ибо wtEGFR клеток, клеточной подвижности пик смещается 100ng/ml или выше; для ΔEGFR клеток, клеточной подвижности не зависит от концентрации ЭФР, как ожидалось.

WtEGF клеток с 100ng/ml были наиболее подвижных клеток, они переехали примерно в 1,5 раза быстрее, чем родительские клетки с 10ng/ml. Это оз...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Дульбекко s Модифицированная среда Eagle Medium (DMEM) (1X)	Реагент	Invitrogen	11971-025
CO2-независимая среда	Реагент	Invitrogen	18045-088	Запатентованная среда, не относящаяся к HEPES, пригодная для поддержки роста клеток различных эпителиальных, фибробластных и лимфоидных клеточных линий в атмосферных условиях, не содержит L-глутамина
Трипсин-ЭДТА	Реагент	Invitrogen	25200-072
PBS	Реагент	Invitrogen	14190-144	Фосфатно-солевой буфер, без кальция или магния
Pen/Strepping	Реагент	Invitrogen	15140-122	Содержит 10 000 единиц пенициллина (основание) и 10 000 г стрептомицина (основание)/мл с использованием пенициллина G (натриевая соль) и стрептомицина сульфата в 0,85% физиологическом растворе
FBS	Реагент	Invitrogen	10437-028	Плод крупного рогатого скота Сыворотка, квалифицированный
реагент для лошадиной сыворотки		Invitrogen	16050-130	Лошадиная сыворотка, протестированная на EIA (отрицательная) сыворотка
Реагент Фибронектин		Sigma-Aldrich	F0895	Фибронектин из плазмы человека, также называемый холодным нерастворимым глобулином
EGF	Реагент	Sigma-Aldrich	E4127	Эпидермальный фактор роста из подчелюстной железы мыши, лиофилизированный
Агарозный	реактив	Fisher Scientific	BP1356-500