Методическая статья

Достижения в области индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток, экспрессирующих химерные антигенные рецепторы естественных киллеров

DOI:

10.3791/67438

⸱

14 февраля 2025 г.

 , 
1Department of Medicine, Division of Regenerative Medicine, University of California, San Diego, 2Sanford Stem Cell Institute, University of California, San Diego

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной работе мы представляем метод дифференцировки и расширения естественных клеток-киллеров, экспрессирующих химерный антигенный рецептор (CAR) человека, с улучшенным уничтожением против различных злокачественных новообразований. Этот протокол демонстрирует дифференцировку и экспансию естественных киллеров (NK), оптимизированных iPSC-клеток CAR-NK, а также измерение противоопухолевой активности в отношении различных линий опухолевых клеток.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Естественные киллеры (NK) — это врожденные иммунные клетки, которые играют решающую роль в защите организма от опухолей и вирусных инфекций. Генерация рецептора химерного антигена (CAR), полученного из человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC), экспрессирующего NK-клетки, стала многообещающим направлением для «готовой» иммунотерапии рака. В данной работе мы использовали оптимизированную для NK-клеток конструкцию CAR, которая включает трансмембранный домен NKG2D, костимулирующий домен 2B4 и сигнальный домен CD3ζ, который, как было продемонстрировано, стимулирует устойчивую антиген-специфическую противоопухолевую активность, опосредованную NK-клетками. Использование иПСК для генерации клеток CAR NK имеет ряд преимуществ, включая гомогенную экспрессию CAR, масштабируемость, воспроизводимость и потенциал для клинического применения. Этот подробный пошаговый протокол от клеточной инженерии до дифференцировки позволяет создавать оптимизированные NK-клетки, полученные из iPSC, экспрессирующие NK-клетки, обеспечивая стандартизированную и целевую иммунотерапию рака с улучшенной противоопухолевой активностью и подчеркивая их потенциал в качестве перспективного варианта лечения различных злокачественных новообразований.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NK-клетки, тип лимфоцитов в рамках врожденной иммунной системы, играют ключевую роль в ранней защите от опухолей и вирусно инфицированных клеток 1,2,3. В отличие от Т-клеток, NK-клетки не требуют презентации антигена через молекулы основного комплекса гистосовместимости (MHC). Вместо этого NK-клетки имеют репертуар активирующих и тормозных рецепторов, которые регулируютих активность. Цитотоксическая активность, опосредованная NK-клетками, использует различные механизмы, включая высвобождение перфорина и гранзимов, задействование рецепторов смерти и продукцию провоспалительных цитокинов, таких как ИФН-γ и ФНО-α. Этот уникальный механизм действия делает NK-клетки привлекательным кандидатом для иммунотерапии рака, особенно при лечении солидных раковых опухолей, где уклонение от иммунитета является значительным препятствием 1,2,3,4.

Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) является одной из самых распространенных и смертельно опасных форм рака печени во всем мире5. Традиционные терапевтические подходы, включая хирургию, химиотерапию и лучевую терапию, обычно обеспечивают ограниченную клиническую пользу и приводят к высокой частоте рецидивов 6,7. Последние достижения в области иммунотерапии и таргетной терапии значительно повлияли на лечение ГЦК 8,9. Ингибиторы контрольных точек иммунного ответа, такие как ниволумаб и пембролизумаб, показали многообещающие результаты, усиливая ответ иммунных клеток против раковых клеток10,11. Эти методы лечения привели к улучшению показателей выживаемости и улучшению качества жизни некоторых пациентов. Тем не менее, они также могут вызывать побочные эффекты, связанные с иммунитетом, что может ограничить их использование у некоторых пациентов12. Таргетная терапия, такая как сорафениб и ленватиниб, специфически ингибирует пути, способствующие росту раковых клеток и ангиогенезу13. Эти методы лечения известны своей эффективностью в контроле прогрессирования заболевания и продлении выживаемости 8,14. Тем не менее, обычно развивается резистентность к таргетной терапии, и побочные эффекты лечения являются распространенными15,16. Среди многообещающих направлений иммунотерапевтических стратегий рака появление химерных антигенных рецепторов (CAR) CAR-Т-клеток произвело революцию в лечении рака, особенно в лечении гематологических злокачественных новообразований, таких как лимфома и множественная миелома 17,18,19.

NK-клетки, экспрессирующие CAR, сочетающие в себе врожденную цитотоксическую активность NK-клеток с точным нацеливанием технологии CAR, представляют собой инновационный и потенциально преобразующий подход к лечению солидных опухолей, таких как HCC 20,21,22,23,24. CAR-инженерные клетки могут специфически распознавать и убивать опухолевые клетки, экспрессирующие целевой антиген, сохраняя при этом нормальные ткани, тем самым снижая риск побочных эффектов, связанных с традиционными методами лечения 25,26,27. CAR-NK-клетки, полученные из NK-клеток, выделенных из периферической крови или пуповинной крови, обычно получают путем трансдуцирования NK-клеток с конструкциями CAR, которые состоят из внеклеточного домена распознавания антигена, трансмембранного домена и внутриклеточных сигнальных доменов, необходимых для активации и пролиферации 28,29,30.

Проблема создания стабильной и однородной популяции функционально модифицированных NK-клеток для клинического лечения может быть решена путем использования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК)31,32. Инженерия человеческих ИПСК с оптимизированными для NK-клеток CAR обеспечивает улучшенную активацию и сигнал пролиферации NK-клеток, а также обеспечивает неисчерпаемую и однородную популяцию CAR-экспрессирующих NK-клеток в качестве стандартизированной, «готовой терапии»20,33. В этом протоколе генетическая модификация ИПСК для получения CAR-экспрессирующих ИПСК NK-клеток включает интеграцию оптимизированной для NK-клеток CAR-конструкции, которая включает трансмембранные и сигнальные домены, полученные из NK-клеток (NKG2D-2B4-CD3ζ) и антиглипикан-3 (GPC3) scFv, как описано в наших предыдущихисследованиях 23. Затем генетически модифицированные ИПСК дифференцируют и расширяют с использованием протокола дифференцировки NK-клеток, разработанного ранее34. Эти сконструированные NK-клетки, экспрессирующие CAR-экспрессирующие iPSC, обладают способностью распознавать и элиминировать ГЦК и другие опухолевые клетки, экспрессирующие специфические опухолеассоциированные антигены, такие как Glypican 3 (GPC3), который сверхэкспрессируется при ГЦК и других злокачественных новообразованиях 35,36,37,38.

Применение CAR-NK-клеток, полученных из iPSC, для лечения различных видов рака имеет значительные перспективы 30,39,40; многие из этих CAR-NK-клеток, полученных из iPSC, в настоящее время проходят клинические испытания 41,42,43. Чтобы способствовать прогрессу в этой области, этот протокол позволяет эффективно производить сконструированные CAR-NK-клетки, полученные из iPSC, от клеточной инженерии до дифференцировки в зрелые NK-клетки и экспансии in vitro.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Беспитательный метод культивирования ИПСК человека

ПРИМЕЧАНИЕ: Разморозьте замороженные недифференцированные человеческие ИПСК и культивируйте их с использованием mTeSR 1-plus на пластинах с предварительно покрытым покрытием Matrigel (далее именуемых матрицей базальной мембраны [BMM]), как описано ранее 23,34. Очень важно убедиться, что iPSC не дифференцированы до и после проектирования. Свежеразмороженные ИПСК следует культивировать в течение примерно 2-3 пассажей, чтобы продемонстрировать морфологию плюрипотентности, соответствующую плюрипотентным стволовым клеткам человека. Следующие инструкции используются для пропускания клеток из одной лунки 6-луночного планшета.

  1. Перед вводом иПСК покройте новый 6-луночный планшет 1x BMM (1 мл/лунка) и инкубируйте в инкубаторе при температуре 37 °C в течение 2-4 часов перед использованием.
  2. Приготовьте 1x растворимый BMM.
    1. Разморозьте стоковый флакон BMM объемом 5 мл при 4 °C в течение ночи.
    2. Быстро аликвотируйте BMM с помощью предварительно охлажденных наконечников в предварительно охлажденные микроцентрифужные пробирки.
    3. Хранить при температуре -80 °C до 6 месяцев.
    4. Для приготовления 1x рабочего раствора BMM необходимо повторно суспендировать одну аликвоту BMM в соотношении 1:100 в холодную среду DMEM/F12. Рабочий раствор 1x BMM можно хранить при температуре -4 °C в течение 2 недель.
    5. Покройте планшет достаточным объемом, чтобы покрыть поверхность (например, используйте 1 мл на лунку 6-луночного планшета).
    6. Перед использованием инкубировать в инкубаторе при температуре 37 °C в течение 2-4 часов.
  3. Разморозьте флакон с замороженными ИПСК (обычно 1 × 10,6 клеток/флакон) на водяной бане при 37 °C.
  4. Постепенно добавляйте размороженные iPSCs в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 5 мл предварительно подогретой среды mTeSR Plus, позволяя клеткам акклиматизироваться, добавляя их по каплям, чтобы свести к минимуму клеточный шок.
  5. Центрифугируйте клетки при 300 × г в течение 5 минут.
  6. Отсадите надосадочную жидкость и промойте клетки один раз 5 мл PBS.
  7. Ресуспендируйте клетки в среде mTeSR Plus и наложите на них плотность около 200 000 клеток/3 мл/лунку в 6-луночный планшет с предварительно нанесенным покрытием BMM.
  8. Прохождение iPSCs.
    1. Как только iPSCs достигнут 70-80% конфлюенции, аспирируйте среду и выполняйте пассирование одиночных клеток TrypLE в течение 5 минут при 37 °C (1 мл/лунка в 6-луночном планшете).
    2. Через 5 минут добавьте 3 мл 1x PBS, чтобы остановить реакцию диссоциации, и промойте клетки один раз 3 мл PBS.
    3. Центрифугируйте клетки при 300 × г в течение 5 минут. После промывки ресуспендируйте одноклеточные iPSCs в среде mTeSR Plus, затем наложите пластину с предварительно нанесенным покрытием BMM на 6-луночную пластину.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Общий требуемый объем среды составляет 3 мл на лунку в 6-луночном планшете. Среду необходимо менять каждые 2-3 дня, и шаг 1.8 необходимо повторять, когда клетки сливаются на 70-80% в течение как минимум 1-2 пассажей перед конструированием iPSCs.
  9. Регулярно проверяйте плюрипотентность ИПСК Окрашивают иПСК конъюгированными аллофрикоцианином (APC) антителами к стадийно-специфическому эмбриональному антигену-4 (SSEA-4) к TRA-1-81 и PE-Cy7 в течение 30 мин на льду, затем анализируют их с помощью проточной цитометрии, как описано ранее23,41.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ИПСК используемые в этом эксперименте адаптированы к TrypLE. Для иПСК, которые ранее не были пассажированы с помощью TrypLE, обычно требуется 8-10 пассажей для полной адаптации к TrypLE, что обеспечивает производство высококачественных спиновых эмбриоидных тел (БЭ).

2. Инженерия человеческих iPSCs для экспрессии анти-GPC3 CAR с использованием вектора piggyBac

  1. Покройте новый 6-луночный планшет BMM и инкубируйте при 37 °C не менее 1 ч (это может быть дольше, если жидкость не высохнет).
  2. Предварительно подогрейте mTeSR Plus с 10 мкМ Rho-ассоциированной спиральной спиралью, содержащей ингибитор протеинкиназы (ROCK) (Y-27632) (из 1 мМ бульона, приготовленного в стерильной дистиллированной воде) при 37 °C.
  3. Включите систему Nucleofection. Выберите единицу X, затем выберите расположение скважин, которые необходимо трансфицировать. Выберите решение P3 и вручную введите код (CA-137).
  4. Соберите иПСК при 70-80% конфлюксентности с 1 мл TrypLE и инкубируйте при 37 °C в течение 5 минут. Проверьте под микроскопом для подтверждения диссоциации.
  5. Пипеткой 4-6 раз до получения одноклеточной суспензии, затем нейтрализовать 5 мл PBS и гранулировать по 300 × г в течение 5 мин.
  6. Аккуратно промойте клетки еще раз, чтобы удалить все следы TrypLE.
  7. Ресуспендируйте в 1 мл mTeSR Plus с ингибитором горных пород и подсчитайте количество клеток.
  8. Для создания анти-GPC3 CAR iPSC используют 1 × 10-6 клеток на трансфекцию в микроцентрифужной пробирке и снижают до 300 × г в течение 5 минут.
  9. Во время вращения объедините CAR-экспрессирующую транспозонную ДНК с вектором экспрессии транспозазы super PiggyBac в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл в соотношении 3:1 (например, 3 мкг плазмиды, содержащей транспозон, на 1 мкг транспозазы).
  10. Включите положительный контроль зеленого флуоресцентного белка (GFP) (Таблица материалов) с использованием 0,5 мкл раствора 1 мг/мл и нетрансфицированный отрицательный контроль для подтверждения экспрессии GFP.
  11. Осторожно суспендируйте клеточную гранулу в 20 мкл раствора нуклеофектора P3 комнатной температуры (RT) с добавкой, входящей в комплект для нуклеофекции. Затем добавьте эту смесь в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, содержащую плазмидную ДНК, в результате чего конечный объем составит примерно 22-25 мкл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ресуспендируйте все ИПСК для трансфекции в растворе нуклеофлектора P3 перед добавлением плазмид GPC3 CAR или контрольной плазмиды GFP в клетки.
  12. Перенесите суспензию клетки/ДНК в 16-луночные полоски объемом 20 μл. Убедитесь, что образец покрывает дно кюветы без пузырьков.
  13. Аккуратно постучите по 16-луночным полоскам на столешнице, чтобы удалить пузырьки воздуха и осесть ячейки на дне.
  14. Поместите 16-луночные полоски, содержащие iPSCs и смесь CAR DNA, в систему Nucleofection, выберите программу CA-137, раствор P3, а затем запустите программу. Эта программа завершится через 1 с и покажет зеленую галочку.
  15. Добавьте в лунку 80 мкл предварительно подогретого mTeSR Plus со средой ROCK-Inhibitor и осторожно перенесите ячейки на 6-луночный планшет, покрытый BMM (итоговый объем 1 мл на лунку).
  16. Кратко проверьте клетки под флуоресцентным микроскопом через 4 ч на наличие экспрессии GFP, чтобы подтвердить успешность трансфекции.
  17. Скрининг ИПСК на экспрессию GFP для оценки эффективности трансфекции через 24 ч после трансфекции с использованием проточной цитометрии 23,41 для подтверждения экспрессии GFP.
  18. Инкубировать в течение 4 дней при 37 °C, меняя среду по мере необходимости, прежде чем приступить к выбору препарата.
    Примечание: Для каждой нуклеофекции требуется 0,2-2 x 106 иПСК на одну реакцию. В зависимости от количества реакций могут использоваться 24-луночные планшеты или 6-луночные планшеты.

3. Клональный отбор и подтверждение плюрипотентности иПСК GPC3-CAR

  1. Выполните серию отборов цеоцина (1:10 000) на трансфицированных ИПСК для клонального отбора GPC3-CAR, экспрессирующих ИПСК.
  2. Для подтверждения эффективности трансфекции измеряют экспрессию GFP с помощью флуоресцентного микроскопа и проточной цитометрии23,41.
    Примечание: Конструкция CAR инкорпорирована с меткойFLAG 44,45 с целью оценки экспрессии CAR как на стадии iPSC, так и после дифференцировки NK-клеток.
  3. Поддерживайте трансфицированные CAR-iPSCs при подборе лекарственного препарата до тех пор, пока они не достигнут оптимальной экспрессии гена CAR и GFP.
  4. Для обеспечения однородной экспрессии GFP и CAR следует продлить продолжительность подбора препарата на 2-3 недели.
  5. Выполнить сортировку клеток на основе экспрессии GFP или CAR с помощью проточной цитометрии для получения однородной популяции клонально отобранных iPSCs23.
  6. Используемая здесь конструкция CAR содержит маркер выбора препарата цеоцином. Выберите трансфицированные клетки гена GPC3 CAR путем добавления цеоцина (50 мкг/мл цеокина) в культуральную среду.
  7. После отбора цеоцина разбавьте ИПСК, трансфицированные геном GPC3 CAR, и поместите их в 96-луночный планшет, чтобы получить примерно одну клетку на лунку. Это можно сделать с помощью серийного разведения или с помощью сортировщика клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте флуоресцентно-активируемую сортировку клеток (FACS) для выделения одиночных трансфицированных клеток на основе экспрессии флуоресцентного маркера, связанного с конструкцией CAR.
  8. Позвольте отдельным клеткам расширяться в колонии в 96-луночном планшете.
  9. Подкармливайте клетки свежей питательной средой каждые 3-4 дня один раз и следите за ростом колоний в лунках.
  10. Отсейте колонии на экспрессию CAR. Это может быть сделано с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР) или вестерн-блоттинга для проверки наличия конструкции CAR23,47.
  11. В качестве альтернативы можно использовать проточную цитометрию23,41 для определения поверхностной экспрессии белка CAR.
    Примечание: В данном исследовании экспрессия CAR количественно определялась с помощью экспрессии метки FLAG с использованием проточной цитометрии.
  12. Кроме того, проведите кариотипирование, чтобы выявить любые хромосомные аномалии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть сделано сторонними организациями, такими как Wicell (wicell.org) или Thermo Fisher Scientific (thermofisher.com).
  13. После того, как CAR-положительные клоны будут идентифицированы без каких-либо аномалий, разложите эти клоны в более крупных культуральных сосудах, таких как 6-луночный планшет и колба T75.
  14. Криоконсервируйте клонально расширенные CAR iPSC с использованием криоконсервирующей среды в нескольких флаконах для будущего использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе рекомендуется соблюдать следующие моменты: (i) Поддерживайте оптимальные условия культивирования ИПСК для предотвращения дифференцировки. (ii) Дайте 1-4 недели для достижения однородной популяции экспрессии CAR и GFP в iPSCs после выбора препарата. (iii) Продолжайте мониторинг клеток на предмет стабильности экспрессии CAR и маркеров плюрипотентности. (iv) Использовать соответствующие средства контроля на этапах скрининга и верификации. (v) После клонального отбора и экспансии проверить плюрипотентность путем оценки экспрессии TRA-1-81 и SSEA-4 на CAR-экспрессирующих иПСК.

4. Генерация гемопоэтических клеток-предшественников из сконструированных CAR iPSCs путем формирования спиновых эмбриоидных тел (БЭ)

ПРИМЕЧАНИЕ: Спиновой EB или протокол гемопоэтических органоидов используется для получения гемопоэтических предшественников23,34. Клетки внутри БЭ дифференцируются в стромальные клетки для поддержки развития лимфоцитов38, тем самым устраняя необходимость в ксенопроизводных стромальных клетках, таких как OP9 23,34,48. Ниже приведена инструкция по сбору клеток из одной лунки 6-луночного планшета для формирования БЭ.

  1. Прохождение ~200 000 ячеек/лунка 6-луночной пластины с предварительно нанесенным покрытием BMM за 2 дня до образования спинового EB. Убедитесь, что он достигает 70-80% слияния в день установки спиновых EB. Как правило, 1 лунки из 6-луночного планшета достаточно для двух планшетов со спиновым EB.
  2. Удалите питательную среду и отделите клетки путем инкубации с 1 мл предварительно подогретого TrypLE Select при 37 °C в течение 5 минут.
  3. Осторожно диссоциируйте клеточные агрегаты в одноклеточную суспензию с помощью микропипетки объемом 1 мл и перенесите клетки в коническую пробирку объемом 15 мл. Добавьте 3 мл 1x PBS, чтобы остановить реакцию диссоциации, и промойте клетки один раз 3 мл PBS.
  4. Восстановите суспендию элементов в среде mTesR Plus и отфильтруйте через сетчатое фильтр 70 мкМ для удаления агрегатов.
  5. Уменьшите количество клеток, чтобы удалить надосадочную жидкость, и еще раз промойте ячейки 5 мл PBS. Затем ресуспендируйте клетки в 1 мл среды STEMdiff APEL (среда для образования EB).
  6. Подсчитайте и разбавьте клетки до соответствующей плотности, используя среду для образования EB, содержащую следующие цитокины (SCF: 40 нг/мл, BMP4: 20 нг/мл, VEGF: 20 нг/мл) плюс 10 μM ингибитор ROCK.
  7. Затравите 3000-10000 клеток/лунку в 100 мкл среды (100 000 клеток/мл) в 96-луночных планшетах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество клеток, используемых при образовании БЭ, может варьироваться в зависимости от линии iPSC. Рекомендуется испытывать от 3 000 до 10 000 ячеек на лунку в 96-луночных планшетах.
  8. С помощью многоканальной пипетки загрузите суспензию ячейки в 96-луночные планшеты со скоростью 100 мкл/лунка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для лучшего формирования эмбриоидных телец (БЭ) рекомендуется использовать 96-луночные планшеты с круглым дном со сверхнизким уровнем прикрепления.
  9. Центрифугируйте 96-луночный планшет при 300 × г в течение 5 минут, затем инкубируйте планшеты при 37 °C с 5%CO2 в течение 6 дней.
    Примечание: Предварительные исследования показали, что 6 дней достаточно, чтобы получить >30% CD34+ клеток для линий CAR iPSC в этом исследовании.
  10. Проверить качество КЭБ методом проточной цитометрии23,41.
    1. Приготовьте 4 мл предварительно подогретого 0,25% трипсина с 0,4% куриной сывороткой (16 мкл на 4 мл трипсина) для диссоциации БЭ.
    2. Перенесите 10-30 EBs в коническую пробирку объемом 15 мл.
    3. Добавьте раствор трипсина/куриной сыворотки к БЭ и инкубируйте на водяной бане в течение 10 минут, делая вортекс каждые 30 секунд для обеспечения полной диссоциации БЭ.
    4. Пипетка трипсинизированных БЭ. Перемешайте вверх и вниз несколько раз, чтобы полностью диссоциировать EBS.
    5. Добавьте 5 мл 1x PBS, чтобы остановить процесс трипсинизации.
    6. Отфильтруйте раствор ячейки через сетчатый фильтр 70 μм в новой конической трубке.
    7. Центрифугируйте клетки при 300 x g в течение 5 минут.
    8. Отсадите надосадочную жидкость и ресуспендируйте в 3-5 мл свежей среды.
    9. Подсчитайте клетки, окрасьте их типичными маркерами EB, такими как CD34, CD31, CD43 и CD45, и проанализируйте с помощью проточной цитометрии23,41 (рис. 3).
    10. Добавить рекомендуемый объем антител в соответствии с инструкцией производителя в каждую пробирку, содержащую диссоциированные одиночные клетки БЭ в 100 мкл проточного буфера и инкубировать на льду в течение 30 мин39,41.
    11. После инкубации дважды промойте клетки проточным буфером, добавьте синий краситель SYTOX для живых/мертвых и проанализируйте с помощью проточной цитометрии.
      Примечание: Как правило, >30% CD34+ клеток получают из общей популяции диссоциированных Spin эмбриоидных тел на 6-й день с использованием iPSCs, использованных в этом исследовании, хотя этот процент может варьироваться в зависимости от источника iPSC и условий культивирования.

5. Дифференцировка NK-клеток, полученных из GPC3 CAR iPSC, из Spin EB

ПРИМЕЧАНИЕ: GPC3 CAR-экспрессирующие Spin EB могут быть перенесены либо в 24-луночные планшеты, либо в 6-луночные планшеты, покрытые 2% желатином или без покрытия. Для средних изменений больше подходят 6-луночные планшеты, в то время как 2% желатиновое покрытие усиливает прикрепление БЭ.

  1. Приготовьте покрытые желатином 6-луночные пластины, выполнив следующие действия.
    1. Приготовьте 2% (по массе) раствор желатина, растворив желатин в воде, пригодной для тканевой культуры.
    2. Стерилизуйте раствор путем автоклавирования при 121 °C, 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 30 минут.
    3. Поверхность каждой лунки покрыть 5-10 мкл раствора желатина насм2 (~1 мл на лунку 6-луночного планшета).
    4. Перед использованием планшеты выдерживают при температуре 37 °C в течение 2-4 часов. После инкубации аспирируйте оставшийся раствор желатина, прежде чем приступать к переносу БЭ.
  2. Приготовьте среду для дифференцировки NK-клеток: добавьте 56,6% DMEM+ GlutaMAX-I, 28,3% F12+ GlutaMAX-I, 15% термоинактивированную человеческую AB-сыворотку, 1% P/S, 2 мМ L-глутамина, 1 μM β-меркаптоэтанол, 5 нг/мл селенита натрия, 50 μМ этаноламина, и 20 мг/л аскорбиновой кислоты. Хранить при температуре 4 °C в темноте.
  3. Добавьте 3 мл среды для дифференцировки NK, содержащей следующие цитокины, в каждую лунку 6-луночных планшетов, покрытых желатином (IL-3: 5 нг/мл, SCF: 20 нг/мл, IL-7: 20 нг/мл и IL-15: 10 нг/мл).
  4. На 6-й день перенесите Spin EBs непосредственно в подготовленные 6-луночные планшеты, покрытые желатином, содержащие среду для дифференцировки NK, выполнив следующие действия.
    1. Осторожно перенесите БЭ с 96-луночных планшетов в чашку диаметром 10 см, используя серологическую пипетку объемом 10 мл для удаления большей части среды.
    2. Добавьте 3 мл среды для дифференцировки NK, содержащей вышеуказанные цитокины, в каждую лунку 6-луночного планшета, покрытого желатином.
    3. Распределите 16-20 EB в каждую лунку 6-луночного планшета с помощью микропипетки объемом 1 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В среднем, EB из одного 96-луночного планшета могут быть использованы для засеивания одного 6-луночного планшета для дифференцировочного планшета NK.
  5. Проводите смены сред каждые 5-7 дней. После первой недели дифференцировки NK-клеток исключите IL-3 из среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Через 14 дней среду нужно менять каждые 3-4 дня.
  6. Продолжайте средние изменения в течение 3-4 недель. Оцените экспрессию маркеров NK-клеток (CD45+CD56+) с помощью проточной цитометрии24,42 на суспензионных клетках.
  7. Когда >80% суспензионных клеток экспрессируют CD45+CD56+, соберите клетки, пропустив их через фильтр 70 мкм, чтобы удалить любые комки.
  8. Совместное культивирование NK-клеток собирали со 100 серыми облученными aAPC 34,48 и культурой в расширяющей среде NK, содержащей IL-2 (100 нг/мл) и IL-15 (10 нг/мл).

6. Экспансия NK-клеток, полученных из анти-GPC3 CAR iPSC

ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, выход 2-20 × 106 NK-элементов может быть получен из одного 6-луночного планшета, даже до расширения. Для облегчения дальнейшей экспансии NK-клеток для последующего применения используются искусственные антигенпрезентирующие клетки (aAPC) для получения >1 ×10-9 NK-клеток.

  1. Используйте сконструированные клетки K562, экспрессирующие 41BBL и мембраносвязанный IL-21 (41BBL-mbIL-21)48, в качестве aAPC для индуцирования экспансии NK-клеток.
  2. Перед совместным культивированием aAPC с NK-клетками облучите aAPC 100 серым цветом и сохраните их в замороженном виде.
  3. Соберите суспензионные клетки из 6-луночного планшета и культивируйте NK-клетки в расширяющей среде NK с добавлением 50 Ед/мл ИЛ-2 и ИЛ-15 (10 нг/мл; добавляются в свежем виде) с плотностью 5 × 105 клеток/мл.
  4. Добавляйте размороженные облученные aAPC к NK-элементам в соотношении 1:1.
  5. Пополняют питательную среду каждые 3-4 дня, добавляя свежие ИЛ-2 и ИЛ-15 в концентрации 50 ЕД/мл и 10 нг/мл соответственно.
  6. Убедитесь, что NK-клетки, полученные из CAR iPSC, сохраняют способность к экспансии в течение >3 месяцев, поддерживая как жизнеспособность клеток, так и цитолитическую активность.

7. Фенотипическая и функциональная характеристика NK-клеток, полученных из GPC3 CAR iPSC

Примечание: Характеристика NK-клеток, полученных из GPC3 CAR iPSC, включает в себя всестороннюю оценку их фенотипического профиля и функциональной активности.

  1. Оцените экспрессию рецепторов активации NK, включая CD45, CD56, CD94, CD16, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2D, DNAM, TRAIL и FasL, на NK-клетках, полученных из анти-GPC3 CAR iPSC, с помощью проточной цитометрии24,42 для определения активности и статуса созревания NK-клеток CAR (рис. 4).
  2. Оцените in vitro функциональную активность NK-клеток, полученных из GPC3 CAR iPSC, с использованием анализов каспазы-3/7 на основе проточной цитометрии, анализа высвобождения гранул CD107a, анализов высвобождения цитокинов ИФН-γ и TNF-α против различных опухолевых мишеней.
  3. Для анализа на Caspase3/7 выполните следующие действия.
    1. Подсчитайте клетки-мишени и предварительно окрашивайте их флуоресцентным красителем для отслеживания клеток в конечной концентрации 5 мкМ в PBS в течение 15 мин при 37 °C.
    2. Окрашенные клетки-мишени промывают в полной питательной среде перед совместным культивированием с NK-клетками, полученными из CAR iPSC, в различных соотношениях эффекторов к мишеням (E:T) при 37 °C.
    3. После 3 ч 30 мин совместного культивирования добавьте зеленый реагент Caspase-3/7 для детектирования еще на 30 мин инкубации, в результате чего общее время инкубации составит 4 ч.
    4. Добавьте 1 μл раствора для окрашивания мертвых клеток в течение последних 5 минут окрашивания и аккуратно перемешайте.
    5. Анализируйте окрашенные клетки с помощью проточной цитометрии 23,41 (рис. 5).
  4. Реализуйте этот протокол для обеспечения всестороннего понимания фенотипических характеристик и функциональной активности NK-клеток, полученных из GPC3 CAR iPSC, что позволит надежно оценить их терапевтический потенциал.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно требуется 4-5 недель для получения >90% CD45+CD56+ клеток из дифференцировки NK-клеток, полученных из GPC3 CAR iPSC, и условий расширения NK на основе спинового EB с использованием линий GPC3 CAR iPSC. Для некоторых клеточных линий iPSC может потребоваться всего 3 недели, а для некоторых линий может потребоваться больше времени (около 4-5 недель).

8. Устранение неполадок и решения

ПРИМЕЧАНИЕ: Устранение неполадок при дифференцировке, экспансии и функциональном тестировании клеток GPC3 CAR NK, полученных из iPSC, с использованием метода спиновых эмбриоидных тел (EB) может включать в себя несколько этапов. Ниже приведены некоторые распространенные проблемы, с которыми можно столкнуться, а также предлагаемые решения:

  1. Симптомы непоследовательного формирования БЭ
    1. Проверьте, не слишком ли малы или не слишком велики, с неправильной формой.
  2. Решение для неравномерного образования БЭ
    1. Отрегулируйте скорость и продолжительность центрифуги, используемую для формирования EB. Скорость около 200-300 × g в течение 5-10 мин является обычной.
    2. Убедитесь, что для облегчения образования БЭ используются соответствующие U-образные пластины или чашки для культивирования со сверхнизким уровнем адгезии.
    3. Подтвердите, что ИПСК однородны и не содержат дифференцированных клеток, которые могут влиять на образование БЭ.
  3. Симптомы плохой дифференцировки ИПСК в NK-клетки
    1. Проверьте наличие низкой экспрессии маркеров NK-клеток (например, CD56, NKp46).
    2. Проверьте наличие несформированных или плохо сформированных ЭБ.
  4. Решение проблемы плохой дифференцировки иПСК в NK-клетки
    1. Убедитесь, что концентрации основных факторов роста (например, VEGF, BMP4, Y-27632, FLT3, IL-15, IL-7, SCF и IL-3) являются оптимальными для образования БЭ и дифференцировки NK-клеток. Скорректировать концентрации на основе предыдущих исследований 23,34,41.
    2. Убедитесь, что начальная плотность посева ИПСК соответствующая. Как правило, для формирования спиновых EB рекомендуется плотность 8000-10 000 клеток/100 μл.
    3. Убедитесь, что среда для дифференцировки составлена правильно, включая необходимые добавки (например, сыворотку или альтернативы без сыворотки, другие цитокины).
    4. Дайте достаточно времени для образования БЭ, минимум от 6 дней до 12 дней до переключения на среду для дифференцировки NK-клеток.
  5. Симптомы слабого размножения NK-клеток
    1. Проверьте ограниченную производительность ячеек во время расширения.
    2. Проверьте на пониженную жизнеспособность расширенных NK-клеток.
  6. Решения для слабого расширения NK-клеток
    1. Увеличивают концентрацию ИЛ-15 и ИЛ-2 во время фазы расширения. Это может значительно усилить пролиферацию NK-клеток.
    2. Рассмотрите возможность использования фидерных клеток, таких как облученные aAPC, для повышения выживаемости и расширения NK-клеток.
    3. Регулярно контролируйте плотность клеток и пропускайте клетки до того, как они достигнут переполненности, чтобы поддерживать оптимальные условия роста.
  7. Симптомы неоптимальных результатов функционального тестирования
    1. Проверьте снижение цитотоксичности в отношении клеток-мишеней.
    2. Проверьте низкий уровень секреции цитокинов (например, ИФН-γ, ФНО-α).
  8. Решения для неоптимальных результатов функционального тестирования
    1. Оптимизируйте соотношение мишеней и эффекторов в анализах цитотоксичности. Начните с соотношения 10:1 и корректируйте в зависимости от результатов.
    2. Убедитесь, что NK-клетки адекватно активированы перед функциональным анализом. Это может включать предварительную стимуляцию цитокинами или совместное культивирование с облученными аАПК.
    3. Проверьте чувствительность целевой клеточной линии к лизису, опосредованному NK-клетками. Используйте известные чувствительные цели в качестве элементов управления.
    4. Увеличьте продолжительность функциональных анализов, чтобы дать достаточно времени для проявления активности NK-клеток.
  9. Симптомы вариабельных уровней экспрессии CAR
    1. Проверьте наличие несогласованной экспрессии CAR среди NK-клеток.
  10. Решения для переменных уровней экспрессии CAR
    1. Проверьте эффективность метода CAR-трансфекции (например, вирусная трансдукция, электропорация). При необходимости отрегулируйте MOI (множественность инфекций) или условия электропорации.
    2. Реализуйте соответствующие маркеры выбора для обогащения CAR+ NK-клеток. При необходимости используйте подбор антибиотиков или сортировку флуоресцентными маркерами.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Принципиальная схема дифференцировки и экспансии NK-клеток, полученных из анти-GPC3-CAR iPSC
Принципиальная диаграмма иллюстрирует in vitro дифференцировку анти-GPC3-CAR NK-клеток, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (iPSCs), и схематическое изображение вектора piggyBac, несущего конструкцию GPC3 CAR. Первоначально немодифицированные иПСК трансфицируются вектором piggyBac, кодирующим GPC3 CAR (химерный антигенный рецептор). После трансфекции эти GPC3 CAR-эксп...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе изложен стандартизированный и воспроизводимый подход к созданию экспрессирующих CAR, полученных из iPSC NK-клеток из последовательного клеточного источника, направленный на облегчение таргетной «готовой» иммунотерапии рака. Многочисленные доклинические и клинические исследования показали эффективность адоптивной иммунотерапии на основе NK-клеток в лечении онкологических заболеваний при минимизации токсичности, таких как заболевания «трансплантат против хозяина» (GvHD) ил...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DSK является соучредителем и советником Shoreline Biosciences и имеет долю в акционерном капитале компании. DSK также консультирует Therabest и RedC Bio, за что получает доход и/или акции. Условия этих договоренностей были рассмотрены и одобрены Калифорнийским университетом в Сан-Диего в соответствии с его политикой в отношении конфликта интересов. Остальные авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим всех сотрудников лаборатории Кауфмана за их поддержку, научные идеи и дискуссии. Эти исследования были поддержаны грантами NIH/NCI U01CA217885, P30CA023100 (административное приложение) и Институтом стволовых клеток Сэнфорда при Калифорнийском университете в Сан-Диего. JT: написание и доработка рукописи. ДСК: рецензировал и редактировал рукопись.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
aAPC Лаборатория Дина А. Ли Н/Д
культуральная среда a-MEM Fisher Scientific Cat#12634
APC анти-DYKDDDDK (ФЛАГ Бирка)BD Biosciences Cat#637308
APC-anti-human TRA-1-81 ТермоФишер17-8883-42 
APC-CD16BD Biosciences Cat#302015
APC-CD43 BD BiosciencesCat# 560198 
APC-CD45 BD BiosciencesCat# 555485 
APC-GPC3BD Biosciences Cat#DB100B
APC-NKG2D BD Biosciences Cat# 558071 
Реагент для обнаружения зеленого цвета CellEvent Caspase-3/7 Термофишер Cat#C10423
Набор для пролиферации фиолетовых клеток CellTrace Термофишер Cat#C34571Флуоресцентный краситель для слежения за клетками 
Решение CryoStorТехнологии стволовых клетокhttps://www.stemcell.com/products/cryostor-cs10.htmlсреда для криоконсервации
CTS NK XpanderGibcoA5019001
CTS NK-Xpander MediumLife TechnologiesCat#A5019001
DMEMGibco11965084
DMEM, высокий уровень глюкозы, добавка GlutaMAX, пируватGibco10569010
EasySep Набор для обогащения NK-клеток человека StemCell Technologies, Inc. Cat#19055
ЭтаноламинSigma AldrichE9508
Фетальная бычья сыворотка Fisher Scientific Cat# 10437010
FITC-CD94 BD Biosciences Cat#555888
Добавка GlutaMAXGibco35050061
GolgiPlug BD Biosciences Cat#555029
GolgiStop BD Biosciences Cat#554724
Ham's F-12 Питательная смесь, добавка GlutaMAXGibco31765035
лошадиная сыворотка Fisher Scientific Cat#16050130
Сыворотка для человека AB Sigma-AldrichCat#BP2525100
Набор стволовых клеток человека NucleofectorTM Лонза Cat# VPH-5012
Человек: клетки HePG2 ATCC Кошка#HB-8065
Человек: клетки HePG2-td-tomato-luc Дэн С. Кауфман ЛабораторияН/Д
Человек: iPS-клетки Лаборатория Дэна С. Кауфмана Н/Д
Человек: клетки SNU-449 ATCCCat#CRL-2234
Человек: SNU-449-td-tomato-luc клетки Дэн С. Кауфман лабораторияN/A
IncuCyte Casspase-3/7 Анализ зеленого апоптоза Эссенбионаука Cat#4440
L-аскорбиновая кислотаSigma AldrichA5960
MP Biomedicals  Сыворотка человека, тип ABMP BiomedicalsICN2938249
mTeSR плюсStemCell Technologies, Inc. 100-0276
Программное обеспечение NovoExpress ACEA Biosciences 
PE/Cy7 антитело к человеческому SSEA-4 Biolegend330420
PE-CD16 BD Biosciences Кат#560995 
PE-CD226BD Бионаука Cat#559789
PE-CD34 BD BiosciencesCat# 555822 
PE-CD45 BD Biosciences Cat# 555483 
ПЭ-CD94 BD Biosciences Кат#555888 
PE-cy7-CD56 BioLegendCat# 318318 
ЧП-ФАС Лиганд BD Biosciences Кат#564261 
PE-NKp30BD BiosciencesCat# 558407
PE-NKp44 BD Biosciences Кот#558563 
PE-NKp46BD Biosciences Cat#331908
PE-NKp46 BD Biosciences Кат#557991 
Периферическая кровь охристая шерсть Банк крови Сан-Диего (https://www. sandiegobloodbank.org/) Н/Д
PE-TRAIL BD Biosciences Кат#565499 
pKT2-mCAG-IRES-GFP-ZEO Лаборатория Брэндена Мориарити Н/Д
pMAX-GFP плазмидаLonzaН/ДGFP положительный контроль 
Prism 9Graphpad Версия 9
pSpCas9 GenScriptPX165
RBC Lysis Buffer (10x)BiolegendCat#420301
Рекомбинантный человеческий bFGF basic НИР D Systems Cat#4114-TC
Рекомбинантный человек BMP-4 PeproTechCat#120-05
Рекомбинантный человеческий FLT-3 Лиганд PeproTechCat# 300-19
Рекомбинантный человеческий IL-15 PeproTechCat# 200-15
Рекомбинантный человеческий IL-2 PeproTechCat# 200-02
Рекомбинантный человеческий IL-3 PeproTechCat#200-03
Рекомбинантный человеческий IL-7 PeproTechCat# 200-07
Рекомбинантный человеческий узловой белокR& D Systems Cat#3218-ND-025
Рекомбинантный человеческий SCF PeproTechCat# 300-07
Рекомбинантный человеческий TGF-β 1PeproTechCat#100-21
Рекомбинантный человек VEGF PeproTechCat# 100-20
RPMI1640Gibco11875093
селенит натрияSigma Aldrich214485
STEMdiff APEL 2 MediumStemCell Technologies, Inc. 5270EB пластовая среда
STEMdiff APEL2 Среда StemCell Technologies, Inc. Cat#05270
Super piggyBac Transposase expression vectorSBICat#PB210PA-1
SYTOX AADvanced Набор для окрашивания мертвых клетокThermoFisher ScientificS10274, S10349Набор для окрашивания мертвых клеток
&бета;-меркаптоэтанолGibco21985023
https://www.agilent.com/en/product/research-flow-cytometry/flow-cytometry-software/novocyte-novoexpress-software-1320805

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chan, I. S., Ewald, A. J. The changing role of natural killer cells in cancer metastasis. J Clin Invest. 132 (6), e143762(2022).
  2. Yu, Y. The function of NK cells in tumor metastasis and NK cell-based immunotherapy. Cancers (Basel). 15 (8), 2323(2023).
  3. Paul, S., Lal, G. The molecular mechanism of natural killer cells function and its importance in cancer immunotherapy. Front Immunol. 8, 1124(2017).
  4. Myers, J. A., Miller, J. S. Exploring the NK cell platform for cancer immunotherapy. Nat Rev Clin Oncol. 18 (2), 85-100 (2021).
  5. Llovet, J. M., et al. Hepatocellular carcinoma. Nat Rev Dis Primers. 7, 6(2021).
  6. Yang, Y., Xiong, L., Li, M., Jiang, P., Wang, J., Li, C. Advances in radiotherapy and immunity in hepatocellular carcinoma. J Transl Med. 21 (1), 526(2023).
  7. Rich, N. E., Yopp, A. C., Singal, A. G. Medical management of hepatocellular carcinoma. J Oncol Pract. 13 (6), 356-364 (2017).
  8. Niu, M., Yi, M., Li, N., Wu, K., Wu, K. Advances of Targeted Therapy for Hepatocellular Carcinoma. Front Oncol. 11, 719896(2021).
  9. Yu, S. J. Immunotherapy for hepatocellular carcinoma: Recent advances and future targets. Pharmacol Ther. 244, 108387(2023).
  10. Ntellas, P., Chau, I. Updates on systemic therapy for hepatocellular carcinoma. Am Soc Clin Oncol Educ Book. 44, e430028. 44, e430028(2024).
  11. Liu, T. -H., Shen, Y. -C., Cheng, A. -L. Immune checkpoint inhibitors for hepatocellular carcinoma - A game changer in treatment landscape. J Formos Med Assoc. 121 (8), 1371-1383 (2022).
  12. Sun, Q., Hong, Z., Zhang, C., Wang, L., Han, Z., Ma, D. Immune checkpoint therapy for solid tumours: clinical dilemmas and future trends. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 320(2023).
  13. Huang, A., Yang, X. -R., Chung, W. -Y., Dennison, A. R., Zhou, J. Targeted therapy for hepatocellular carcinoma. Signal Transduct Target Ther. 5 (1), 146(2020).
  14. Girardi, D. M., Pacífico, J. P. M., Guedes de Amorim, F. P. L., Dos Santos Fernandes, G., Teixeira, M. C., Pereira, A. A. L. Immunotherapy and targeted therapy for hepatocellular carcinoma: A literature review and treatment perspectives. Pharmaceuticals (Basel). 14 (1), 28(2020).
  15. Laface, C., et al. Targeted therapy for hepatocellular carcinoma: Old and new opportunities. Cancers (Basel). 14 (16), 4028(2022).
  16. Shyam Sunder, S., Sharma, U. C., Pokharel, S. Adverse effects of tyrosine kinase inhibitors in cancer therapy: pathophysiology, mechanisms and clinical management. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 262(2023).
  17. Cappell, K. M., Kochenderfer, J. N. Long-term outcomes following CAR T cell therapy: what we know so far. Nat Rev Clin Oncol. 20 (6), 359-371 (2023).
  18. June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).
  19. Schuster Stephen, J., et al. Chimeric antigen receptor T cells in refractory B-cell lymphomas. N Engl J Med. 377 (26), 2545-2554 (2017).
  20. Schmidt, D., et al. Engineering CAR-NK cells: how to tune innate killer cells for cancer immunotherapy. Immunother Adv. 2 (1), Itac003(2022).
  21. Zhang, B., et al. Chimeric antigen receptor-based natural killer cell immunotherapy in cancer: from bench to bedside. Cell Death Dis. 15 (1), 50(2024).
  22. Wang, K., et al. Reprogramming natural killer cells for cancer therapy. Mol Ther. 32 (9), 2835-2855 (2024).
  23. Li, Y., Hermanson, D. L., Moriarity, B. S., Kaufman, D. S. Human iPSC-derived natural killer cells engineered with chimeric antigen receptors enhance antitumor activity. Cell Stem Cell. 23 (2), 181-192.e5 (2018).
  24. Liu, E., Marin, D., et al. Use of CAR-transduced natural killer cells in CD19-positive lymphoid tumors. N Engl J Med. 382 (6), 545-553 (2020).
  25. Chen, L., Xie, T., Wei, B., Di, D. L. Current progress in CAR-T cell therapy for tumor treatment. Oncol Lett. 24 (4), 358(2022).
  26. Rafiq, S., Hackett, C. S., Brentjens, R. J. Engineering strategies to overcome the current roadblocks in CAR T cell therapy. Nat Rev Clin Oncol. 17 (3), 147-167 (2020).
  27. Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69(2021).
  28. Albinger, N., Hartmann, J., Ullrich, E. Current status and perspective of CAR-T and CAR-NK cell therapy trials in Germany. Gene Ther. 28 (9), 513-527 (2021).
  29. Dagher, O. K., Posey, A. D. Forks in the road for CAR T and CAR NK cell cancer therapies. Nat Immunol. 24 (12), 1994-2007 (2023).
  30. Xie, G., Dong, H., Liang, Y., Ham, J. D., Rizwan, R., Chen, J. CAR-NK cells: A promising cellular immunotherapy for cancer. EBioMedicine. 59, 102975(2020).
  31. Cichocki, F., van der Stegen, S. J. C., Miller, J. S. Engineered and banked iPSCs for advanced NK- and T-cell immunotherapies. Blood. 141 (8), 846-855 (2023).
  32. Goldenson, B. H., Hor, P., Kaufman, D. S. iPSC-derived natural killer cell therapies - Expansion and targeting. Front Immunol. 13, 841107(2022).
  33. Zhu, H., Kaufman, D. S. Engineered human pluripotent stem cell-derived natural killer cells: the next frontier for cancer immunotherapy. Blood Sci. 1 (1), 4-11 (2019).
  34. Knorr, D. A., et al. Clinical-scale derivation of natural killer cells from human pluripotent stem cells for cancer therapy. Stem Cells Transl Med. 2 (4), 274-283 (2013).
  35. Shimizu, Y., Suzuki, T., Yoshikawa, T., Endo, I., Nakatsura, T. Next-generation cancer immunotherapy targeting Glypican-3. Front Oncol. 9, 248(2019).
  36. Schepers, E. J., Glaser, K., Zwolshen, H. M., Hartman, S. J., Bondoc, A. J. Structural and functional impact of posttranslational modification of Glypican-3 on liver carcinogenesis. Cancer Res. 83 (12), 1933-1940 (2023).
  37. Batra, S. A., et al. Glypican-3-specific CAR T cells coexpressing IL15 and IL21 have superior expansion and antitumor activity against hepatocellular carcinoma. Cancer Immunol Res. 8 (3), 309-320 (2020).
  38. Gao, W., et al. Immunotoxin targeting glypican-3 regresses liver cancer via dual inhibition of Wnt signalling and protein synthesis. Nat Commun. 6, 6536(2015).
  39. Thangaraj, J. L., Coffey, M., Lopez, E., Kaufman, D. S. Disruption of TGF-β signaling pathway is required to mediate effective killing of hepatocellular carcinoma by human iPSC-derived NK cells. Cell Stem Cell. 31 (9), 1327-1343.e5 (2024).
  40. Maddineni, S., Silberstein, J. L., Sunwoo, J. B. Emerging NK cell therapies for cancer and the promise of next generation engineering of iPSC-derived NK cells. J Immunother Cancer. 10 (5), e004693(2022).
  41. Zhu, H., et al. Metabolic reprograming via deletion of CISH in human iPSC-derived NK cells promotes in vivo persistence and enhances antitumor activity. Cell Stem Cell. 27 (2), 224-237.e6 (2020).
  42. Strati, P., et al. Preliminary results of a phase I trial of FT516, an off-the-shelf natural killer (NK) cell therapy derived from a clonal master induced pluripotent stem cell (iPSC) line expressing high-affinity, non-cleavable CD16 (hnCD16), in patients (pts) with relapsed/refractory (R/R) B-cell lymphoma (BCL). J Clin Oncol. 39, 7541-7541 (2021).
  43. Hong, D., et al. Preliminary results of an ongoing phase I trial of FT500, a first-in-class, off-the-shelf, induced pluripotent stem cell (iPSC) derived natural killer (NK) cell therapy in advanced solid tumors. J Immunother Cancer. 8 (3), A231-A232 (2020).
  44. Zah, E., et al. Systematically optimized BCMA/CS1 bispecific CAR-T cells robustly control heterogeneous multiple myeloma. Nat Commun. 11 (1), 2283(2020).
  45. Ahn, S., et al. Cancer immunotherapy with T cells carrying bispecific receptors that mimic antibodies. Cancer Immunol Res. 7 (5), 773-783 (2019).
  46. Ludwik, K. A., Telugu, N., Schommer, S., Stachelscheid, H., Diecke, S. ASSURED-optimized CRISPR protocol for knockout/SNP knockin in hiPSCs. STAR Protoc. 4 (3), 102406(2023).
  47. Zhu, H., Kaufman, D. S. An improved method to produce clinical scale natural killer cells from human pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 2048, 107-119 (2019).
  48. Denman, C. J., et al. Membrane-bound IL-21 promotes sustained ex vivo proliferation of human natural killer cells. PLoS One. 7 (1), e30264(2012).
  49. Leivas, A., et al. NKG2D-CAR-transduced natural killer cells efficiently target multiple myeloma. Blood Cancer J. 11 (8), 146(2021).
  50. Ramdial, J. L., et al. A phase II clinical trial of "Off-the-Shelf" NK cells with allogeneic stem cell transplantation to decrease disease relapse in patients with high-risk myeloid malignancies. Blood. 140 (Supplement 1), 7484-7485 (2022).
  51. Bachanova, V., et al. Initial clinical activity of FT596, a first-in-class, multi-antigen targeted, off-the-shelf, iPSC-derived CD19 CAR NK cell therapy in relapsed/refractory B-cell lymphoma. Blood. 136, 8(2020).
  52. Bae, W. K., et al. A phase I study of locoregional high-dose autologous natural killer cell therapy with hepatic arterial infusion chemotherapy in patients with locally advanced hepatocellular carcinoma. Front Immunol. 13, 879452(2022).
  53. Marin, D., et al. Safety, efficacy and determinants of response of allogeneic CD19-specific CAR-NK cells in CD19+ B cell tumors: a phase 1/2 trial. Nat Med. 30 (3), 772-784 (2024).
  54. Fehniger, T. A., et al. A phase 1 trial of CNDO-109-activated natural killer cells in patients with high-risk acute myeloid leukemia. Biol Blood Marrow Transplant. 24 (8), 1581-1589 (2018).
  55. Nguyen, R., et al. A phase II clinical trial of adoptive transfer of haploidentical natural killer cells for consolidation therapy of pediatric acute myeloid leukemia. J Immunother Cancer. 7 (1), 81(2019).
  56. Miller, J. S., et al. Successful adoptive transfer and in vivo expansion of human haploidentical NK cells in patients with cancer. Blood. 105 (8), 3051-3057 (2005).
  57. Liu, E., et al. Use of CAR-transduced natural killer cells in CD19-positive lymphoid tumors. N Engl J Med. 382 (6), 545-553 (2020).
  58. Daher, M., Melo Garcia, L., Li, Y., Rezvani, K. CAR-NK cells: the next wave of cellular therapy for cancer. Clin Transl Immunology. 10 (4), e1274(2021).
  59. Lin, X., Sun, Y., Dong, X., Liu, Z., Sugimura, R., Xie, G. IPSC-derived CAR-NK cells for cancer immunotherapy. Biomed Pharmacother. 165, 115123(2023).
  60. Bachanova, V., et al. Safety and efficacy of FT596, a first-in-class, multi-antigen targeted, off-the-shelf, iPSC-derived CD19 CAR NK cell therapy in relapsed/refractory B-cell lymphoma. Blood. 138, 823(2021).
  61. Saetersmoen, M. L., Hammer, Q., Valamehr, B., Kaufman, D. S., Malmberg, K. J. Off-the-shelf cell therapy with induced pluripotent stem cell-derived natural killer cells. Semin Immunopathol. 41 (1), 59-68 (2019).
  62. Gerew, A., et al. Deletion of CISH and TGFβR2 in iPSC-derived NK cells promotes high cytotoxicity and enhances in vivo tumor killing. Blood. 138, 2780(2021).
  63. Goldenson, B. H., Hor, P., Kaufman, D. S. iPSC-derived natural killer cell therapies - Expansion and targeting. Front Immunol. 13, 841107(2022).
  64. Karvouni, M., Vidal-Manrique, M., Lundqvist, A., Alici, E. Engineered NK cells against cancer and their potential applications beyond. Front Immunol. 13, 825979(2022).
  65. Ayuso, J. M., et al. Microphysiological model reveals the promise of memory-like natural killer cell immunotherapy for HIV± cancer. Nat Commun. 14 (1), 6681(2023).
  66. Miller, J. S., et al. Safety and virologic impact of haploidentical NK cells plus interleukin 2 or N-803 in HIV infection. J Infect Dis. 229 (5), 1256-1265 (2024).
  67. Gutiérrez-Hoya, A., Soto-Cruz, I. NK cell regulation in cervical cancer and strategies for immunotherapy. Cells. 10 (11), 3104(2021).
  68. Lisco, A., et al. Treatment of relapsing HPV diseases by restored function of natural killer cells. N Engl J Med. 385 (10), 921-929 (2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CAR NKNK

Похожие статьи