Методическая статья

Разработка химерных антигенных рецепторов-естественных киллеров, нацеленных на грибковые инфекции с использованием невирусной транспозонной системы Sleeping Beauty

DOI:

10.3791/67424

⸱

4 октября 2024 г.

 ,  ,  ,  , 
1Medizinische Klinik und Poliklinik II und Lehrstuhl für Zelluläre Immuntherapie, Medizinische Klinik und Poliklinik II, Universitätsklinikum Würzburg, 2Fraunhofer-Institut für Zelltherapie und Immunologie IZI, Außenstelle Würzburg Zelluläre Immuntherapie

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем протокол трансфекции для получения химерных антигенных рецепторов-естественных киллеров (CAR-NK), нацеленных на грибковые патогены, с использованием невирусной транспозонной системы Sleeping Beauty. Чтобы оценить антиген-специфическую активацию, мы совместно культивировали сконструированные клетки с зародышевыми трубками Aspergillus fumigatus и измерили секрецию ИФН-γ.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клеточная терапия на основе химерных антигенных рецепторов (CAR) показала впечатляющую эффективность в лечении гематологических злокачественных новообразований. В последнее время эти методы лечения инфекционных заболеваний разрабатываются, но исследований, направленных на грибковые инфекции, остается мало. Для определения оптимальных мишеней и оптимизации клеточных продуктов мы разработали метод конструирования химерных антигенных рецепторов-естественных киллеров (CAR-NK) клеток и оценили их реакцию на стимуляцию грибами. В этой статье описывается простой и надежный метод получения CAR-NK-клеток, адаптированных к мишеням грибов, с использованием невирусной транспозонной системы Sleeping Beauty. Клетки NK-92 трансфицируют гиперактивной транспозазой SB100X, векторизированной в виде миникруглой ДНК (МЦ), вместе с плазмидным CAR-транспозоном. Эффективность трансфекции оценивают через 1 неделю с помощью проточного цитометрического анализа. Перед функциональным тестированием клетки, экспрессирующие трансген, обогащают с помощью магнитно-активированной сортировки клеток и культивируют в течение еще 1 недели. Для оценки антиген-специфической активации сконструированные клетки культивируют совместно с зародышевыми пробирками Aspergillus fumigatus в течение не менее 6 ч. В дальнейшем концентрацию секретируемого интерферона-гамма (ИФН-γ) измеряют с помощью иммуноферментного анализа.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) является повсеместно распространенным грибком, среднестатистический человек ежедневно вдыхает от 100 до 1000 конидий1. У пациентов с приобретенными или врожденными иммунодефицитами, например, проходящих химиотерапию или страдающих лейкемией, A. fumigatus может привести к тяжелому инвазивному апсергиллезу. Каждый год более 200 000 человек во всем мире заражаются аспергиллезом. Несмотря на использование антимикотиков для профилактики и терапии производными азола, смертность остается на уровне от 30% до 95%2,3. Кроме того, лечение имеет значительные побочные эффекты, и 7% культур A. fumigatus уже устойчивы к азолам4.

Терапия Т-клетками, сконструированными химерным антигенным рецептором (CAR), показала клинический успех в лечении злокачественных заболеваний и достигла многообещающих доклинических результатов в борьбе с инфекционными заболеваниями, такими как инвазивный аспергиллез 5,6,7,8. Ранее описанные нами Af-CAR-T-клетки, нацеленные на белок в клеточной стенке гиф A. fumigatus, показали многообещающие результаты в доклинических моделях6.

Снижение риска реакции «трансплантат против хозяина», синдрома высвобождения цитокинов и нейротоксичности делает CAR-NK-клетки ценной альтернативой CAR-T-клеткам в качестве «готового» лечения острых инфекций9. Кроме того, было показано, что NK-клетки играют решающую роль в противогрибковом иммунном ответе. При стимуляции A. fumigatus NK-клетки секретируют цитокины, такие как IFN-ɣ, и хемокины, такие как CCL-3 и CCL-4, и высвобождают цитотоксические гранулы10,11.

Клеточная линия NK-92 является популярным источником NK-клеток для генной инженерии, предлагая преимущество быстрой пролиферации и экспансии в относительнопростых условиях культивирования. Несколько доклинических исследований продемонстрировали терапевтический потенциал CAR-трансдуцированных клеток NK-92 в лечении как гематологических, так и солидных опухолей. В настоящее время проводятся многочисленные клинические испытания с целью изучения их безопасности, эффективности и потенциального использования в качестве «готовой» клеточнойтерапии.

Достижение высокой эффективности трансфекции и стабильной экспрессии трансгенов в NK-клетках является сложной задачей. В то время как вирусные методы обещают высокую эффективность, они несут риск инсерционных мутаций с последующим онкогенезом 9,14. Последнее поколение транспозонных векторов Sleeping Beauty (SB) предлагает безопасную, мощную и экономически жизнеспособную систему для стабильного переноса генов, преодолевая ограничения вирусных и транзиторных невирусных методов доставки генов.

Таким образом, в данном протоколе изложена новая методология получения клеток Af-CAR-NK-92, которые потенциально могут служить в качестве «готового» терапевтического варианта для пациентов с угрожающим жизни инвазивным аспергиллезом. Эффективность этого подхода проявляется в увеличении продукции ИФН-ɣ при стимуляции гифами A. fumigatus .

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все описанные здесь эксперименты должны проводиться в стерильных условиях. В этом протоколе мы показываем два условия: (I) имитация трансфекции без ДНК, которая будет служить контролем, и (II) CAR-трансфекция с использованием ранее описанного Af-CAR6. Плазмида Af-CAR содержит последовательность усеченного рецептора эпидермального фактора роста (EGFRt) после CAR, которая будет использоваться в качестве маркера трансфекции (дополнительный рисунок S1). Для каждого условия требуется 4 × 106 ячеек НК-92.

1. Культивирование клеток NK-92

  1. За один-два дня до трансфекции готовят свежую питательную среду для клеточных культур со следующим составом: 75% (v/v) альфа-MEM Medium (с нуклеозидами) + 12,5% (v/v) тепло инактивированная фетальная бычья сыворотка (FBS) + 12,5% (v/v) тепло инактивированная лошадиная сыворотка + 2 мМ L-глутамина.
  2. Ресуспендировать не менее 107 NK-92 клеток при плотности клеток 5 ×10 5 клеток/мл.
  3. Добавьте в клеточную суспензию IL-2 в концентрации 150 ЕД/мл.
  4. Культивируйте клетки во влажном инкубаторе при температуре 37 °C с 5%CO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: IL-2 можно использовать в конечной концентрации 5 нг/мл.

2. Невирусная трансфекция

  1. Проверьте качество клеток под микроскопом. Суспензия клеточных кластеров и четкий фон свидетельствуют о здоровой клеточной культуре.
  2. В 6-луночный планшет добавьте 2 мл среды для клеточных культур на лунку для каждого состояния. Поместите планшет во влажный инкубатор при температуре 37 °C с 5%CO2.
    Примечание: Антибиотики могут снижать жизнеспособность клеток после трансфекции. Не принимайте антибиотики.
  3. Подсчитайте клетки и проверьте жизнеспособность клеток с помощью (например, окрашивания Trypan Blue).
  4. Переложите 8 × 106 ячеек NK-92 в коническую донную трубку объемом 15 мл. Центрифуга при 200 × g в течение 5 мин с ускорением и замедлением 3. Используйте эту программу для всех последующих этапов центрифугирования.
  5. Во время центрифугирования подготовьте две реакционные пробирки объемом 1,5 мл. Пипеткой введите ДНК для Af-CAR (8 г плазмидной ДНК и 4 г SB100X Mini Circle, таблица 1) в одну из пробирок. Оставьте второй без ДНК, чтобы он был фиктивным контролем.
  6. Когда центрифуга будет готова, аккуратно выбросьте надосадочную жидкость и заполните пробирку, содержащую клетки, до 15 мл предварительно подогретого фосфатно-солевого буфера (PBS).
  7. Центрифуга (шаг 2.4).
  8. Во время центрифугирования подготовьте по одной пробирке трансфекционной системы для каждого состояния, добавив 3 мл электролитического буфера в каждую пробирку. Вставьте первую трубку в станцию для дозатора.
  9. Когда центрифуга будет готова, аккуратно выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 200 мкл буфера для ресуспензии (100 мкл/4 × 106 клеток).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не оставляйте клетки в буфере для ресуспензии более чем на 15-30 минут, так как это снижает жизнеспособность клеток и эффективность трансфекции.
  10. Добавьте по 100 мкл клеточной суспензии в каждую из двух реакционных пробирок. Аккуратно перемешайте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте образования пузырьков воздуха во время пипетирования, так как пузырьки воздуха вызывают образование дуги, что приводит к гибели клеток.
  11. Пипетку ДНК-клеточную смесь из первой реакционной пробирки с помощью пипетки трансфекционной системы и вертикально вставить пипетку в пробирку, помещенную в пипетную станцию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что наконечник подходит правильно.
  12. Установите первый импульс на 1 650 В и время импульса в течение 20 мс и нажмите кнопку Start.
  13. После завершения установите второй импульс на 500 В и время импульса в течение 100 мс. Нажмите кнопку Старт.
  14. По завершении медленно извлеките пипетку из пипеточной станции и немедленно перенесите клетки в одну лунку подготовленной культуральной тарелки, содержащую 2 мл предварительно подогретой среды для культивирования клеток (см. шаг 2.2). Аккуратно перемещайте пластину по кругу, чтобы убедиться, что ячейки равномерно распределены.
  15. Для образца Mock возьмите 100 мкл клеточной суспензии из реакционной пробирки без ДНК (см. шаг 2.9) и повторите ту же процедуру с шага 2.11 по шаг 2.14, используя новую пробирку и новый наконечник для пипетки.
  16. Инкубируйте планшет в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C с 5%CO2.
  17. Через 30 минут инкубации добавьте IL-2 в конечной концентрации 150 ЕД/мл.

3. Проверка эффективности трансфекции с помощью проточной цитометрии

  1. После 1 недели культивирования и расщепления клеток через день возьмите по 1-5 ×10 5 клеток каждого состояния в полистирольную трубку с круглым дном.
  2. Промойте ячейки, добавив 1 мл буфера (PBS + 0,5% (v/v) FBS + 2 мМ ЭДТА); центрифугу и выбросьте надосадочную жидкость.
  3. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в 50 мкл буфера. Добавьте 1 мкл 7-AAD для обнаружения мертвых клеток.
  4. Добавьте 5 мкл антитела anti-tEGFR-Alexa fluor 647 для окрашивания трансфицированных клеток.
  5. Выдерживать в течение 20 минут при температуре 4 °C.
  6. Вымойте клетки (см. пункт 3.2).
  7. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в 200 мкл буфера.
  8. Измерьте образцы на проточном цитометре.
    Примечание: Если эффективность трансфекции не удовлетворительна, продолжайте обогащение трансген-экспрессирующими клеток.

4. Обогащение трансген-экспрессирующих клеток путем магнитно-активируемой сортировки клеток (MACS)

ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения оптимальных результатов начните протокол с 8-10 ×10 6 клеток. Все этапы центрифугирования проводятся при температуре 4 °C.

  1. Подготовьте буфер, как описано в шаге 3.2. Разбавьте клетки в концентрации 1-2 × 106/100 мкл с буфером в пробирке с коническим дном объемом 15 мл.
  2. Добавьте 1 мкл анти-EGFRt-биотина на 1-2 × 106 клеток и аккуратно перекрутите пробирку, чтобы обеспечить равномерное распределение раствора.
  3. Инкубируйте в течение 25 минут при 4 °C, затем заполните пробирку до 10 мл буфера.
  4. Центрифуга. Выбросьте надосадочную жидкость.
  5. Добавьте 8 μл/1 × 106 ячеек холодного буфера.
  6. Добавьте 2 мкл антибиотиновых магнитных шариков на 1 ×10 6 клеток.
  7. Выдерживать в течение 15 минут при температуре 4 °C.
  8. Умыться, наполнив до 10 мл буфером.
  9. Центрифуга. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 500 мкл буфера.
  10. Поместите колонку LS в магнит MACS и промойте 3 мл буфера.
  11. Как только буфер полностью перекочевал по столбцу, добавьте суспензию ячеек.
  12. Промойте колонку 3 раза, каждую с 3 мл буфера.
  13. Снимите колонку с магнита и поместите ее в чистую пробирку с коническим дном объемом 15 мл.
  14. Добавьте в столбец 5 мл буфера. С помощью поршня как можно быстрее промойте EGFR-положительные клетки.
  15. Культивируйте клетки в течение нескольких дней; Затем проверьте эффективность с помощью проточной цитометрии.

5. Функциональное тестирование

ПРИМЕЧАНИЕ: Для предстоящего эксперимента приготовьте и используйте следующую среду: RPMI + 20% FBS.

  1. День 1 – Посев Aspergillus fumigatus conidia
    1. Готовят суспензию A. fumigatus conidia в концентрации 2,5 ×10 5 конидий/мл в среде.
    2. В 96-луночный планшет для культивирования пипетируют 100 мкл суспензии конидий на лунку и инкубируют при 25 °C в течение 16 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После инкубационного периода конидии прорастут (Рисунок 1).
  2. День 2 - Ко-культивирование с клетками CAR NK-92
    1. Промойте элементы Mock и Af-CAR NK-92 2x с этим средством.
    2. Совместное культивирование с грибом при соотношении эффекторов к мишеням 2:1 путем добавления 5 × 104 клеток в 100 мкл среды на лунку (рис. 2).
    3. Для положительного контроля добавьте 1 нг PMA и 100 нг иономицина на лунку в 100 мкл среды. Используйте клетки в среде только в качестве отрицательного контроля.
    4. Инкубируйте планшет при температуре 37 °C в увлажненном инкубаторе сCO2 в течение не менее 6 часов.
    5. Центрифугируйте планшет при 300 × г в течение 5 минут.
    6. Соберите по 100 мкл из каждой лунки; Избегайте прикосновения к дну. Перенесите надосадочную жидкость в реакционные пробирки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что пипетируется только надосадочная жидкость, а не выращенный грибок. Если сомневаетесь, добавьте еще одну ступень центрифугирования.
    7. Выполняйте ИФН-ɣ ИФА, следуя инструкциям производителя, или храните образцы при температуре -80 °C до использования.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Весь процесс получения клеток Af-CAR NK-92, включая трансфекцию, восстановление, обогащение и экспансию, занимает примерно 14 дней. После трансфекции клетки культивируются и расщепляются каждый второй день. Жизнеспособность клеток может снижаться во время первого расщепления через два дня после трансфекции. Как правило, клетки восстанавливаются через 4 дня после трансфекции и начинают пролиферировать, причем время удвоения составляет 48 часов.

После восстановления измеряется эффективность трансфекции, которая, как ожидается, достигнет 10-20% (репрезентативные результаты показаны на рисунке 3). Обогащение EGFR-позитивных клеток с помощью MACS увеличивает процент клеток Af-CAR NK-92 до более чем 95% (репрезентативные результаты показаны на рисунке 4).

Для функционального анализа использовали культуры с более чем 95% клеток Af-CAR. Здесь мы совместно культивировали клетки с зародышевыми трубками A. fumigatus в течение 6 ч и измерили секрецию ИФН-ɣ в качестве маркера активации. Как показано на рисунке 5, клетки Af-CAR продемонстрировали значительную секрецию цитокинов (среднее = 340,6 ± 86,5 пг/мл) по сравнению с клетками Mock NK-92 (среднее = 75,6 ± 19,5 пг/мл), что указывает на значительно более высокую активацию клеток Af-CAR (p-значение = 0,03).

figure-results-1
Рисунок 1: Зародышевые трубки Aspergillus fumigatus. Микроскопическое изображение A. fumigatus после 16 ч инкубации. Зародышевые трубки/маленькие гифы наблюдаются и равномерно распределяются по лунке. Масштабная линейка = 400 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Совместное культивирование зародышевых трубок Aspergillus fumigatus с клетками NK-92. Микроскопическое изображение кокультуры. Клетки NK-92 образуют кластеры и находятся в контакте с зародышевыми трубками A. fumigatus . Масштабная линейка = 400 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Иллюстрация 3: Оценка эффективности трансфекции путем окрашивания на маркер трансфекции EGFR. На 5-е сутки после электропорации клетки NK-92 окрашивали 7-AAD и анти-EGFR. Приведены результаты одного репрезентативного эксперимента для (A) Mock и (B) Af-CAR NK-92 клеток. В левом столбце показаны точечные диаграммы зависимости размера ячейки от гранулярности ячейки; Затвор установлен на ячейках НК-92. Мертвые клетки удаляются с помощью маркировки 7-AAD (вторая колонка). Процент живых клеток EGFR+ показан в третьем столбце. Сокращения: EGFR = рецептор эпидермального фактора роста; 7-AAD = 7-аминоактиномицин D; CAR = химерный антигенный рецептор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Окрашивание поверхности клетки происходит после обогащения NK-92 клеток, экспрессирующих трансген. Слева отображаются макеты ячеек. Справа показаны ячейки Af-CAR-NK. Красными гистограммами обозначены неокрашенные клетки. Синие гистограммы представляют собой соответствующие окрашенные клетки. Вентиль устанавливается на ячейки EGFR+ ; Цифры показывают процент положительных клеток. Сокращения: EGFR = рецептор эпидермального фактора роста; CAR = химерный антигенный рецептор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Секреция цитокинов NK-клеток, активированная зародышевыми трубками Aspergillus fumigatus . На диаграммах представлены результаты секреции IFN-ɣ клеток Af-CAR и Mock в кокультуре с грибком, измеренные методом ИФА через 6 ч совместного культивирования. Представленные данные представляют собой среднее значение ± SD трех независимо проведенных экспериментов (n = 3). P-значение рассчитано по t-критерию Уэлча с использованием GraphPad Prism 10, * p < 0,05. Сокращения: NK = природный убийца; ИФН-ɣ = гамма-интерферон; CAR = химерный антигенный рецептор; ИФА = иммуноферментный анализ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

ИмяКомпанияКонцентрация запасовСсылка
ТранспозазаSB100X Мини КругПлазмидная фабрика1 μг/μл19
ТранспозонПлазмида Af-CARПроизводится на собственном производстве1 μг/μл6

Таблица 1: ДНК, используемая в этом протоколе.

Дополнительный рисунок S1: Плазмидная карта транспозона Af-CAR: Схема плазмидного вектора и дизайн CAR-транспозона. Сокращения: EF1 = коэффициент удлинения-1 альфа-промотор; ORI = бактериальное происхождение репликации; LIR = левый инвертированный повтор; RIR: правый инвертированный повтор; Cyto = Цитоплазматический; Tm = Трансмембранный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Предоставленный протокол предлагает простой и надежный метод создания CAR-NK-клеток, нацеленных на грибковые патогены, с помощью невирусной транспозонной системы Sleeping Beauty. Этот метод позволяет осуществлять стабильную и постоянную вставку больших трансгенов, что позволяет при экспансии клеток получать необходимые количества для дальнейшего анализа14,16.

На успех трансфекции могут влиять несколько ключевых факторов, в том числе количество и жизнеспособность клеток, сила и продолжительность пульса, а также качествои количество ДНК. Очень важно оценить здоровье клеток перед началом работы, обеспечив жизнеспособность не менее 90%. Было продемонстрировано, что повышенная сила импульса может повысить эффективность трансфекции клеточной популяции. Однако такой подход также может привести к значительному снижению жизнеспособности клеток. В случаях с избытком клеток и ограниченным количеством или качеством ДНК количество клеток, успешно поглощающих плазмиду, можетбыть недостаточным. Тем не менее, было продемонстрировано, что высокие концентрации ДНК токсичны и снижают жизнеспособность клеток18.

В предыдущих исследованиях была достигнута более высокая эффективность трансфекции, но основное внимание уделялось исключительно транзиторной экспрессии белка17. В отличие от этого, наш протокол обеспечивает стабильную вставку трансгенов. Чтобы решить проблему низкой эффективности трансфекции, мы внедрили обогащение положительно трансфицированных клеток и достигли примерно 95% клеток, экспрессирующих CAR. Однако это увеличило время производства до ~1 недели. Если требуется более короткое время производства, транспозонная ДНК может быть доставлена в виде мини-круга, что может повысить эффективность трансфекции и может устранить необходимость в стадииобогащения 19. Тем не менее, время производства не может быть сокращено до <1 недели, чтобы обеспечить восстановление и пролиферацию клеток.

Учитывая острый характер инвазивного аспергиллеза, «готовые» клеточные методы лечения будут полезны. Проблемы и затраты, связанные с выделением клеток у пациентов и расширением первичных клеток, увеличили популярность NK-92 как удобной клеточной линиидля производства CAR-NK-клеток. Клетки NK-92, как правило, устойчивы и быстро пролиферируют в присутствии IL-2, что способствует получению больших количеств клеток за относительно короткий период. В свете этих преимуществ мы разработали протокол генной инженерии клеток NK-92, демонстрирующий, что можно безопасно трансфектировать и получать клеточные продукты CAR-NK с высокой чистотой. Хотя этот протокол может быть адаптирован для получения первичных CAR-NK-клеток, следует рассмотреть несколько модификаций. К ним относятся оптимизация количества и интенсивности импульсов, количества используемой ДНК и создание подходящего протокола расширения. Любые изменения в протоколе потребуют тщательного расследования для обеспечения эффективности. Тем не менее, наш протокол обеспечивает основополагающий шаблон, который может быть адаптирован для первичных NK-клеток в будущих экспериментах.

Таким образом, этот инновационный протокол трансфекции для получения стабильных Af-CAR-NK-клеток является эффективным и воспроизводимым методом, который может быть использован для борьбы с другими заболеваниями. Кроме того, он может быть использован в качестве экономически эффективного метода скрининга новых CAR, нацеленных на различные антигены.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

М.Х.: Изобретатель по патентным заявкам и выданным патентам, связанным с технологией CAR, частично лицензированный для промышленности. Соучредитель и акционер T-CURX GmbH, Вюрцбург. Гонорар докладчиков: BMS, Janssen, Kite/Gilead, Novartis. Научно-исследовательское сопровождение: BMS. М. Б. сообщает о поддержке путешествий от фармацевтической компании «Eli Lilly and company», которая не имеет отношения к данному исследованию. У других авторов нет конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Финансирование и поддержка проекта были предоставлены Фондом Вильгельма Зандера, проект 2020.017.1 — M.H. и J.L.; Deutsche Forschungsgemeinschaft (Центр совместных исследований/Transregio 124 Патогенные грибы и их хозяин-человек: сети взаимодействия-FungiNet; проект A8 to M.H. и H.E.).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
15 мл конические донные пробиркиGreiner Bio-One188271PP, 17/120 ММ, CELLSTAR, СТЕРИЛЬНЫЕ
50 мл конические донные пробиркиGreiner Bio-One227270PP, 30/115 ММ, CELLSTAR, СТЕРИЛЬНЫЕ
6- и 96-луночные клеточные культуральные планшетыCorning Inc. LifeSciences83-3736/ 83-3474TC-обработанные многолуночные планшеты, плоские днища, обработанные для оптимального прикрепления клеток, стерилизованные гамма-излучением, Непирогенный
7-AAD (7-аминоактиномицин D)BD Biosciences559925легко используемый краситель нуклеиновой кислоты для исключения нежизнеспособных клеток в проточных цитометрических анализах
Alexa Fluor 647 античеловеческий антителоEGFR Biolegend352918клон AY13
антибиотин микрогранулы UltraPureMiltenyi Biotec130-105-637UltraPure микрогранулы, конъюгированные с моноклональным мышиным антибиотином антитела
Aspergillus fumigatusATCC46645
Биосферные фильтрующие наконечники (20 и 100; L) Sarstedt70.3030.365 / 70.3030.275
Dulbecco′ s Фосфатно-солевой буфер (PBS)Sigma-AldrichD8537  Модифицированный, без хлорида кальция и хлорида магния, жидкий, стерильно-фильтрованный, пригодный для культивирования клеток, эндотоксин,
протестированный ELISA MAX Deluxe Set Human IFN-γBiolegend430104
раствор соли этилендиаминтетрауксусной кислоты динатрия (ЭДТА)Sigma-AldrichE7889для молекулярной биологии, 0,5  M в H2O, ДНКазе, РНКазе, НИКазе и протеазе, не обнаружено, 0,2 μ m отфильтровано.
FACS cleanBD Biosciences340345
FACS Жидкость для оболочкипотока BD Biosciences342003
раствор для полосканияFACS BD Bioscience340346
фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS)Sigma-AldrichF7524стерильно-фильтрованный, подходит для клеточной культуры, перед использованием инактивирован при нагревании
Gibco, MEM α, нуклеозидыThermofisher Научный22571020Фенол Красный, Рибонуклеозиды, Дезоксирибонуклеозиды, Бикарбонат натрия
Лошадиная сывороткаThermo Fisher Scientific16050122Стерильно-отфильтрованная, термоинактивированная перед использованием
Human IL-2 IS, исследовательский классMiltenyi Biotec130-097-742Исследовательский класс. ED50 — это ≤ 0,3 нг/мл, что соответствует активности ≥ 3 раза; 106 МЕ/мг.
ИономицинSigma-AldrichI0634-1MGиз Streptomyces conglobatus, используемый в качестве положительного контроля секреции цитокинов 
L-глутаминSigma-AldrichW368401для клеточной культуры
MACS LS ColumnMiltenyi Biotec130-042-401  Колонки и плунжеры стерильные упакованные
NK-92DSMZACC 488
Neon Transfektionssystem 100  μ L-KitThermo Fisher ScientificMPK10096буфер для ресуспензии R, электролитический буфер E2, 100 мкм; L Неоновые наконечники, неоновые электропорационные трубки
Phorbol-12-myristat-13-ацетат (PMA)Sigma-AldrichP1585-1MGиспользуются для положительного контроля секреции цитокинов 
Трубка из полистирола с круглым дном, 5 млBD BioscienceS-452400используемая для проточной цитометрии
Реакционная трубка, 1,5 млGreiner Bio-One7,26,90,001PP, прозрачная, крышка прикреплена, с инъекционной градуировкой. Стерилизуется перед использованием.
RPMI 1640 Medium, GlutaMAXThermo Fisher Scientific72400021GlutaMax I,  Фенол красный, HEPES, стерильно-фильтрованный
TipOne 1000 μ Наконечник для градуированного фильтра L XLStarLabS1122-1730
Equipment
BD FACSCaliburBD Bioscience
CO2 инкубатор C60 Labotect
Heraeus Multifuge 3SRThermo Scientific
HydroFLEX моечная машина для микроплит Tecan
NanoQuant Infinite M200 ProTecan
Neon Transfection SystemInvitrogen
Pipettes Eppendorf
Quadro MACS Separator Милтеньи Биотек
,

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fang, W., Latgé, J. -P. Microbe profile: Aspergillus fumigatus: A saprotrophic and opportunistic fungal pathogen. Microbiology (Reading). 164 (8), 1009-1011 (2018).
  2. Brown, G. D., et al. Hidden killers: Human fungal infections. Sci Transl Med. 4 (165), 165rv113(2012).
  3. Sun, K. S., Tsai, C. F., Chen, S. C., Huang, W. C. Clinical outcome and prognostic factors associated with invasive pulmonary aspergillosis: An 11-year follow-up report from Taiwan. PLoS One. 12 (10), e0186422(2017).
  4. Meis, J. F., Chowdhary, A., Rhodes, J. L., Fisher, M. C., Verweij, P. E. Clinical implications of globally emerging azole resistance in Aspergillus fumigatus. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 371 (1709), 20150460(2016).
  5. Seif, M., Einsele, H., Löffler, J. CAR T cells beyond cancer: Hope for immunomodulatory therapy of infectious diseases. Front Immunol. 10, 2711(2019).
  6. Seif, M., et al. CAR T cells targeting Aspergillus fumigatus are effective at treating invasive pulmonary aspergillosis in preclinical models. Sci Transl Med. 14 (664), eabh1209(2022).
  7. Kumaresan, P. R., et al. Bioengineering T cells to target carbohydrate to treat opportunistic fungal infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10660-10665 (2014).
  8. Kumaresan, P. R., et al. A novel lentiviral vector-based approach to generate chimeric antigen receptor T cells targeting Aspergillus fumigatus. mBio. 15 (4), e0341323(2024).
  9. Lu, H., Zhao, X., Li, Z., Hu, Y., Wang, H. From CAR-T cells to CAR-NK cells: A developing immunotherapy method for hematological malignancies. Front Oncol. 11, 720501(2021).
  10. Robertson, M. J., Ritz, J. Biology and clinical relevance of human natural killer cells. Blood. 76 (12), 2421-2438 (1990).
  11. Ziegler, S., et al. CD56 is a pathogen recognition receptor on human natural killer cells. Sci Rep. 7 (1), 6138(2017).
  12. Esmaeilzadeh, A., Hadiloo, K., Jabbari, M., Elahi, R. Current progress of chimeric antigen receptor (car) t versus car nk cell for immunotherapy of solid tumors. Life Sci. 337, 122381(2024).
  13. Zhang, J., Zheng, H., Diao, Y. Natural killer cells and current applications of chimeric antigen receptor-modified NK-92 cells in tumor immunotherapy. Int J Mol Sci. 20 (2), 317(2019).
  14. Hu, Y., Tian, Z. G., Zhang, C. Chimeric antigen receptor (CAR)-transduced natural killer cells in tumor immunotherapy. Acta Pharmacol Sin. 39 (2), 167-176 (2018).
  15. Hudecek, M., et al. Going non-viral: The Sleeping Beauty transposon system breaks on through to the clinical side. Crit Rev Biochem Mol Biol. 52 (4), 355-380 (2017).
  16. Amberger, M., Ivics, Z. Latest advances for the Sleeping Beauty transposon system: 23 years of insomnia but prettier than ever. BioEssays. 42 (11), 2000136(2020).
  17. Ingegnere, T., et al. Human car nk cells: A new non-viral method allowing high efficient transfection and strong tumor cell killing. Front Immunol. 10, 957(2019).
  18. Stacey, K. J., Ross, I. L., Hume, D. A. Electroporation and DNA-dependent cell death in murine macrophages. Immunol Cell Biol. 71 (Pt 2), 75-85 (1993).
  19. Monjezi, R., et al. Enhanced CAR T-cell engineering using non-viral Sleeping Beauty transposition from minicircle vectors. Leukemia. 31 (1), 186-194 (2017).
  20. Moscarelli, J., Zahavi, D., Maynard, R., Weiner, L. M. The next generation of cellular immunotherapy: Chimeric antigen receptor-natural killer cells. Transplant Cell Ther. 28 (10), 650-656 (2022).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CAR NKNK 92Aspergillus fumigatus

Похожие статьи