Разработка системы протопластов капусты для изучения толерантности к гипоксии у капусты

Краткое содержание

Этот протокол описывает эффективную систему протопластов мезофилла капусты. Были протестированы различные методы лечения с недостатком кислорода, и система показала высокую активацию генов, реагирующих на гипоксию, что способствовало изучению генетических и молекулярных механизмов толерантности к затоплению у овощей сорта Brassicaceae .

Аннотация

Поскольку изменение климата приводит к увеличению количества обильных дождей, капуста, ключевой овощ семейства Brassicaceae , сталкивается со значительными потерями урожая из-за стресса, вызванного наводнениями. Для выявления механизмов толерантности к затоплению у кочанов необходима универсальная платформа для генетических функциональных исследований, позволяющих преодолеть трансформационно-неподатливый характер кочанов. В данном исследовании была разработана система экспрессии переходных процессов капустных протопластов и соответствующий протокол индукции гипоксии протопластов. Этот протокол позволил добиться высокой урожайности и целостности выделения протопластов из капустных листьев, при этом эффективность трансфекции превысила 40% при использовании оптимизированных ферментативных условий. Чтобы смягчить потенциальное гипоксическое воздействие перед лечением, раствор W5 пузырчат с газообразным кислородом для повышения уровня растворенного кислорода. Было протестировано несколько химических веществ для регулировки уровня кислорода и физиологического поглощения кислорода, включая EC-Oxyraze, OxyFluor, сульфит натрия и упаковку для поглощения кислорода. Анализ на двойную люциферазу показал, что промоторы генов анаэробной реакции дыхания BoADH1 и BoSUS1L активировались в протопластах капусты после лечения гипоксией, при этом самый высокий уровень индукции наблюдался после лечения пакетом поглотителей кислорода. Таким образом, система экспрессии протопластов капусты в сочетании с лечением гипоксии демонстрирует эффективную и удобную платформу. Эта платформа может облегчить изучение функции генов и молекулярных механизмов, связанных с реакцией на гипоксию у капусты.

Введение

Глобальное изменение климата усугубило проблему наводнений, которая становится все более критической проблемой во всем мире. В последние десятилетия наблюдается тенденция к увеличению частоты наводнений, что приводит к значительным потерям урожая ^1,2. Капуста (Brassica oleracea var. capitata L.), овощ значительного мирового значения, подвержена неблагоприятному воздействию обильных дождей, что обуславливает необходимость разработки устойчивых к наводнениям сортов капусты для обеспечения устойчивого производства в условиях экстремальных погодных явлений. Таким образом, понимание молекулярных механизмов, связанных со стрессом затопления в капусте, имеет важное значение для решения этой проблемы.

Чтобы понять механизмы регуляции генов у растений в подводных условиях, трансгенные линии широко используются для генетических функциональных исследований. Однако этот подход ограничен высокими затратами, трудоемкими процессами трансформации и субкультур, а также низкой эффективностью трансформации у многих видов сельскохозяйственных культур, что требует разработки альтернативных методологий. Транзиентные экспрессионные системы на основе протопластов широко применяются в молекулярных исследованиях растений в качестве универсальной и эффективной альтернативы. Эти системы облегчают исследования промоторной активности, сигнальных путей в ответ на сигналы окружающей среды, взаимодействий белок-белок или белок-ДНК, а также субклеточной^{локализации.} Сообщалось о создании протопластовых переходных систем экспрессии не только на модельных ^{растениях 4,5}, но и на экономически важных культурах, таких как сахарный тростник⁶, гвоздика⁷, орхидеи фаленопсис ⁸ и баклажаны⁹. Кроме того, эти системы были успешно внедрены на древесных растениях, включая Camellia oleifera¹⁰и Populus trichocarpa¹¹. Тем не менее, протоколы применения протопластных систем для изучения листовых овощей в условиях гипоксического стресса, вызванного погружением, ограничены. Поэтому в данной работе был разработан интегрированный протокол для тех, кто заинтересован в изучении реакций гипоксии у листовых овощей с использованием системы экспрессии переходных процессов капустных протопластов.

Для осуществления реакции гипоксии, вызванной погружением, на клеточном уровне, в предыдущих исследованиях было использовано несколько методологий поглощения кислорода для моделирования гипоксических сред. К ним относятся использование EC-Oxyraze, OxyFluor, сульфита натрия и пакетов, потребляющих кислород. EC-оксиразу обычно используется для анаэробного лечения клеточных линий^{человека 12} и протопластов Arabidopsis ¹³. Было обнаружено, что оксифтор эффективен в смягчении фотообесцвечивания, вызванного активными формами кислорода во время флуоресцентной визуализации живых клеток^14,15. Сульфит натрия используется в анаэробной обработке нематод¹⁶ и, в последнее время, в протопластах риса в сочетании с такими методами, как иммунопреципитация хроматина (ChIP)¹⁷. Пакеты поглотителей кислорода, используемые в основном для анаэробного бактериального культивирования¹⁸, также продемонстрировали эффективность в индуцировании активации промоторов ZmPORB1 в протопластах кукурузы в анаэробных условиях¹⁹.

Настоящая работа направлена на создание надежного конвейера для выделения протопластов капусты и экспрессии переходных процессов. Впоследствии эффективность различных методов лечения, корректирующих кислород, оценивалась путем оценки промоторной активности генов анаэробного ответа с использованием анализов на двойную люциферазу. Ожидается, что протокол, разработанный в этом исследовании, будет ценным для будущих исследований, связанных с погружением или гипоксическим стрессом в системах Brassica .

Протокол

В исследовании использовались два сорта товарной капусты (B. oleracea var. capitata): 'Fuyudori' и '228'. Графическое представление рабочего процесса протокола показано на рисунке 1. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Подготовка рассады капусты

1. Сеять семена капусты 'Фуюдори' и '228' с использованием коммерческого растительного субстрата в круглые квадратные отверстия (Г 4,5 см x В 4,5 см) 48-луночных противней (Д 49 см x Ш 28 см x В 5 см). Заделайте семена примерно на 1 см вглубь питательной среды.
2. Выращивайте рассаду капусты в комнате для выращивания при температуре 22 °C с циклом свет-темнота 16/8 ч. Поддерживайте интенсивность света 100 μмоль ^м-2·^с-1 (белая люминесцентная трубка) во время световой фазы.
3. Через 2-3 недели роста используйте рассаду капусты на стадии 2-х листьев для дальнейшего выделения мезофилла протопластов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемый размер рассады капусты – это стадия с 2 листьями, при которой второй настоящий лист полностью раскрыт, но третий настоящий лист не развернут, а его длина короче 1 см (рисунок 2А). Чтобы синхронизировать стадии развития рассады капусты, семена сорта 'Фуюдори' необходимо высевать примерно на 2 дня раньше, чем семена сорта '228' из-за их разной скорости роста. Такая корректировка обеспечивает равномерный рост и созревание среди растений капусты на желаемой стадии.

2. Выделение протопластов капусты

1. Перед каждым выделением протопластов приготовьте 12,5 мл раствора фермента (табл. 1).
   1. Предварительно нагрейте раствор с 10 мМ MES (pH 5,7) и 0,6 М маннитола до 55 °C. Продолжайте нагревать раствор при температуре 55 °C в течение 10 минут после добавления 1,5% целлюлазы R10 и 0,75% мацероцима R10.
   2. После того как раствор фермента остынет до комнатной температуры (25 °C), добавьте 10 мМ CaCl₂ и 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA). Фильтр стерилизуют приготовленный ферментный раствор в чашку Петри диаметром 9 см с помощью шприцевого фильтра 0,22 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительный подогрев раствора повышает растворимость ферментов и инактивирует протеазу. Эффекты пищеварения варьируются в зависимости от различных типов ферментов целлюлазы. Комбинация целлюлазы R10 и мацероцима R10 подходит для выделения протопластов капусты.
2. Соберите вторые только что раскрывшиеся настоящие листья от пяти до восьми рассадных капуст, и нарежьте их полосками по 0,5-1,0 мм с помощью острого лезвия бритвы. Сразу же переложите полоски листьев в свежеприготовленный ферментный раствор.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Отбор здоровых и выделенных листьев из капусты на правильном этапе имеет решающее значение. Вторые вновь расширенные истинные листья из рассады капусты на стадии 2 листьев обеспечивают наибольшую эффективность изоляции протопластов. Перезрелые растения, семядоли или состаренные листья не рекомендуется для выделения протопластов. Из пяти-двенадцати хорошо разросшихся настоящих листьев можно успешно дать капустные протопласты в 12,5 мл ферментного раствора. Количество листьев, необходимых для выделения протопластов, зависит от желаемого необходимого количества протопластов. Как правило, протопластов, полученных от пяти до восьми листьев, достаточно для последующих экспериментальных процедур.
3. После вакуумной инфильтрации в темноте в течение 30 минут (рисунок 2B) подержите полоски капустных листьев погруженными в раствор фермента (рисунок 2C) в темноте при комнатной температуре еще 4-16 часов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время переваривания ферментов может варьироваться в зависимости от сорта капусты и должно быть оптимизировано в соответствии с конкретным генотипом. Например, сорт 'Fuyudori' требует более длительного времени переваривания (16 часов) по сравнению с сортом '228' (4 часа) из-за более толстых листьев сорта 'Fuyudori'.
4. Разбавьте раствор, содержащий протопласты, равным объемом раствора W5, который состоит из 2 мМ MES (pH 5,7), 154 мМ NaCl, 125 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl и 5 мМ глюкозы (см. Таблицу 1 для приготовления), чтобы остановить ферментативное расщепление.
5. Освободите суспензию протопласта путем легкого вращения или с помощью орбитального встряхивателя. Отфильтруйте клеточную суспензию через клеточный фильтр 70 мкм в коническую пробирку объемом 50 мл.
   Выделенные протопласты способны проходить через клеточное сетчатое фильтр размером 70 мкм, в то время как неперепреданные растительные остатки задерживаются в сетчатом фильтре и впоследствии удаляются из суспензии. Сетчатые фильтры можно использовать повторно и хранить в 75% этаноле после стирки, но перед использованием необходимо полностью промыть сетчатые фильтры раствором W5 для удаления остатков этанола.
6. Центрифугируйте раствор протопластов со 150 x g в течение 2 мин при 4 °C, затем осторожно удалите надосадочную жидкость. Осторожно промойте гранулированные протопласты, добавив 10 мл раствора W5 вдоль стенки конической трубки с приблизительной скоростью потока 1 мл·^с-1. Центрифугируйте пробирку при 150 x g в течение 2 минут при 4 °C и повторите эту процедуру промывки еще раз, чтобы обеспечить полное удаление ферментного раствора.
7. Ресуспендируйте протопласты в растворе W5 и поместите их на лед на 30 минут. После инкубации льда удаляйте надосадочную жидкость пипеткой по 1 мл за один раз до тех пор, пока не будет удалена вся надосадочная жидкость.
8. Ресуспендируйте протопласты в предварительно охлажденном льдом растворе MMG, состоящем из 4 мМ MES (pH 5,7), 0,4 M маннитола и 15 мМ MgCl₂ (приготовление см. в Таблице 1 ).
9. Измерьте концентрацию протопластов с помощью гемоцитометра и отрегулируйте конечную концентрацию до 4 x 10⁵ протопластов·^мл-1 с помощью раствора MMG.

3. Трансфекция протопластов

1. Смешайте общий объем 10 мкл плазмиды (5-10 мкг) (Дополнительный файл 1) со 100 мкл протопластов (4 x 10⁴ протопласта) и положите на лед на 10 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для очистки плазмид трансфекционного класса используется коммерчески доступный набор плазмид в соответствии с инструкциями производителя. Приблизительно 4 x 10⁴ протопласта обычно используются в двойном люциферазном репортерном анализе. Для более масштабных экспериментов доступно большее количество протопластов для трансфекции. В частности, около 2 x 10⁵ протопластов, трансфицированных 10 мкг плазмиды, демонстрируют доказанную эффективность трансфекции в диапазоне от 30% до 40%.
2. Добавьте равный объем (110 мкл) свежеприготовленного раствора ПЭГ (см. Таблицу 1 для приготовления), содержащего 40% полиэтиленгликоля 4000 (PEG4000), 0,1 М CaCl₂ и 0,2 М маннита, и осторожно перемешайте.
3. Инкубируйте смесь протопластов при комнатной температуре в темноте в течение 10 минут, затем добавьте 440 μL раствора W5 для завершения реакции.
4. Центрифугируйте трансфицированные протопласты при 150 x g в течение 2 мин при 4 °C и ресуспендируйте гранулу в 750 мкл обогащенного кислородом раствора W5. Перенесите ресуспендированные протопласты на 6-луночный планшет для культуры тканей, предварительно покрытый 1% BSA.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор W5, используемый для инкубации клеток, должен быть пузырчатым с кислородом с помощью кислородного концентратора (~90% кислорода), подключенного к воздушному камню, в течение 5 минут (Рисунок 2D). После этого процесса оксигенации конечная концентрация растворенного кислорода в растворе W5 увеличилась с 7,84 мг· ^L-1 ± 0,05 мг· ^L-1 до 29,18 мг· ^L-1 ± 0,43 мг· ^L-1, измеренный с помощью измерителя растворенного кислорода. Объем раствора W5 для ресуспендирования трансфицированных протопластов зависит от типа используемой тарелки для культуры клеток ткани. Для 12-луночных или 24-луночных планшетов для культивирования клеток рекомендуется уменьшить объем раствора W5, чтобы смягчить стресс гипоксии во время инкубации из-за большей глубины внутри лунок. Для нанесения покрытия БСА на каждую лунку культуральной пластины получали 1 мл 1% раствора БСА, которому давали покрыть лунки в течение 10 с. Затем раствор BSA сбрасывали из каждой скважины, а затем заполняли скважины раствором W5. Эта процедура была направлена на создание временной неадгезивной поверхности с помощью BSA, эффективно предотвращающей прилипание протопластов к пластиковой поверхности культуральной пластины во время последующих экспериментальных этапов.

4. Лечение гипоксии на капустных протопластах

1. Проводите химическую или физически индуцированную терапию гипоксии сразу после трансфекции протопластов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется применять лечение гипоксии сразу после трансфекции протопластов. Длительная инкубация протопластов может уменьшить последующую реакцию гипоксии.
   1. Для химически индуцированной гипоксии на протопластах капусты добавьте OxyFluor, EC-Oxyrase и сульфит натрия в раствор протопластов W5.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование 0,6 ЕДк·^мл-1 EC-оксиразы, 0,6 ЕД·^мл-1 OxyFluor и 1 г·^мл-1 сульфита натрия в W5 были протестированы условия, способные индуцировать промоторы BoADH1 и BoSUS1L (Рисунок 3A) с низким повреждением целостности протопластов в двух рассмотренных сортах капусты.
   2. При гипоксии, вызванной потреблением кислорода, поместите два пакета поглотителей кислорода в анаэробную банку объемом 3,5 л, чтобы создать гипоксическую среду.
2. Соберите обработанные гипоксией протопласты путем центрифугирования при 150 x g в течение 2 мин при 4 °C. Собранные протопласты заморозьте с помощью жидкого азота и храните их в морозильной камере при температуре -80 °C для последующих анализов.

5. Двойной анализ люциферазы

1. Провести репортерный анализ на двойную люциферазу в соответствии с инструкциями производителя с незначительными изменениями.
   1. Ресуспендируйте протопласты капусты в 50 мкл 1x пассивного лизисного буфера и вихря в течение 10 с.
   2. Инкубируйте разрушенные протопласты на льду в течение 10 минут и собирайте надосадочную жидкость после центрифугирования при 10 000 x g в течение 10 минут при 4 °C.
   3. Добавьте по 20 мкл клеточного лизата в каждую лунку микропланшета. Внесите 100 мкл реагента II для анализа люциферазы в лунки и измерьте активность люциферазы светлячков с помощью считывателя микропланшетов.
   4. Добавьте 100 мкл коммерчески доступного реагента для анализа в каждую лунку и измерьте активность люциферазы Рениллы с помощью считывателя микропланшетов.

Результаты

В этой работе была успешно разработана система переходной экспрессии с использованием протопластов капусты (см. Рисунок 1 для рабочего процесса). Протопласты выделяли из 2-3-недельных настоящих листьев капусты соответствующего размера (рис. 2A) коммерческих сортов капусты 'Fuyudori' и '228' с использованием расщепления целлюлазы/мацероцима и темной вакуумной инфильтрации (рис. 2B, C). Чтобы смягчить гипоксические условия, испытываемые погруженными протопластами во время инкубации, раствор W5 насыщали кислородом с помощью воздушного барботера, подключенного к кислородному аппарату (рис. 2D). Этот процесс значительно повысил концентрацию растворенного кислорода в растворе W5 с 7,84 мг· ^L-1 ± 0,05 мг· ^L-1 до 29,18 мг· ^L-1 ± 0,43 мг· ^L-1 через 5 минут пузырьков кислорода. После процесса выделения выход протопластов составил 1,04 x 10⁷ для 'Fuyudori' и 4,00 x 10⁶ протопластов·^г-1 от свежего веса для '228' после ночного периода пищеварения (рис. 2E). Впоследствии GFP был использован в качестве репортерного гена для оценки эффективности трансформации PEG-опосредованного метода трансфекции, показав, что эффективность трансфекции протопластов в капусте была выше 40% в обоих сортах (рис. 2F), тем самым подтвердив жизнеспособность этой системы.

Кроме того, промоторные конструкции генов анаэробного дыхания капусты, векторов BoADH1p::Luc и BoSUS1Lp::Luc (рис. 3A), были введены в протопласты капусты в качестве репортеров для оценки эффектов гипоксической индукции при нескольких видах лечения. К этой системе модели переходной экспрессии также применялись различные методы корректировки кислорода. Результаты показали, что все виды лечения с выделением кислорода, за исключением сульфита натрия, успешно индуцировали реакцию гипоксии в протопластах капусты (рис. 3B). В частности, промоторная активность BoADH1 увеличилась примерно в 2,6 и 3,2 раза по сравнению с контролем после лечения EC-Oxyraze и OxyFluor соответственно, и, в частности, более чем в 7,0 раз при лечении кислородным абсорбером (рис. 3B). Аналогичным образом, активность промотора BoSUS1L увеличилась примерно в 1,7 и 1,8 раза при обработке EC-оксиразой и оксифтором соответственно, в то время как обработка пакетом с кислородными абсорберами привела к существенному увеличению более чем в 5,6 раза (рис. 3B). Эти результаты свидетельствуют о том, что пакет поглотителей кислорода демонстрирует превосходную эффективность в создании гипоксической среды в этой экспериментальной системе протопластов капусты.

Рисунок 1: Графическое представление рабочего процесса изоляции протопластов. На этом рисунке показан пошаговый процесс выделения протопластов из ткани капустных листьев. Рабочий процесс визуально изображается, чтобы обеспечить четкое понимание процедуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Выделение протопластов из ткани листьев капусты. (A) Показано появление коммерческих сортов капусты 'Fuyudori' и '228' на рекомендуемой стадии роста. Вторые вновь полностью раскрывшиеся истинные листья (обозначены стрелкой) кочанов в стадии 2 листьев отбираются для выделения протопластов. Масштабная линейка: 2 см. (B) Вакуумный насос и эксикатор используются для процесса вакуумной инфильтрации полосок капустных листьев, при этом перед ферментативным разложением проводится 30-минутная инфильтрация. (В) Показано состояние полосок капустных листьев при ферментативном переваривании. Полное переваривание ткани листа занимает в общей сложности 4-16 ч. Масштабная линейка: 3 см. (D) Фотографии демонстрируют использование кислородного концентратора, подключенного к воздушному камню, для увеличения концентрации растворенного кислорода в растворе W5. Масштабная линейка: 5 см. (E) Более 4,00 x 10⁶ протопластов мезофилла на грамм свежего веса (FW) были получены из сортов капусты 'Fuyudori' и '228' и наблюдались под микроскопом. Масштабная линейка: 200 мкм. (F) Показано, что эффективность трансфекции протопластов из обоих генотипов капусты с использованием репортера GFP с конститутивной экспрессией превышает 40%. Масштабная линейка: 200 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Реакция протопластов капусты на гипоксию в условиях дефицита кислорода. (A) Конструкции генов реакции на гипоксию, промоторы BoADH1 и BoSUS1L , используются в качестве репортеров для оценки реакции на гипоксию в протопластах капусты 'Fuyudori'. (B) В общей сложности 5 г репортерных плазмид трансфицируют в протопласты капусты 'Fuyudori', которые инкубируют в растворе W5 с пузырьками кислорода перед обработкой гипоксией в течение 4 ч. Уровень кислорода снижается во время инкубации путем добавления в раствор W5 ЕС-оксиразы (0,6 ЕД·^мл-1), OxyFluor (0,6 ЕД·^мл-1) и сульфита натрия (1 г·^мл-1). Обработка пакета с поглотителем кислорода выполняется путем помещения двух пакетов с поглотителем кислорода в анаэробную банку объемом 3,5 л. Группа «КФК» представляет собой контрольную группу без лечения гипоксии. После обработки протопласты собирают для двойного анализа люциферазы. Каждое значение представляет среднее значение ± SD, при этом n = 4. Разные буквы указывают на значимые различия (P < 0,05) на основе одностороннего теста ANOVA с ЛСД post-hoc. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Приготовление раствора фермента, раствора W5 и раствора MMG. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительный файл 1: Данные плазмид для трансфекции протопластов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Этот протокол представляет собой оптимизированный метод выделения протопластов из двух коммерческих сортов капусты. Эффективность этого метода в первую очередь оценивается по двум важнейшим параметрам контроля качества: выходу жизнеспособных протопластов и эффективности трансфекции протопластов. Реализация этого протокола привела к выходу, превышающему 4,00 x 10⁶ протопластов^·г−1· FW ткани мезофилла из обоих сортов капусты (рис. 2E, F). Этот урожай сопоставим с таковыми у других видов, включая баклажаны, гвоздику, сахарный тростник и Camellia oleifera, где выход протопластов варьировался от 2,5 x 10⁶ до 1,4 x 10⁷ протопластов^·г−1· FW 6,7,9,17. Эти результаты свидетельствуют о потенциальной применимости протокола в различных генетических условиях с B. oleracea.

Успех протокола зависит от нескольких важнейших факторов. Прежде всего, это использование указанных листьев здоровой рассады капусты на соответствующей стадии роста (Рисунок 2А). Использование старых или нездоровых растений может привести к получению протопластов низкого качества. Также важно аккуратно разрезать ткань листа на полоски 0,5-1,0 мм и не раздавливать ее тупым лезвием. Процесс расщепления ферментов, длящийся от 4 до 16 часов, является еще одним важным этапом. Периоды переваривания короче 4 часов могут привести к неполному перевариванию, в то время как периоды переваривания более 16 часов подвержены риску клеточного стресса. Примечательно, что генотипы с более толстыми листьями, такие как 'Fuyudori', могут выиграть от увеличенного времени переваривания для максимального увеличения выхода протопластов. Для сравнения, '228' требовалось всего 4 часа для полного переваривания. Кроме того, широкий диапазон времени разложения может обеспечить большую гибкость в планировании экспериментов. Например, 4-часовое разложение позволяет выделить протопласты и выполнить последующие переходные анализы в течение одного дня. И наоборот, 16-часовое разложение позволяет начать ферментное расщепление вечером и позволяет завершить последующие шаги на следующий день, что может повысить удобство применения этого протокола. Кроме того, крайне важно бережно обращаться с протопластами на протяжении всего процесса выделения протопластов из-за их хрупкости и восприимчивости к механическим нагрузкам.

Для моделирования анаэробных условий, представляющих стресс от наводнения, в этом протоколе использовались обычные поглотители кислорода и мешки, потребляющие кислород, для создания гипоксических сред. Для повышения эффективности системы используется кислородный аппарат для насыщения кислородом раствора W5 (рис. 2D), направленный на снижение сигналов фоновой гипоксической реакции в протопластах капусты в период их инкубации перед обработкой. Процесс оксигенации в течение 5 минут значительно повышает уровень растворенного кислорода с 7,84 мг· ^L-1 ± 0,05 мг· ^L-1 до 29,18 мг· ^L-1 ± 0,43 мг· ^L-1, свидетельствующий о выраженном эффекте в облегчении гипоксических состояний. Среди методов поглощения кислорода, использованных в этом исследовании, пакеты с поглотителями кислорода продемонстрировали превосходную производительность, индуцируя самую высокую активность промотора в двух основных генах анаэробного ответа (рис. 3). Кроме того, этот метод предлагает дополнительное преимущество масштабируемости, позволяя одновременно обрабатывать несколько образцов за счет использования потребляющих кислород мешков в одной анаэробной банке, в отличие от индивидуального нанесения поглотителей кислорода на каждую клеточную культуральную пластину. Таким образом, пакеты с поглотителями кислорода обеспечивают удобную и эффективную платформу, пригодную для оценки реакции протопластов капусты в условиях гипоксии.

Несмотря на то, что этот протокол демонстрирует ряд преимуществ, важно признать его ограничения, в частности, относительно скромную эффективность трансфекции протопластов капусты. Несмотря на то, что эта эффективность не достигает 90%, о которых сообщалось для Arabidopsis⁵, она, тем не менее, оказывается достаточной для успешных последующих исследований промоторной активности (рис. 3), что указывает на значительный потенциал функционального анализа в этой системе.

Учитывая глобальное значение капусты как основной овощной культуры, интеграция этого протокола с методами лечения гипоксии и генетического анализа обещает получить дальнейшее понимание регуляторных механизмов в капусте в условиях наводнения. Такая информация потенциально может ускорить разработку устойчивых к наводнениям сортов капусты, удовлетворяя критическую потребность в условиях экстремальных погодных условий и увеличения числа наводнений.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
2-(N-морфолино) этансульфоновая кислота (MES)	PhytoTech Labs	M825	Для приготовления ферментного раствора
228 семян капусты	Takii & Co., Ltd. (Киото, Япония)
50 мл коническая трубка	SPL Life Sciences	50050	Для приготовления ферментного раствора
6-луночный планшет для культуры тканей	Alpha Plus	16106	Для инкубации протопластов
70 μ m клеточный фильтр	Sorfa	SCS701	Для фильтрации протопластов
9-см чашка Петри	Alpha Plus	16001	Для ферментативного разложения
Анаэробная банка	HIMEDIA	Анаэробная банка 3,5 л	Для лечения гипоксии
Бычий сывороточный альбумин	Sigma-Aldrich	A7906	Для приготовления раствора W5 и покрытия культуральной пластины
Хлорид кальция	J.T.Baker	131301	Для приготовления раствора W5 и раствора ПЭГ
Целлюлаза R10	Yakult		Для приготовления ферментного раствора
Desiccator	Tarsons	402030	Для вакуумной инфильтрации
D-glucose	Bioshop	GLU501	Для приготовления раствора W5
Измеритель растворенного кислорода	Thermo Scientific	Orion Star A223	Для измерения кислорода
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M1902	Для приготовления ферментного раствора, раствора ПЭГ и раствора MMG
Двухлюциферазный репортерный анализатор	Promega	E1960	Для репортерного анализа на двойную люциферазу
EC-oxyrase	Oxyrase Inc.	EC-0005	Для лечения гипоксии
семян капусты Фуюдори	Kobayashi Seed Co., Ltd. (Какогаваси, Япония)
Высокоскоростная рефрижераторная центрифуга	Hitachi	CR21GIII	Для сбора урожая протопластов
Мацерозим R10	Yakult		Для приготовления ферментного раствора
Магния хлорид Alfa	Aesar	12315	Для приготовления раствора MMG
Микроцентрифуга	Hitachi	CT15RE	Для сбора протопластов
Microplate	Greiner	655075	Для двухлюциферазного репортерного анализа
Считыватель микропланшетов	Molecular Devices	SpectraMax Mini	Для Двойной люциферазный репортерный анализ
Millex 0.22 μ m шприцевой фильтр	Merck	SLGP033RS	Для приготовления ферментного раствора
Безмасляный вакуумный насос	Rocker	Коромысло 300	для вакуумной инфильтрации
OxyFluor	Oxyrase Inc.	OF-0005	Для лечения гипоксии
Пакет поглотителей кислорода	Mitsubishi Gas Chemical Company	AnaeroPack, MGCC1	Для лечения гипоксии
Концентратор кислорода	UTMOST PERFECT	AII-X	Для барботирования кислорода в растворе W5
Субстрат для растений	Klasmann-Deilmann	Potgrond H Субстрат	Для подготовки рассады капусты
Набор Plasmid Midi	QIAGEN	12145	Для очистки ДНК трансфекционной плазмиды
Полиэтиленгликоль 4000	Fluka	81240	Для трансфекции протопластов
Хлорид калия	J.T.Baker	304001	Для приготовления раствора W5
Бритвенное лезвие	Gillette		Для приготовления полосок капустных листьев
Хлорид натрия	Bioshop	SOD002	Для приготовления раствора W5
Сульфит натрия	Sigma-Aldrich	S0505	Для лечения гипоксии
Водяная баня	Yihder	BU-240D	Для приготовления ферментного раствора