В этом протоколе подробно описывается метод гликопротеомики под руководством гликомики, интегрированная омиксная технология, которая предлагает всестороннее понимание гетерогенного гликопротеома в сложных опухолевых микроокружениях, необходимое для лучшего понимания гликобиологии рака.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Гликопротеомика под контролем гликомики способствует комплексному профилированию гликопротеома в сложных опухолевых микроокружениях
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Гликозилирование является распространенной и структурно разнообразной модификацией белка, которая влияет на широкий спектр опухолевых процессов. Гликомика и гликопротеомика, основанные на масс-спектрометрии, стали мощными подходами к анализу высвобожденных гликанов и интактных гликопептидов соответственно, предлагая более глубокое понимание гетерогенного гликопротеома в микроокружении опухоли (ТМЭ). В этом протоколе подробно описывается метод гликопротеомики под контролем гликомики, интегрированная омиксная технология, в которой, во-первых, используется гликомика на основе пористого графитизированного углерода, LC-MS/MS для выяснения гликановых структур и их количественного распределения в гликоме исследуемых опухолевых тканей, клеточных популяций или жидкостей организма. Это позволяет провести сравнительный гликомический анализ для выявления измененных гликозилирования в группах пациентов, стадиях заболевания или состояниях и, что важно, служит для улучшения последующего гликопротеомического анализа того же образца (образцов) путем создания библиотеки известных гликановых структур, тем самым сокращая время поиска данных и частоту ошибочной идентификации гликопротеинов. Сосредоточив внимание на профилировании N-гликопротеомики, в этом протоколе подробно описаны этапы подготовки образцов для метода гликопротеомики под контролем гликомики, а также обсуждаются ключевые аспекты сбора и анализа данных. Метод гликопротеомики под контролем гликомики предоставляет количественную информацию о гликопротеинах, присутствующих в ТМЭ, и их сайтах гликозилирования, занятости сайтов и сайт-специфических гликановых структурах. Репрезентативные результаты представлены на основе фиксированных формалином парафин-интегральных тканей пациентов с колоректальным раком, демонстрируя, что метод чувствителен и совместим с тканевыми срезами, обычно встречающимися в биобанках. Таким образом, гликопротеомика, управляемая гликомикой, предлагает всестороннее представление о гетерогенности и динамике гликопротеома в сложных ТМЭ, генерируя надежные биохимические данные, необходимые для лучшего понимания гликобиологии рака.
Введение
Гликозилирование белков является распространенным и сложным типом ко- и посттрансляционной модификации белков, продуцируемых видами в филогенетическом древе жизни 1,2,3. Известно, что связанные с белками гликаны влияют на широкий спектр биологических процессов, важных для здоровья человека, включая посредничество и регуляцию клеточных взаимодействий и коммуникационных событий 4,5. Считалось, что аберрантное гликозилирование белка является причиной злокачественной трансформации, прогрессирования опухоли и ее распростра....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Исследование было одобрено Комитетом по этике исследований человека (медицинские науки) в Университете Маккуори, Сидней, Австралия (протокол 5201800073).
ПРИМЕЧАНИЕ: Метод гликопротеомики под руководством гликомики может быть применен к разнообразному набору биологических образцов от низкой до экстремальной сложности гликопротеинов. Для подходов к гликопротеомике без меток (при которых объединение образцов не проводится) требуется примерно 100-200 мкг общего белка из сложных смесей в качестве исходного материала для обеспечения высокого охвата гликопротеома после обогащения гликопептидами, которые могут сос....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В этом разделе представлены репрезентативные результаты метода гликопротеомики под контролем гликомики, примененного к тканевому стеклу FFPE у пациента с КРР на стадии II.
Для получения достаточного количества исходного материала белка для протокола белковые экстракты из двух слайдов (z-стеков) были объединены из одного и того же тканевого блока FFPE в соответствии с опубликованным протоколом, и был применен подход к мечению TMT для повышения чувствительности эксперимента по гликопротеомике (с.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Критические шаги в протоколе
В этом протокольном документе мы шаг за шагом описали метод гликопротеомики, управляемый гликомикой, который обеспечивает всестороннее представление о гетерогенности и динамике гликопротеомии в сложной ТМЭ.
Важнейшим этапом протокола является обеспечение полного протеолиза без переваривания белковой смеси. Неспецифические расщепления белков по своей природе увеличивают пространство для поиска пептидов, что приво.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
ТГК поддерживается стипендией Международной программы подготовки исследователей, финансируемой правительством Австралии. NB поддерживается Международными стипендиями Университета Маккуори за выдающиеся достижения в области исследований, финансируемыми Университетом Маккуори. AC поддерживается стипендией Программы исследовательской подготовки, финансируемой правительством Австралии. РК был поддержан Институтом рака Нового Южного Уэльса (ECF181259). MTA является получателем стипендии Австралийского исследовательского совета Future Fellowship (FT210100455).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильно>Химикаты | |||
| ацетат аммония | Sigma Aldrich | A1542 | Доступные альтернативы |
| бикарбонату аммония, чистоте &; 99,0% | Sigma Aldrich | A6141 | Доступные альтернативы |
| Безводный ацетонитрил (ACN), LC-MS класс | Sigma Aldrich | 34851 | Доступные альтернативы |
| Бычий фетуин | Sigma Aldrich | F3004 | Доступные альтернативы |
| Дитиотреитол (DTT) | Sigma Aldrich | D0632 | Доступные альтернативы |
| Этанол | Sigma Aldrich | E7023 | Доступные альтернативы |
| Муравьиная кислота, марка LC-MS | Sigma Aldrich | 00940 | Доступные альтернативы |
| Ледяная уксусная кислота | Sigma Aldrich | A6283 | Доступные альтернативы |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich | I1149 | Доступные альтернативы |
| Метанол | Sigma Aldrich | M1775 | Доступные |
| альтернативыПептид-N-гликозидаза F (PNGase F) | Promega | V4831 | Elizabethkingia miricola PNGase F (10 U/μ L) рекомбинантно экспрессируется в Escherichia coli |
| Поливинилпирролидон 40 (PVP) | Доступные альтернативы | Sigma Aldrich | PVP40 |
| Гидроксид калия (KOH) | Sigma Aldrich | 484016 | Доступные альтернативы |
| Секвенирование свиного трипсина | Promega | V5113 | Доступные альтернативы |
| Борогидрид натрия (NaBH4) | Sigma Aldrich | 213462 | Доступные альтернативы |
| Бикарбонат триэтиламмония (TEAB), LC-MS класс | Sigma Aldrich | T7408 | Доступные альтернативы |
| Трифторуксусная кислота (TFA), LC-MS класса | Sigma Aldrich | T6508 | Доступные |
| альтернативыTools/Materials | |||
| C18 диски | Empore | 66883-U | |
| C8 Empore | 66882-U | ||
| Плоскодонный полипропиленовый 96-луночный планшет | Мембрана Corning | 3364 | |
| Immobilon-PSQ поливинилидендифторид (PVDF) Миллипор | IPVH20200 | Размер пор: 0,45 μ М | |
| Микроцентрифуга | Eppendorf | 5452000069 | доступные альтернативы |
| Адаптеры для микроцентрифуг | Nest Group, Inc., MA | SS18V | MiniSpin Column Collar, поставляется с микроспиновыми колоннами |
| Oligo R3 смола | Thermo | 1133903 | размером частиц 30 μ m |
| Parafilm | Parafilm M | PM996 | |
| Пробирки Protein LoBind 1,5 мл | Eppendorf | 0030108450 | |
| пробирки Protein LoBind 2,0 мл | Eppendorf | 0030108442 | |
| пробирки Safe-lock 1,5 мл | Eppendorf | 0030120086 | |
| пробирки Safe-lock 2,0 мл | шейкер Eppendorf | 0030120094 | |
| шейкер | Eppendorf | 5382000066 | Доступные альтернативы |
| : Перфоратор с одним отверстием | Swingline | 74005 | |
| Концентратор SpeedVac | Martin Christ | RVC 2-25 CDplus | , Доступные альтернативы: |
| Supelclean, ENVI-Carb, SPE, смола, | Supelco | 57088 | размер частиц: 120-400 меш. Смола может быть вручную извлечена из картриджей и может храниться в течение длительного времени в 50% (v/v) метанола в воде MilliQ |
| Шприц 5 мл | Sigma Aldrich | Z116866 | Доступные альтернативы |
| Инкубатор с регулируемой температурой | Thermoline | E7.30 | Доступные альтернативы |
| Ультразвуковая ванна | Unisonics | FXP | Доступные альтернативы |
| ZIC-HILIC Merck | 150455 | Размер частиц/пор, 5 мкм; m/200 Å. Смола может быть вручную извлечена из колонки LC и может храниться в течение длительного времени в 50% (v/v) метанола в | |
| микроколонках MilliQ ZipTip C18 твердофазной экстракции (SPE) | Millipore | ZTC18S096 | В качестве альтернативы, микроколонки C18-SPE отечественного производства могут заменить коммерческую систему |
| LC-MS/MS Analysis | |||
| 1260 Infinity Capillary ВЭЖХ | Agilent | Alternatives | |
| Доступная аналитическая колонка LC, предварительно упакованная смолой ReproSil-Pur C18 AQ Dr | Maisch, Ammerbuch-Entringen, Germany | r13.aq.s2570 | Размер частиц/пор: 3 μ m/120 Å, длина/внутренний диаметр: 25 см/75 μm. Также доступны коммерческие колонны C18 nano-LC/ |
| Система Dionex UltiMate 3000 RSLCnano LC | Доступные термо | альтернативы | |
| HyperCarb KAPPA PGC капиллярная колонка LC | Thermo | Discontinued | Размер частиц/пор, 3 мкм; m/250 Å; длина колонны, 30 мм; внутренний диаметр, 0,180 мм. Более крупные геометрии колонок HyperCarb PGC-LC, выдающие данные аналогичного качества, доступны на рынке (например, Thermo #35003-031030). Колонка SupelTMCarb LC от Merck с размером частиц/пор 2,7 мкм; m/200 и с различными длинами колонн и внутренним диаметром (например, Merck #59994-U). |
| Доступны альтернативы ацетонитрилу | LiChrosolv | 100029 | класса |
| Квадруполь с линейной ловушкой (LTQ) Масс-спектрометр с ионной ловушкой Velos Pro (гликомика) | Доступны | альтернативы | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer (гликопротеомика) | Thermo Другие | системы МС высокого разрешения с ETD или без него (требуются только для O-гликопротеомики) также доступны (например, Q-Exactive HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap, Thermo, TIMS-ToF-MS, Bruker или аналогичные высокопроизводительные масс-спектрометры других производителей) | |
| Прозрачные стеклянные флаконы Total Recovery 0,9 мл | Доступны | альтернативы | THC11093563 |
| Recovery Прозрачные стеклянные винтовые флаконы подходящие крышки | Thermo | THC09150869 Доступны альтернативы | |
| Ловушка LC колонна упакована на собственном производстве с использованием смолы ReproSil-Pur C18 AQ | Dr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Германия | r15.aq.s0202 | Размер частиц/пор: 5 μ m/120 Å, длина/внутренний диаметр: 2 см/100 мкм. Также доступны коммерческие колонны C18 LC. |
| Software | |||
| Byonic | Protein Metrics Inc | v2.6.46 или выше | Коммерческая поисковая система гликопептидов и PTM, принимающая необработанные данные LC-MS/MS от большинства поставщиков MS |
| Byos | Protein Metrics Inc | v3.9-7 или выше | Коммерческое программное обеспечение для ручной проверки кандидатов на гликопептид и автоматического аннотирования спектров гликана MS/MS |
| GlycoMod | Программное обеспечение Expasy | Open access, помощь в аннотировании гликомических данных (https://web.expasy.org/glycomod/) | |
| GlycoWorkBench | EUROCarbDB | v2.1 | Программное обеспечение с открытым доступом, помощь в аннотировании гликомических данных и рисовании гликановых мультфильмов |
| RawMeat | VAST Scientific | v2.1 | Программное обеспечение открытого доступа, извлечение м/з ионов-предшественников гликана из необработанных спектральных данных |
| Skyline | Brendan X. MacLean | v21.2 или выше | Программное обеспечение открытого доступа для относительного количественного определения гликанов |
| Xcalibur | Thermo | v2.2 или выше | Для просмотра необработанных данных ЖХ-МС/МС |
Ссылки
- Gagneux, P., Panin, V., Hennet, T., Aebi, M., Varki, A. Essentials of glycobiology. , Cold Spring Harbor. NY. 265-278 (2022).
- Tjondro, H. C., Loke, I., Chatterjee, S., Thaysen-Andersen, M. Human protein paucimannosylation: Cues from the eukaryotic kingdoms. Biol Rev Camb Philos Soc. 94 (6), 2068-2100 (2019).....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
