Количественная взаимосвязь «структура-активность», прогнозирование активности и молекулярная динамика ненуклеотидных ингибиторов обратной транскриптазы

Summary

В этом исследовании использовались стратегии in silico для определения перечисленного этравирина в качестве перспективного терапевтического агента для лечения ВИЧ. Наши результаты в области молекулярных взаимодействий и динамики поддерживают рациональный дизайн новых ННИОТ в качестве возможных альтернатив лечению ВИЧ.

Abstract

Растущая заболеваемость лекарственной устойчивостью ВИЧ-1 представляет собой проблему для эффективности комбинированной антиретровирусной терапии, особенно в Южной Африке. Развитие резистентности к ненуклеотидным ингибиторам обратной транскриптазы (ННИОТ) ставит под угрозу долгосрочный успех антиретровирусной терапии. По оценкам, в 2019 г. устойчивость к противомикробным препаратам стала непосредственной причиной 1,27 миллиона смертей во всем мире. В этом исследовании использовался подход in-silico для изучения препаратов NNTRI и их производных. Используемые методы включали расчеты теории функционала плотности, молекулярный докинг, перечисление, количественный анализ зависимости структуры и активности (QSAR), моделирование молекулярной динамики (MDS) и молекулярную механику с обобщенными методами Борна и поверхностными методами. Анализ был сосредоточен на различных производных пиримидина и шести препаратах ННИОТ, изучая их взаимодействие с белком ВИЧ-1 (код PDB 1HQU).

Была разработана модель QSAR для прогнозирования биологической активности шести исследуемых ННИОТ. Используя 94 производных пиримидина, модель QSAR достигла R² 0,822 и Q² 0,815, что указывает на высокий уровень прогностической точности.

МДС были проведены для оценки стабильности различных лигандов и их недавно разработанных альтернатив, гарантируя, что они остаются связанными с активным центром белка в течение 200-наносекундного моделирования. Этравирин показал колебания среднеквадратичного отклонения (RMSD) примерно на 4,5 Å, в то время как его перечисленные производные показали колебания RMSD на 3,5 Å. Благодаря молекулярному докингу, МДС и расчетам свободной энергии, перечисленный этравирин продемонстрировал наилучшую производительность, со значением активности 7,373 и показателем докинга -10,517 ккал/моль. Кроме того, расчетная свободная энергия связывания для перечисленного этравирина составила -89,684 ккал/моль, превосходя другие исследуемые лиганды. Значительное улучшение позволяет предположить, что модифицированный этравирин обладает многообещающим потенциалом в качестве нового агента в антиретровирусной терапии.

Полученное более низкое значение RMSD, усиленное взаимодействие аминокислот и высокая свободная энергия связывания указывают на то, что перечисленный этравирин может служить жизнеспособной альтернативой для лечения ВИЧ/СПИДа.

Introduction

Несмотря на значительные успехи в лечении, серьезная глобальная угроза здоровью синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД), вызываемого вирусом иммунодефицита человека-1 (ВИЧ-1), остается постоянной угрозой¹. Антиретровирусные препараты, известные как ингибиторы обратной транскриптазы, используются для лечения ВИЧ-инфекции. Обратная транскриптаза, фермент полимераза вирусной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), необходимый для репликации ретровируса, ингибируется ингибиторами обратной транскриптазы (РТИ). Нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (НИОТ) и ненуклеотидные ингибиторы обратной транскриптазы (ННИОТ) являются основными РТИ².

Высокоактивная антиретровирусная терапия (ВААРТ), комбинация различных противовирусных препаратов, стала стандартной терапией ВИЧ, эффективно контролируя распространение СПИДа и превращая эту некогда смертельную болезнь в управляемое хроническое^{состояние3}. ННИОТ для ВИЧ-1 в настоящее время являются важной частью схемы ВААРТ⁴. Устойчивость к противомикробным препаратам (УПП) является одной из наиболее серьезных угроз глобальному здравоохранению, в результате которой, по оценкам, погибло 1,27 миллиона^{человек5}. В связи с этим существует острая необходимость в устранении неполадок с УПП и выявлении новых противомикробных агентов. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), УПП достигла тревожного уровня во многих частях мира.

Это создает серьезную угрозу для достижения целей в области устойчивого развития, поскольку подрывает продовольственную безопасность, экономический рост и безопасность в области здравоохранения, а также способствует социальному и экономическому неравенству⁶. Распространенность лекарственно-устойчивых вирусов растет, даже в антиретровирусных препаратах, предназначенных для борьбы с ВИЧ. Согласно последним статистическим данным, по состоянию на конец 2022 года антиретровирусную терапию принимали почти 30 миллионов человек во всем^мире7.

ВОЗ провела 30 обследований и обнаружила, что в 21 из них более 10% лиц, начавших антиретровирусную терапию первой линии, имели устойчивость к невирапину или эфавиренцу⁸. Более того, у лиц, ранее контактировавших с антиретровирусными препаратами, вероятность развития устойчивости к ННИОТ в три раза выше, чем у лиц,^{не подвергавшихся} воздействию антиретровирусных препаратов9. Исследования показали, что значительное число младенцев в возрасте до 18 месяцев, у которых впервые был диагностирован ВИЧ, демонстрировали высокие показатели устойчивых к лекарствам штаммов^10,11. Поразительно, но почти у половины из них еще до начала лечения был обнаружен устойчивый к (ННИОТ) штамм. Эти результаты подчеркивают необходимость ускорения исследований для разработки инновационной терапии ВИЧ.

Разработка лекарственно-устойчивых штаммов и нежелательные побочные эффекты при длительном применении неизбежно создают проблемы для клинического использования ННИОТ¹². Начало комбинированной антиретровирусной терапии (АРТ) увеличивает продолжительность жизни людей, живущих с ВИЧ, несмотря на возможность возникновения неблагоприятных побочных эффектов. Эти побочные эффекты включают в себя риск развития неинфекционных заболеваний, включая липодистрофию, гиперлипидемию, снижение минеральной плотности костной ткани, повышенный уровень глюкозы в крови, приводящий к сахарному диабету 2 типа, гипертонию, повышенный риск инсульта и проблемы, связанные с ожирением¹³. Ранняя диагностика и своевременный доступ к подходящей медицинской помощи на начальной стадии ВИЧ-инфекции дают значительные преимущества как с клинической, так и с общественной точки зрения. Своевременное начало АРТ и профилактика оппортунистических инфекций приводит к заметному снижению заболеваемости и смертности от ВИЧ-инфекции.

Использование АРТ также может способствовать снижению потенциала дальнейшей передачи ВИЧ за счет снижения уровня циркулирующей рибонуклеиновой кислоты ВИЧ. Кроме того, лечение других заболеваний, передающихся половым путем, и сопутствующих инфекций также может снизить вероятность дальнейшего инфицирования ВИЧ¹⁴. ННИОТ относятся к классам ингибиторов необязательного лечения, которые взаимодействуют с ЛТ путем связывания с аллостерической областью или участком ВИЧ. Этот тип ингибирования обычно известен как неконкурентный ингибитор, потому что ННИОТ связывается не в активном центре субстрата, а скорее снаружи. Этот эффект изменяет конформацию сайта связывания субстрата, препятствуя связыванию стандартного субстрата и приводя к преждевременному обрыву цепи. Благодаря своей меньшей токсичности по сравнению с НИОТ, простой структуре, улучшенной биодоступности по сравнению с ингибиторами протеазы и превосходной селективности, ННИОТ стали наиболее привлекательными ингибиторами ВИЧ¹⁵. Таким образом, синтез и дизайн новых ННИОТ имеют решающее значение с фармакокинетической точки зрения^16,17.

ННИОТ играют жизненно важную роль в лечении ВИЧ/СПИДа благодаря своей высокой эффективности и низкой токсичности. Тем не менее, ранние ННИОТ, такие как Невирапин, Делавирдин и Эфавиренц, сталкиваются с устойчивостью к вирусным мутациям в сайте связывания ННИОТ¹⁸. Эти препараты, входящие в семейство диарилпиримидиновых (DAPY), проявляют мощную активность в отношении различных штаммов ННИОТ, в том числе устойчивых к ранним ННИОТ¹⁹, вероятно, благодаря их молекулярной гибкости и более высокому барьеру резистентности к ВИЧ-1 ^20,21. Несмотря на их успех, высокая частота мутаций в ВИЧ-1 ЛТ и отсутствие собственной корректурной активности привели к появлению новых профилей резистентности у пациентов, использующих Этравирин и Рилпивирин^22,23. Эти вирусные мутации отличаются друг от друга, как и мутации, связанные с ранними препаратами ННИОТ^. Более 50 структурно разнообразных классов соединений были идентифицированы как ННИОТ. Примечательно, что шесть ННИОТ получили одобрение на лечение ВИЧ-1. К этим одобренным препаратам относятся невирапин (NVP), делавирдин (DLV), эфавиренц (EFV), этравирин (ETR), рилпивирин (RPV) и доравирин (DOR). На рисунке 1 показана химическая структура этих шести одобренных препаратов ННИОТ²⁵.

В недавнем исследовании²⁶ расчеты DFT и молекулярный докинг показывают, что ловастатин и симвастатин демонстрируют потенциал в качестве антикоронавирусных агентов. Виртуальный скрининг выявил пять новых одобренных FDA молекул-кандидатов, похожих на эфавиренц-скаффолд, с превосходным сродством связывания в активном кармане основной протеазы COVID-19.

Soltan et ^al.27 провели аналогичное исследование по идентификации новых молекул для улучшения связывающей способности с ВИЧ RT путем использования стратегии на основе фрагментов с одобренными FDA препаратами для разработки химических производных. В частности, они использовали структуры делавирдина, эфавиренца, этравирина и рилпивирина в качестве основополагающих каркасов. Лекарственность этих производных была оценена с помощью Swiss-ADME с последующим состыкованием их с родственными кристаллическими структурами. Исследование завершилось выбором соединений, демонстрирующих превосходное сродство связывания по сравнению с их родительскими каркасами, в частности, было отмечено более выраженное улучшение в производных, разработанных из ННИОТ второго поколения, этравирина и рилпивирина. Например, производные RPV01 и RPV15 показали значительное повышение энергетических значений в докинге по сравнению с рилпивирином, что указывает на потенциальную полезность в борьбе как с дикими, так и с мутантными формами ВИЧ-инфекции.

Муругесан и его коллеги²⁸ провели исследование, предложив различные подходы медицинской химии для повышения эффективности и минимизации резистентности при лечении ВИЧ. В исследовании использовались молекулярная гибридизация, биоизостерическая замена и высокопроизводительный скрининг. В своем исследовании им удалось идентифицировать новые скаффолды ННИОТ с высокой эффективностью против штаммов ВИЧ как дикого типа, так и штаммов ВИЧ с лекарственной устойчивостью. Они разработали производные DAPY, которые демонстрируют превосходную селективность и низкую токсичность, при этом некоторые соединения демонстрируют эффективное ингибирование при наномолярных концентрациях.

В последнее время использование вычислительных инструментов наряду с исследованиями in silico приобрело популярность благодаря практическому анализу квантово-химических^{характеристик} препарата. В этом исследовании были применены компьютерная система разработки лекарств, теория функционала плотности, качественная связь структура-активность и молекулярная динамика для обнаружения мощных ННИОТ.

Protocol

1. Вычислительные детали — приготовление белка

1. Нажмите на значок «Окно» на экране монитора и нажмите «Все приложения». Прокрутите вниз, чтобы перейти к папке Schrodinger, откройте папку и нажмите на значок Maestro , показанный на рисунке 2B, и выберите открыть , как показано на рисунке 2B , чтобы запустить программное обеспечение.
2. Получите выбранную структуру белка, перейдя на вкладку «Файл » в программном обеспечении. В появившемся коротком меню выберите Get PDB, как показано на рисунке 3A, и введите выбранный код PDB в текстовое поле, как показано на рисунке 3B. Нажмите на кнопку загрузки , и выбранный PDB-файл отобразится в окне проекта.
3. Кроме того, вы можете загрузить выбранный белок на локальный компьютер из банка данных о белках, введя идентификационный код базы данных белков (PDB ID) в поле поиска и нажав кнопку «Скачать », чтобы загрузить файл PDB на локальный компьютер. Перейдите на вкладку «Файл » и выберите опцию «Импорт структур ». В интерфейсе Import найдите загруженный PDB-файл, как показано на рисунке 3C , и нажмите кнопку Import , как показано на рисунке 3D.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Структура белка будет открыта как 3D-структура в отдельном окне, как показано на рисунке 4.
4. Перейдите в правый верхний угол программы, выберите вариант задания и введите «приготовление белка » в строке поиска . Нажмите кнопку Protein Preparation Workflow на дисплее справа, как показано на рисунке 5A.
5. В появившемся окне Protein preparation Workflow запишите имя задания в качестве имени файла, который нужно сохранить, и нажмите зеленую кнопку Run в правом нижнем углу, как показано на рисунке 5B.
6. Отслеживайте выполнение задания, нажав кнопку Задания в правом верхнем углу, как показано на рисунке 5C.
7. Выберите и щелкните правой кнопкой мыши на приготовленном белке и выберите разделенный лиганд, как показано на рисунке 5D. Выберите разделение на лиганды, воду и другие. Это необходимо для того, чтобы белковые компоненты были независимыми записями в навигаторе рабочего пространства

2. Получение лиганда

1. Загрузите нужные химические соединения из базы данных PubChem³⁰ , введя название выбранного соединения в строку поиска . Пройдитесь по конструкциям и выберите 3-мерные (3D) структуры. Нажмите « Загрузить » в правом верхнем окне, чтобы загрузить координаты структуры в виде файла структурированных данных (SDF). Если 3D-структура недоступна, загрузите 2D-структуру и используйте другие инструменты для создания 3D-структуры из 2D-структуры.
2. Перейдите на вкладку File в Schrodinger и выберите Import Structures, как показано на рисунке 6A. Перейдите в папку файла, где структуры сохранены в формате SDF, чтобы загрузить соединения, которые необходимо подготовить.
3. Выберите «Задача» в правом верхнем углу программного обеспечения Schrodinger. Введите LigPrep в строке поиска и выберите LigPrep в правом окне слева, как показано на рисунке 6B.
4. Выберите «Использовать структуры из », чтобы выбрать файлы из таблицы «Рабочая область» или «Проект». Выберите предпочтительные опции в окне LigPrep , сохраните файл на локальном компьютере и нажмите кнопку "Выполнить ", чтобы отправить задание на подготовку лиганда, как показано на рисунке 6C.

3. Геометрия и оптимизация лигандов

1. Откройте программу³¹ для оптимизации геометрии загруженных конструкций. Перейдите на вкладку «Файл » (рисунок 7A) и нажмите «Открыть », чтобы выбрать загруженный файл SDF из базы данных PubChem.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Файл загрузится в главном окне. Нажмите на другое фиолетовое окно, чтобы визуализировать те же химические соединения. Каждая реализованная настройка будет отображать результат в фиолетовом окне.
2. Перейдите на вкладку «Расчет» и выберите вкладку «Настройка гауссова расчета». Перейдите на вкладку Job type , показанную на рисунке 7B , и выберите Optimization или Opt+Freq.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от (размера) количества атомов или соединений сначала оптимизируйте, а затем частоту. Если состав меньше, выполните Opt+Freq. Чем больше молекула, тем больше времени требуется для выполнения обоих методов Opt+Freq по сравнению с оптимизацией, за которой следует Frequency.
3. Перейдите на вкладку «Метод » и выберите методы квантовой химии , а затем глобальный гибридный функционал обменной корреляции Кона-Шама по выбору, базисный набор, заряд и спин с помощью стрелок раскрывающегося списка в каждом разделе.
4. Перейдите к заголовку и укажите имя исследуемого соединения.
5. Перейдите на вкладку Ссылка 0 и укажите выбранные Memory limit и Shared processors . Снимите галочки с окошек Полный контур , как показано на рисунке 7C.
6. Нажмите кнопку Edit внизу, чтобы сохранить входной файл Гаусса, как показано на рисунке 3C. Сохраните файл в нужном месте с выбранным именем файла в виде файла задания Гаусса (gjf).
   ПРИМЕЧАНИЕ: После сохранения входного файла по Гауссу появится всплывающее окно, показывающее содержимое файла в Блокноте. Отредактируйте содержимое файла, включая такие параметры, как изменение заряда и функций, которые были недоступны в параметрах настроек. Подготовленный файл задания Гаусса будет использоваться в качестве входного файла для отправки для выполнения оптимизации и расчетов частоты с локального компьютера.
   В дальнейшем была проведена геометрическая оптимизация этих структур с использованием функционала³² MN15-L и базисного набора³³ 6-31++G(d,p). Однако, если возникнут проблемы в выполнении процесса оптимизации и частоты, можно отправить работу с помощью HPC.

4. Генерация рецепторной решетки

1. Перейдите в раздел Задачи и выберите поколение рецепторной сетки³⁴. Интерфейс генерации рецепторной сетки, показанный на рисунке 8A , идентифицирует активный центр белка, где связывается лиганд ядро-кристалл. Нажмите кнопку Pick, чтобы идентифицировать лиганд и проверить, присутствует ли сокристаллизованный лиганд, из всплывающего верхнего уведомления, показанного на рисунке 8B.
2. Выберите лиганды и/или остатки из рабочей области, и выбранные соединения, представляющие интерес, будут выделены синим цветом в рабочей области.
3. Выберите вкладку настроек на панели генерации сетки рецепторов, чтобы задать размер сетки. Размер сетки по умолчанию составляет 10 Å x 10Å x 10Å. Измените размеры блока на вкладке «Сетка», введя нужные значения напрямую или вручную изменив размер блока в рабочей области.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы вы можете установить дополнительные параметры на вкладке Дополнительно , как показано на рисунке 8C , если это необходимо. Проверьте все настройки, чтобы убедиться в точности.
4. Нажмите кнопку Выполнить, чтобы начать генерацию сетки. После завершения сохраните сгенерированные файлы сетки для последующего моделирования стыковки. Когда задание будет завершено, появится уведомление, как показано на рисунке 8D.

5. Молекулярный докинг

1. Загрузите белок и подготовленные лиганды, перейдя к задачам, стыковке³⁵ и стыковке лигандов (glid docking), как показано на рисунке 9A.
2. Загрузите файл сетки из шага 4.1 выше и выберите лиганды из рабочей области, используя опцию Use ligand from (Использовать лиганд) из опции на рисунке 9B.
3. Выберите предпочтительный метод стыковки на вкладке настроек , показанной на рисунке 9 C (по умолчанию точность стыковки — стандартная точность (SP)).
4. Установите силовое поле на OPLS4 для точного моделирования молекулярных взаимодействий. Задайте ограничения (например, водородные связи) на вкладке Ограничения.
5. Проверьте все настройки и сохраните задание или файл стыковки. Нажмите кнопку ВЫПОЛНИТЬ , чтобы начать процесс стыковки.
6. Появится уведомление о том, что задание завершено, и таблица проекта будет открыта для получения результатов закрепления. Изучите позы привязки, партитуры и взаимодействия.

6. Генерация моделей 2D-QSAR

1. Перейдите на веб-страницу Центра сообщества KNIME и найдите AutoQsar в строке поиска . Выберите вторую запись AutoQsar, показанную на рисунке 10A.
2. Нажмите на значокрабочего процесса d ownload и выберите Download workflow во всплывающем меню, показанном на рисунке 10B. Сохраните рабочий процесс на локальном компьютере.
3. Убедитесь, что KNIME³⁶ установлен, затем откройте его с локального компьютера. Составьте таблицу с каноническими смайликами, названием структуры, значениями activity/IC₅₀ (в микромолярах) и -log(activity/IC) или любым химическим дескриптором по вашему выбору. Сохраните файл в формате CSV, разделенных запятыми, на локальном компьютере.
4. Перейдите в раздел «Файл» и импортируйте рабочий процесс AutoQSAR³⁷. Во всплывающем окне нажмите кнопку Import KNIME Workflow , чтобы выбрать загруженный рабочий процесс AutoQSAR, как показано на рисунке 10C , и выберите Open | Далее | Отделка.
5. Рабочий процесс AutoQsar будет отображаться в окне проводника KNIME в левом верхнем углу. Дважды щелкните по рабочему процессу, чтобы перенести рабочий процесс в главное окно.
6. Дважды щелкните по значку молекулярного считывателя (до MAE) и на вкладке «Настройки » нажмите « Добавить файл(ы)», чтобы добавить лист с входными данными или параметрами.
7. Выберите вкладку «Политика памяти » и нажмите « Записать таблицы на диск» | Хорошо.
8. Щелкните правой кнопкой мыши по кнопке Extract Properties и выберите Configure, как показано на рисунке 10D.
9. Выберите и отфильтруйте выбранные молекулярные или химические свойства из окна исключения в окно включения . Нажмите «Применить».
10. Щелкните правой кнопкой мыши на AutoQSAR Build Model и выберите Configure. Введитеимя модели Q SAR во всплывающем диалоговом окне.
11. Нажмите на кнопку «Сесть» и выберите подходящее свойство из включенных. Выберите случайное значение обучающего набора (например, 85%:15%) и несколько моделей для сохранения. Нажмите «Применить».
12. Щелкните правой кнопкой мыши на нижнем Molecule Reader и выберите «Настроить». Загрузите тестовые лиганды из подготовленного файла CSV Excel, содержащего лиганды, которые необходимо протестировать.
13. Щелкните правой кнопкой мыши « Извлечь свойства » и установите настройки по своему выбору.
14. Щелкните правой кнопкой мыши на верхнем Molecule Reader и выберите «Выполнить».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оранжевая точка указывает на то, что процесс начался, а зеленый свет указывает на успешное выполнение процесса. Следующий шаг будет продолжаться до тех пор, пока все узлы не будут успешно выполнены.
15. . Выполните второе устройство чтения молекул для тестовых лигандов.
16. Сохраните zip-папку с результатами тестового и обучающего набора после успешного выполнения всех узлов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите наиболее эффективную модель на основе результатов перекрестной проверки, таких как SD – стандартное отклонение, R2 – корреляция обучающего набора между фактическими и прогнозируемыми значениями активности и Q2 – корреляция фактической и прогнозируемой активности тестового набора.
17. Оцените производительность рабочего процесса, оценив производительность модели с помощью средства оценки или статистических узлов.
18. Чтобы интерпретировать результаты, определите основные или ключевые дескрипторы с помощью важности признака. Визуализируйте результаты в виде точечной диаграммы или линейчатой диаграммы, чтобы определить связь производительности и дескриптора. Сохраните рабочий процесс и экспортируйте данные о результатах, прогнозы и визуализации в виде точечной диаграммы и/или файлов CSV.

7. Перечисление

1. Перейдите в раздел Task и найдите Ligand Designer, как показано на рисунке 11A.
2. Выберите пару докированного белка и лигандного комплекса в навигаторе рабочего пространства. Нажмите кнопку Analyze Workspace в окне конструктора Ligand. Чтобы создать и оценить новые лиганды, выберите сканирование изостер из списка появившихся рабочих процессов, как показано на рисунке 11B, подразумевается метод выращивания , который удлиняет лиганд путем добавления фрагментов к существующим частям молекулы.
3. После установки параметранумерации e нажмите кнопку «Нумеровать» в появившемся окне уведомления Isostere Scanning. Повторяйте шаг 6.2 для того же белка и другого лиганда до тех пор, пока все лиганды не выполнят один и тот же процесс. Просмотрите перечисленные лиганды из таблицы Projects.
4. Сохраните структуры, экспортировав спроектированные лиганды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Метод перечисления сгенерировал набор оценок стыковки после завершения моделирования.
5. По отдельности выберите перечисленные соединения с более отрицательными показателями стыковки и выполните их повторную стыковку, используя процедуру стыковки, описанную в разделе 4.

8. HOMO и LUMO

1. Откройте программу и загрузите оптимизированный лиганд в формате файла задания по Гауссу.
2. Перейдите в раздел «Инструменты » и выберите редактор MO красными и зелеными точками, как показано на рисунке 12A.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Метод перечисления сгенерировал набор оценок стыковки после завершения моделирования.
3. В редакторе MO в разделе method загрузите файл FChk , нажав на load Mos из существующего файла Chk или FChk, как показано на рисунке 12B.
4. Нажмите на вкладку визуализации | обновить. Подождите ~10 секунд, пока текущая поверхность не появится, как показано на рисунке 12D.
5. Нажмите на одну из двух галочек рядом с выделенными желтыми цифрами, чтобы выбрать поверхность HOMO или LUMO³⁸ для отображения в окне рядом с ней.
6. Щелкните правой кнопкой мыши по фиолетовому фону и выберите «Файл». Нажмите кнопку «Сохранить файл изображения », чтобы сохранить изображение текущей поверхности, как показано на рисунке 12E.
7. Щелкните правой кнопкой мыши по фиолетовому фону и выберите «Просмотр». Выберите формат отображения для изменения фона на вкладке Общие, прозрачность поверхности на вкладке Поверхность, размер и цвет шрифта на вкладке Текст, качество изображения и предпочтительную компоновку поверхности на вкладке Молекула, как показано на рисунке 12F.
8. Либо сгенерируйте файл куба и загрузите файл FChk в GaussView. Перейдите на вкладку «Результаты » и выберите «Поверхности/Контуры». Нажмите на действия куба и загрузите куб. Нажмите на кнопку "Действия с поверхностью " и выберите новую поверхность. Повторите шаг 8.7 для редактирования поверхности.
   Примечание: Чем меньше энергетический разрыв между HOMO и LUMO³⁹ (разница между LUMO и HOMO), тем более реакционноспособной может быть молекула. Рассчитайте энергетическую щель (_E-щель) с помощью уравнения 1 для каждой молекулы.
   

9. Моделирование молекулярной динамики — подготовка и минимизация системы

1. Убедитесь, что пакет Schrodinger Suite установлен на локальном компьютере, и загрузите сложные структуры белково-лигандного комплекса в рабочее пространство⁴⁰.
2. Нажмите на кнопку «Задача» и выберите Desmond System Builder⁴¹. На панели сборщика систем выберите вкладку Солвация и выберите Предопределенную модель растворителя , как показано на рисунке 13A, Форму коробки , как показано на рисунке 13B, и метод расчета размера коробки , как показано на рисунке 13C⁴², которые подходят для комплекса белок-лиганд.
3. Выберите вкладку «Ионы » и нажмите «Пересчитать », чтобы нейтрализовать систему, добавив противоионы и установив желаемую концентрацию соли.
4. Выберите OPLS ^43,44 в качестве силового поля.
5. Присвойте заданию соответствующее имя и сохраните файл задания на локальном компьютере. Нажмите кнопку «Выполнить », чтобы отправить задание на подготовку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что имя задания сохранено. Используйте подробное название.
6. Уравновешивание и производство
7. Просмотр проекта в рабочем пространстве После подготовки системы. Выберите комплекс белок-лиганд из Workspace Navigator, перейдите к задаче и выберите молекулярную динамику (Desmond).
8. Загрузите комплекс лиганд-белок из рабочей области на панели молекулярной динамики. Выберите нужную временную шкалу моделирования на вкладке моделирования . Выберите NPT в качестве класса ансамбля⁴⁵.
9. Назовите задание соответствующим образом и запишите его. Нажмите кнопку «Закрыть », чтобы выйти из окна молекулярной динамики.
10. Отправьте написанное задание на подготовку молекулярной динамики через локальный терминал. По завершении откройте завершенное задание и продолжите время моделирования с первоначально заданной временной шкалы моделирования до желаемого времени моделирования⁴⁵, например, 100 нс, 200 нс.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите шаг 9 для других комплексов белок-лиганд.
    1. Откройте завершенное задание в программном обеспечении Schrodinger Maestro и объедините различные временные рамки моделирования, если выполнялись отдельные задания. Перейдите к кнопке ЗАДАЧА и выберите схему взаимодействия моделирования. Загрузите объединенные файлы или один файл, чтобы визуализировать траекторию.
11. Создание отчета, содержащего визуализации и другие подробные выходные результаты.

10. Молекулярная механика с обобщенной Борном и площадью поверхности (MM-GBSA)

1. Откройте файл траектории и воспроизведите траекторию. Визуализируйте место уравновешивания комплекса белок-лиганд и обратите внимание на количество кадров. Отправьте задание через терминал на обработку.
2. Повторите раздел 9 (подготовьте моделирование молекулярной динамики белка) для другого комплекса белок-лиганд.
3. Спрогнозируйте/просмотрите содержимое выходного файла для анализа полученных результатов. Прочтите среднее значение ΔG для получения свободной энергии связывания комплекса белок-лиганд.
4. Загрузите файл CSV, чтобы визуализировать вклад различных внутримолекулярных молекул.
5. Чтобы рассчитать энергию свободного связывания комплекса, обратите внимание на различные параметры термодинамики и десольватации, включая энергию связывания (_{ΔG связывание}), модель сольватации Колумба (ΔG_{связывание} Кулумба), неполярный член сольватации (ΔG_{связывание} Lipo), коррекцию водородных связей (ΔG_{связывание} Hbond), ковалентное связывание (ΔG_{связывание} ковалентное), π-π коррекцию упаковки (ΔG_{связывание} Packing), обобщенную энергию электростатической сольватации Борна (ΔG_{связывание).} sol GB) и взаимодействие Ван-дер-Ваальса (ΔG_bind vdW).
   1. Получите итоговый ΔGbind путем усреднения значений_{ΔG bind,} определенных для каждого снимка в рамках моделирования MD, как показано в уравнении 2.

Results

Генерация рецепторной сетки и молекулярный докинг

Инструмент генерации рецепторной сетки Maestro был использован для правильной характеристики сайта связывания для последующего стыковки. Сокристаллизованный лиганд был использован для определения сетки. Для молекулярного докинга использовалась прецизионная настройка Glide SP. Инструмент LigPrep в Schrödinger Maestro использовался для подготовки лигандов к стыковке с помощью силового поля OPLS4. Для моделирования молекулярной динамики в Десмонде использовалось силовое поле OPLS4. Силовые поля имеют фундаментальное значение для классического молекулярного моделирования, и их точность имеет решающее значение для качества моделирования связывания белка и лиганда при разработке лекарств. Для OPLS4 назначение заряда и параметров было выполнено с помощью Schrödinger Maestro. Применение параметров OPLS4 привело к значительному улучшению как энергетических, так и геометрических сравнений по сравнению со стандартными параметрами OPLS2005.

Это повлекло за собой докинг специфических лигандов, которые, как известно, имеют сродство к белку-мишени ВИЧ-1, что позволило провести тщательный анализ взаимодействий между молекулами лиганда и остатками рецепторов. В таблице 1 представлена сводная классификация составных соединений для моделирования QSAR.

После докинга HBY561 протокол докинга оценивали путем сравнения повторно докированного лиганда с лигандом, обнаруженным в активном центре кристаллического белка 1HQU. Состыкованные и кристаллизованные структуры HBY561 представлены в Дополнительном файле 1 (Дополнительный рисунок S1 и Дополнительный рисунок S2). Для оценки сходства между застыкованными позами и опорными структурами значение среднеквадратичного отклонения (RMSD) менее 2,0 Å широко рассматривается как критерий надежных результатов стыковки. Этот порог указывает на то, что прогнозируемая структура тесно согласуется с экспериментальными данными. В этом исследовании лиганды продемонстрировали среднеквадратичное значение 1,27 Å при сравнении референсной структуры с состыкованной позицией, как показано красным цветом на дополнительном рисунке S3. Это показало, что протокол стыковки достаточен для этой работы, и в результате все лиганды были состыкованы с использованием одних и тех же настроек. Изучая показатели докинга, представленные в таблице 2, Эфавиренц и Этравирин показали наиболее благоприятные показатели при -10,432 эВ и -9,647 эВ относительно оценки стыковки сокристаллизованного лиганда HBY561 (-9,242 эВ). На дополнительном рисунке S4 из дополнительного файла 1 показаны диаграммы взаимодействия лиганда между исходным белком ВИЧ-1 и кристаллическим лигандом, этравирином и эфавиренцом.

Водородные связи, укладка π-π и гидрофобные взаимодействия являются основными силами, способствующими связыванию. Конкретный случай водородной связи возник между HBY561 и обозначенным белком 1HQU, явно включающий аминокислотный остаток LYS101. Этот паттерн связывания отражал наблюдения, сделанные с лигандами Эфавиренц и Этравирин, как показано на рисунке 14.

Кроме того, гидрофобные взаимодействия были необходимы для связывания в нескольких местах белка с участием HBY561, Этравирина и Эфавиренца, в дополнение к межмолекулярным силам, водородным связям и укладке π-π. Между TYR318 и ароматическим кольцом в Эфавиренце наблюдалось накопление π-π. Как водородные связи, так и укладка π-π были необходимы для поддержания связывающих связей между лигандами и белком. Диаграммы взаимодействия лигандов HBY_561, невирапина, доравирина, эфавиренца и этравирина представлены в дополнительном файле 1-SupplementalFigureS5.

Эти межмолекулярные силы влияют на белок-лигандные взаимодействия и имеют решающее значение для разработки лекарственных препаратов, снижающих УПП при ВИЧ-1. Их роль в повышении аффинности связывания, специфичности и механизма действия помогает в разработке препаратов, которые могут эффективно нацеливаться на вирус и подавлять его, тем самым решая растущую обеспокоенность по поводу устойчивости к противомикробным препаратам в контексте лечения ВИЧ-1.

Подготовка набора данных 2D-QSAR

В этапах обучения и тестирования участвовало 94 соединения. Эти соединения были разделены на четыре класса, каждый из которых представлял собой лиганды, связанные с конкретным тестируемым белком. В процессе обучения использовался рабочий процесс KNIME AutoQSAR с активностью, HOMO и LUMO были выбраны в качестве трех дескрипторов для данного исследования.

Генерация 2D-QSAR

Значения активности всех 94 молекул были определены с помощью экспериментальных данных (Дополнительная таблица S1). Результаты, полученные с помощью модели QSAR, можно найти в таблице 3. Для моделирования QSAR были использованы соединения класса 1 из Дополнительной таблицы S2 , показывающие добавленные Ar-группы и их соответствующие значения активности. Результаты по четырем классам показывают, что был достигнут наивысший балл 0,8223, R² 0,815 и Q ² 0,8182, что соответствует классу 1. Это согласуется с предыдущими критериями стремления к R² близко к 1 и Q² больше 0,7⁴⁶. Следовательно, мы выбрали класс 1 для обучения нашей модели QSAR. В то время как модели для классов 3 и 4 продемонстрировали отличное значение корреляции R² в размере 0,8172 и 0,6673 соответственно, они не соответствовали показателям класса 1.

Для дальнейшей валидации устойчивости предложенной модели QSAR была проведена взаимная корреляция в соответствии с критерием, согласно которому разница между баллом Q² 0,8223 и R² должна быть меньше или равна 0,3⁴⁷. Предложенная нами модель для класса 1 имеет разницу 0,0038. Точечная диаграмма, показывающая наблюдаемую активность в сравнении с прогнозируемой активностью, представлена на рисунке 15.

Энергетическая щель HOMO-LUMO

Определение энергетической щели между самой низкой незанятой молекулярной орбиталью и самой высокой занятой молекулярной орбиталью, широко известной как энергетическая щель HOMO-LUMO, играет решающую роль в характеристике химической реакционной способности и кинетической стабильности молекулы в контексте шести соединений ННИОТ. Пограничные молекулярные орбитали играют ключевую роль в облегчении взаимодействия по переносу заряда с сайтом связывания белка ВИЧ. Подтверждение энергетического минимума было обеспечено путем изучения вибрационных частот и подтверждения отсутствия отрицательных или мнимых частот; впоследствии были получены значения HOMO и LUMO для каждого энергетического минимума. Более высокое значение HOMO означает способность молекулы быть донором электронов, в то время как более низкое значение предполагает, что она действует как слабый акцептор электронов. На дополнительном рисунке S6 представлены HOMO_LUMO энергетические промежутки для шести оптимизированных ННИОТ. Кроме того, уменьшенный энергетический разрыв между энергетическими уровнями HOMO и LUMO сильно влияет на межмолекулярные взаимодействия по переносу заряда, которые происходят между исследуемыми молекулами из-за сильной электроннопринимающей способности и биологической активности молекул⁴⁸.

Тенденция значений энергетического разрыва, представленная в таблице 4, следует в порядке убывания: Эфавиренц > Этравирин > HBY-561 > Невирапин > Делавирдин > Доравирин > Рилпивирин. Значительный энергетический разрыв, наблюдаемый у эфавиренца и этравирина, означает, что анализ докинговых показателей показывает корреляцию между биологической активностью и разрывом HOMO-LUMO. Примечательно, что противовирусный потенциал увеличивается при больших значениях разрыва между HOMO-LUMO. Это свидетельствует не только о стабильности соединений, но и об их способности образовывать устойчивые взаимодействия с рецептором. Разрыв между HOMO-LUMO играет важную роль в понимании биологической активности молекул, особенно в контексте разработки лекарств от ВИЧ-1.

Перечисление

Для перечисления виртуальных библиотек созданы различные инструменты. К инструментам, используемым для перечисления, относится Schrödinger. Он основан на методе скачкообразной привязки ядра, при котором библиотеки создаются путем подстановки одного или нескольких вложений на структуре ядра фрагментами из соединений реагентов⁴⁹. Инструмент перечисления в Maestro v13.1 использовался для добавления пользовательских боковых групп или атомов в каждую из шести NNRTI. Новые соединения также использовались для прогнозирования активности. Наблюдалось улучшение ожидаемых значений активности перечисленных молекул по сравнению с первоначально оптимизированными молекулами ННИОТ, как видно из таблицы 5.

Улучшение, показанное в значениях активности перечисленных лигандов, было обусловлено выполненным процессом перечисления, поскольку добавленная пользовательская R-группа влияла на силы взаимодействия нового предложенного соединения и исходного белка. Перечисленные соединения были подготовлены для квантовой механики путем оптимизации этих молекул и вычисления их колебательных частот. Их энергетические разрывы были рассчитаны и сравнены с энергетическими разрывами ННИОТ. Общее наблюдение, как показано в таблице 6, показывает, что перечисленные соединения более стабильны, чем их оптимизированные аналоги.

В таблице 6 было замечено, что энергетическая щель перечисленных соединений по сравнению с оптимизированными соединениями показала аналогичную тенденцию. Это свидетельствует о том, что химические свойства перечисленных молекул остались неизменными, независимо от какого-либо конформационного вращения. Таким образом, они смогли поддерживать важные межмолекулярные силы с аминокислотными остатками белка.

Перед выполнением процесса перечисления для ННИОТ, как описано в разделе 6 протокола, наблюдаемые выходные результаты имели свои первоначальные оценки стыковки из процесса перечисления, представленные в таблице 7 в столбце перечисляемых баллов стыковки. Как поясняется в разделе 4 протокола, процесс молекулярного докинга был проведен для валидации предложенной оценки докинга для перечисленных соединений. Можно было наблюдать, что после перестыковки перечисленных соединений новые показатели докинга улучшились, как показано в столбце «перестыкованные перечисленные лиганды». Повторно докованные баллы для перечисленных соединений сравнивались с доковыми баллами исходных ННИОТ, представленными в столбце «исходный балл стыковки» в таблице 7. Можно отметить, что для перечисленных соединений показатели стыковки для HBY_561, этравирина, эфавиренца и доравирина были лучше, чем у их эквивалентных оптимизированных соединений. Тем не менее, Делавирдин обладает тем же показателем докинга, что и перечисленный и оптимизированный Делавирдин.

Молекулярная динамика

HBY 561 образует три водородные связи с LYS101, высокоэлектроотрицательными атомами N и OH. Кристаллический лиганд, или третья молекула, образует две водородные связи одновременно с серой и водородом и третью водородную связь с GLU138. Важно отметить, что укладка π-π и гидрофобные взаимодействия вносят значительный вклад в задействованные межмолекулярные силы. Кроме того, наличие дополнительных водородных связей имеет решающее значение для молекулярной динамики, что особенно отражено в результирующих графиках среднеквадратичного отклонения (RMSD). Всего наблюдается, что эфавиренц образует три водородные связи с очень электроотрицательным атомом азота, атомом кислорода на другом неароматическом кольце и бензольным кольцом и TYR318 между лигандом с высоким электроотрицательным N в центральном кольце. Видна вторая водородная связь между N из кольца и OH и LY101. Этравирин имеет три водородные связи с LYS101. Доравирин образует водородную связь с GLU138. Невирапин имеет две водородные связи с LY101.

В этом случае взаимодействие аминокислотных остатков, общее для всех лигандов, представляет собой LYS101. Несмотря на то, что их структура различается, все они взаимодействуют с одним и тем же аминокислотным остатком. Моделирование МД проводили с параметрами, перечисленными в разделе 2.8 протокола, чтобы установить, насколько хорошо или плохо каждый лиганд (ННИОТ и перечисленные ННИОТ) связывается с активным центром 1HQU. Лигандное взаимодействие, изображенное на рисунке 16 , указывает на прочные водородные связи между аминокислотой LY101 белка и молекулами HBY 561, невирапина, эфавиренца и этравирина. Как видно из сравнения в таблице 7, эти сильные взаимодействия объясняют высокие показатели докинга каждого соединения.

Для оценки связывающей эффективности каждого лиганда, включая ННИОТ и перечисленные ННИОТ в активном центре 1HQU, проводили моделирование молекулярной динамики (МДС). В частности, были выбраны четыре перечисленных соединения, которые продемонстрировали лучшие показатели стыковки, чем исходные оптимизированные комбо. Эти выбранные соединения были подвергнуты MDS в качестве валидационного метода для изучения и наблюдения за реакцией каждой молекулы с белком HIV-1 в течение определенного периода времени, учитывая межатомные взаимодействия в присутствии лиганда.

Перед запуском MDS для недавно перечисленных гликанов было важно подтвердить пригодность протокола моделирования для нашей системы. Чтобы достичь этого, первым шагом был запуск MDS свободного белка 1HQU. В активном центре белка не присутствовал лиганд (рисунок 17A и дополнительный рисунок S7). До ~60 нс происходят значительные колебания структуры белка, вызывающие сдвиги Cα RMSD до 4,5 Å; после этого белок, по-видимому, стабилизируется с флуктуацией RMSD ~3,5 Å до 200 нс. Эта стабилизация убедила нас в том, что протокол MD будет подходящим для наших комплексов белок-лиганд, которые будут проанализированы в следующем разделе.

МДС 200 нс этравирина и перечисленного этравирина (рис. 17B, C) показала колебания среднеквадратичного отклонения (RMSD) этравирина, близкие к 5,0 Å, и равновесие 4,5 Å. Перечисленный этравирин показал колебания RMSD на 4,5 Å и равновесие на 3,5 Å. Эта стабилизация указывает на то, что перечисленный этравирин может быть потенциальным лигандом ННИОТ для лечения ВИЧ/СПИДа. Траектория с RMSD менее 5 Å означает сильный эффект связывания между белком активного центра и лигандом. Это наблюдение было поддержано в отношении всех ранее упомянутых соединений, за исключением невирапина и доравирина, среди перечисленных соединений (Дополнительный файл 1: Дополнительный рисунок S8, Дополнительный рисунок S9, Дополнительный рисунок S10 и Дополнительный рисунок S11).

На рисунках 18 и 19 дополнительно проанализировано связывание между этравирином, перечисленным этравирином, и белком. Анализируемые данные включают гистограмму контактов Interaction, лиганд-белок и белок-лиганд. Гистограмма контактов взаимодействия для каждого соответствующего лиганда, связанного с белком, напрямую связана с соответствующими силами взаимодействия между остатками аминокислоты белка и лигандом. Высокая концентрация LYS101 очень отчетлива для Этравирина и перечисленного Этравирина, и была отмечена видимая толстая оранжевая полоса. Слабо различимая светло-оранжевая полоса, расположенная на нижней оконечности перечисленной таблицы этравирина, наблюдалась в корреляции с TYR181. Это соответствие указывает на существование двух межмолекулярных сил притяжения между GLU138. Это положительное наблюдение за лигандами и их перечисленными формами сравнивали с целью анализа лучшего лиганда в качестве потенциального соединения ННИОТ. Исходя из представленных результатов, перечисленный этравирин обладает потенциалом для использования в лечении ВИЧ/СПИДа.

Молекулярная механика с обобщенными расчетами Борна и площади поверхности (MM-GBSA)

В этом исследовании основным источником энергетического вклада в связывающую свободную энергию, ΔG_{связывание}, был вклад ван-дер-ваальсского взаимодействия, ΔG_VdW. Перечисленный этравирин имеет более высокий ΔG_VdW -66,146 ккал/моль, чем его известный аналог ННИОТ с ΔG_VdW -64,669 ккал/моль. Более высокое значение_Hbond ΔG -2,541 ккал/моль перечисленного этравирина указывает на значительный вклад водородных сил притяжения между лигандом и белком. Вклад ΔГ_Кулона и ΔG_{ковалента} для перечисленного этравирина (-17,976 и 2,807 ккал/моль) был намного выше, чем у известного аналога ННИОТ, который имел -11,196 и 2,491 соответственно.

Наблюдаемые результаты при связывании Этравирина и перечисленного Этравирина с белком 1HQU в некоторой степени согласуются. Было обнаружено, что перечисленный этравирин лучше, чем его аналог, этравирин, из-за двух дополнительных водородных связей. Исследование также показало, что перечисленный этравирин является предпочтительным для связывания с идентифицированным карманом. Более отрицательное_{связывание} ΔG (-89,684 ккал/моль) для перечисленного Этравирина по сравнению с Этравирином (-80,551 ккал/моль) показывает, что перечисленный Этравирин является хорошим ингибитором ВИЧ-1 РТ.

Рисунок 1: Химическая структура шести одобренных Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США ненуклеотидных ингибиторов обратной транскриптазы для вируса иммунодефицита человека-1. NVP = Невирапин; DLV = делавирдин; EFV = Efavirenz; ETV = Этравирин; РПВ = рилпивирин; DOR = Доравирин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Открытие приложения Maestro Schrodinger в Windows на локальном компьютере. (A) Переход к приложению Maestro Schrodinger на локальном компьютере. (B) Как открыть и запустить приложение Maestro Schrodinger на локальном компьютере. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Импорт структуры файла PDB с локального компьютера в окно проекта в Schrödinger. (A) Функция импорта структуры в Maestro Schrodinger. (B) Текстовое поле PDB ID. (C) Загруженный PDB-файл на локальном компьютере. (D) Кнопка импорта, позволяющая импортировать вставленный файл PDB ID. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Структура PDB-файла, импортированного в окно проекта Schrodinger. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Рабочий процесс приготовления белка. (A) Интерфейс поиска по процессу приготовления белка. (B) Сохранение имени файла задания и запуск процесса приготовления белка. (C) Окно мониторинга для выполняемых заданий. (D) Расщепление лиганда на отдельные компоненты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 6: Процесс подготовки лиганда. (А) Импорт структур с локального компьютера в окно проекта Белкового препарата Шрёдингера. (Б) Поиск процесса получения лиганда. (C) Окно процесса получения лиганда. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 7: Рабочий процесс геометрии и оптимизации. (A) Окно меню GaussView для оптимизации геометрии. (b) Доступные типы заданий на вкладке "Расчет" в GaussView. (C) Опции доступны на вкладке Link0 в GaussView. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 8: Рабочий процесс генерации грайдов и молекулярного докинга. (A) Интерфейс рабочего процесса генерации рецепторной решетки. (B) Всплывающее уведомление о выборе атома в лиганде. (C) Расширенные настройки рецептора. (D) Уведомление о завершении работы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 9: Стыковка глиссирующего лиганда. (A) Интерфейс для поиска стыковки глигенда. (b) Интерфейс стыковки Ligand. (C) Точные настройки для Glide Docking. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 10: Рабочий процесс подготовки KNIME QSAR. (A) Поиск узла AutoQSAR на веб-странице сообщества KNIME. (B) Кнопка «Загрузить» для получения узла AutoQSAR KNIME. (C) Импорт загруженного рабочего процесса AutoQSAR KNIME. (D) Конфигурационные настройки для лигандов при построении модели QSAR. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 11: Перечисление лигандов с помощью Ligand Designer в Maestro Schrodinger. (A) Поиск опций Ligand Designer в Schrodinger. (B) Перечень рабочих процессов для проведения процесса перечисления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 12: Рабочий процесс генерации HOMO-LUMO. (A) Чтобы получить доступ к опциям молекулярного редактора на вкладке «Инструменты» в GaussView. (B) Загрузка существующего файла Chk или FChk для генерации пограничных молекулярных орбиталей. (C) Иллюстрация пограничных орбиталей HOMO и LUMO в GaussView. (D) Визуализируйте окно для отображения пограничных орбиталей HOMO и LUMO. (E) Сохранение пограничных орбиталей HOMO и LUMO. (f) Интерфейс формата отображения в GaussView. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 13: Процесс подготовки, настройки, подготовки и выполнения молекулярной динамики. (A) Desmond System Builder: Варианты решения для определения жестких моделей воды. (B) Опции границ Desmond System Builder для определения формы коробки. (c) Desmond System Builder: метод вычисления размера коробки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 14: Диаграммы взаимодействия лигандов между 1HQU и 3 верхними докованными лигандами. Силы взаимодействия между белком (1HQU) и (А) кристаллическим лигандом (HBY561), (В) эфавиренцем и (С) этравирином. Эти силы влияют на белок-лигандные взаимодействия и имеют решающее значение для разработки лекарственных препаратов, снижающих устойчивость к противомикробным препаратам при ВИЧ-1. Их роль в повышении аффинности связывания, специфичности и механизма действия помогает в разработке препаратов, которые могут эффективно нацеливаться на вирус и подавлять его, тем самым решая растущую обеспокоенность по поводу устойчивости к противомикробным препаратам в контексте лечения ВИЧ-1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 15: Точечная диаграмма показывает наблюдаемую активность в сравнении с прогнозируемой активностью для класса 1 модели QSAR. На графике представлено соответствие между классом 1 в качестве обучающего набора и соединениями ННИОТ в качестве тестового набора для получения значения прогностической активности. Сокращения: ННИОТ = ненуклеотидные ингибиторы обратной транскриптазы; QSAR = количественная связь между структурой и активностью. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 16: Диаграммы взаимодействия лигандов. Силы взаимодействия между белком и (А) перечисленным кристаллическим лигандом HBY_561, (В) перечисленным невирапином, (С) перечисленным Доравирином, (Г) перечисленным Эфавиренцем и (Е) перечисленным Этравирином. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 17: Диаграмма молекулярного моделирования взаимодействия свободного белка этравирина и перечисленного этравирина. (А) Диаграмма молекулярной динамики взаимодействия свободного белка. (B) Диаграмма молекулярной динамики взаимодействия этравирина. (C) Диаграмма молекулярно-динамического взаимодействия перечисленного этравирина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 18: Гистограмма контактов взаимодействия между этравирином и белком. (a) Временная шкала контактов белок-лиганд для этравирина. (B) Временная шкала взаимодействий белок-лиганд с течением времени, включая H-связи, гидрофобные, ионные контакты и контакты с водными мостами. (C) Схема, показывающая детально показанные взаимодействия между атомами лиганда и белковыми остатками. Отображаются только взаимодействия, происходящие более чем в 30% от времени моделирования (от 0,00 до 200 нс). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 19: Гистограмма контактов взаимодействия между перечисленным этравирином и белком. (A) Хронология контактов белок-лиганд для перечисленного этравирина. (B) Временная шкала взаимодействий белок-лиганд с течением времени, включая H-связи, гидрофобные, ионные контакты и контакты с водными мостами. (C) Схема, показывающая детально показанные взаимодействия между атомами лиганда и белковыми остатками. Отображаются только взаимодействия, происходящие более чем в 30% от времени моделирования (от 0,00 до 200 нс). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Класс	Белковая мишень	Ассортимент компаундов	Общее количество выбранных соединений
1	NL4-3 дикий тип ВИЧ-1	(8a1-8e5 – EC50 (нМ)а)	25
2	IIIB WT ВИЧ-1	13а1-13д6 - ЕС50 (нМ)а	23
3	RES056 Устойчивый к ННИОТ штамм	13а1-13д6 - ЕС50 (нМ)а	23
4	Штамм ROD HIV-2	13а1-13д6 - ЕС50 (нМ)а	23
Общее количество соединений, выбранных для моделирования QSAR			94

Таблица 1: Краткое изложение критериев классификации соединений для моделирования QSAR. Набор данных из 94 дигидрофуро[3,4-d] пиримидиновых соединений был синтезирован Кангом и коллегами⁵⁰ для нацеливания на различные штаммы ВИЧ, а именно: NL4-3 дикого типа ВИЧ-1, IIIB WT HIV-1, RES056 NNRTI-резистентный штамм и штамм ROD HIV-2. Эти производные пиримидина были сгруппированы в четыре класса в соответствии с их целевым белком для подготовки к выполнению нашей тренировки QSAR. В таблице показано, как эти молекулы были сгруппированы в четыре класса в соответствии с их экспериментальными значениями EC₅₀ , которые представляют собой потенцию препарата, операционализированную как концентрация, при которой лекарство оказывает 50% своего максимального эффекта. Сокращения: ННИОТ = ненуклеотидные ингибиторы обратной транскриптазы; QSAR = количественная связь между структурой и активностью.

Название белка	Лиганд	Оценка стыковки
1HQU	Эфавиренц	-10.432
	Этравирин	-9.647
	HBY_561	-9.242
	Доравирин	-9.04
	Невирапин	-8.825
	Рилпивирин	-7.722
	Делавирдин	-6.519

Таблица 2: Показатели докинга шести оптимизированных ННИОТ и белка ВИЧ-1. Оценки стыковки относятся к шести исследуемым ННИОТ. Более отрицательный показатель указывает на хорошую эффективность связывания между лигандом и белком. Эфавиренц и этравирин показали наиболее благоприятные показатели при -10,432 эВ и -9,647 эВ относительно оценки стыковки сокристаллизованного лиганда HBY561 (-9,242). Потенциальными лигандами были лиганды с более отрицательным показателем докинга, менее -9,242 эВ.

Класс лекарственных средств	Соответствие активности на уровне 85 процентов	Столбец1	Столбец2	Столбец3	Столбец4	Столбец5
	Счёт	СД	Р2	RMSE	В2	Q2 МВт (нулевая гипотеза)
1	0.8223	0.3268	0.815	0.2479	0.8185	0.1462
2	0.5671	0.2996	0.5067	0.1996	0.2264	0.4736
3	0.8172	0.3692	0.8114	0.1536	0.9065	-1.1532
4	0.6673	0.367	0.6436	0.1709	0.8852	0.1445
*SD – стандартное отклонение,
R2 – корреляция обучающей выборки между фактическими и прогнозируемыми значениями активности,
Q2 – корреляция фактической и прогнозируемой активности тестового набора.
RMSE - среднеквадратичная ошибка

Таблица 3: Статистические параметры модели 2D-QSAR. В таблице представлены стандартное отклонение, корреляция обучающего набора между фактическими и прогнозируемыми значениями активности (R²) и высокий показатель корреляции фактической и прогнозируемой активности тестового набора для каждого класса (Q²). Более высокий балл (R²) представляет класс.

ЛИГАНД	HOMO	ЛЮМО	E gap (E gap)
Эфавиренц	-0.2242	-0.06943	0.15477
Этравирин	-0.21408	-0.08141	0.13267
Невирапин	-0.20602	-0.07759	0.12843
HBY_561	-0.19687	-0.0748	0.12207
Делавирдин	-0.19651	-0.07958	0.11693
Доравирин	-0.22413	-0.10916	0.11497
Рилпивирин	-0.21343	-0.11216	0.10127

Таблица 4: Энергетическая щель HOMO-LUMO оптимизированных ННИОТ. В таблице представлены результаты работы с энергетическими щелями HOMO-LUMO, полученные после оптимизации шести ННИОТ.

Лиганд	Оптимизированные лиганды	Перечисленные лиганды
Доравирин	7.229	7.374
Рилпивирин	7.302	7.279
Этравирин	7.229	7.374
Эфавиренц	7.229	7.323
Делавирдин	7.302	7.302
Невирапин	7.229	6.988
HBY_561	7.229	7.323

Таблица 5: Прогнозируемые оценки активности оптимизированных ННИОТ в сравнении с соответствующими перечисленными ННИОТ. В таблице сравниваются оценки прогностической активности между оптимизированными и перечисленными лигандами. Чем выше показатели активности, тем лучше соединение в качестве потенциального ведущего препарата.

ЛИГАНД	Энергетический разрыв после оптимизации	Энергетический разрыв после перечисления	Разница между оптимизированными и перечисленными составами
Доравирин	0.115	0.126	0.011
Рилпивирин	0.101	0.127	0.030
Этравирин	0.133	0.126	0.010
Эфавиренц	0.155	0.126	0.030
Делавирдин	0.117	0.126	0.010
Невирапин	0.128	0.126	0.002
HBY_561	0.122	0.126	0.004

Таблица 6: Сравнение прогнозируемых энергетических щелей перечисленных ННИОТ и исходной энергетической щели оптимизированных ННИОТ .В таблице приведено сравнение энергетической щели HOMO-LUMO между оптимизированным и перечисленным лигандами и разницы энергий между ними.

Перечисленный лиганд	Правило 5 свойств	Столбец1	Столбец2	Столбец3	Столбец4	Столбец5	Добавлена боковая группа	Перечисленная оценка стыковки	Оригинальная партитура стыковки	Перестыкованные перечисленные лиганды
	АлогП	ПСА	ГБД	HBA	МВТ	МПО
Доравирин	2.4	125.9	2	8	441.8	0.49	Гидроксил	-8.894	-9.04	-9.739
Этравирин	4.4	140.9	3	8	451.3	0.37	Гидроксил	-10.258	-9.647	-10.517
Эфавиренц	3.7	64.3	2	3	330.7	0.75	Амин	-10.284	-10.432	-11.025
Невирапин	2.6	58.1	1	4	284.3	0.73	Фторид	-9.112	-8.825	-9.445
HBY_561	2.4	93.9	2	6	358.5	0.66	Амид	-9.596	-9.242	-10.1
AlogP - (вычисленный логарифм коэффициента разделения октанол-вода).
PSA - (Полярная площадь поверхности)
HBD - (Доноры водородных облигаций)
HBA - (Акцепторы водородных связей)
MW - (молекулярная масса)
MPO - (многопараметрическая оптимизация)

Таблица 7: Сравнение баллов стыковки между исходным и перечисленным ННИОТ. В таблице показано сравнение перечисленных оценок стыковки, которые представляют собой баллы стыковки после перечисления. Исходные оценки стыковки — это оценки стыковки оптимизированных ННИОТ. Перестыкованные перечисленные баллы представляют собой доковочные баллы перечисленных лигандов. Поскольку процесс перечисления выдает предиктивную оценку стыковки, лиганды должны быть повторно докованы тем же методом, что и оптимизированные лиганды. Добавляемые группы – это те, которые добавляются к лигандам в процессе перечисления.

Лиганд	ΔGсвязывать	ΔGКулон	ΔGковалентный	ΔGHbond	ΔGЛипо	Упаковка ΔG	ΔGSolv	ΔGVdW
Этравирин	-80.551	-11.196	2.491	-1.509	-27.447	-4.826	26.605	-64.669
Перечисленный этравирин	-89.684	-17.976	2.807	-2.541	-27.652	-4.211	26.034	-66.146
ХБИ561	-79.664	-12.261	0.994	-0.521	-26.052	-1.278	18.624	-59.169
Перечисленный HBY561	-82.719	-13.443	1.534	-0.603	-27.053	-1.210	20.600	-62.544
Эфавиренц	-71.372	-12.984	1.151	-0.834	-25.353	-1.379	14.472	-46.44
Enumerated Efavirenz	-79.125	-18.602	1.753	-2.159	-25.409	-1.198	16.619	-50.129

Таблица 8: РеXts MMGBSA выбранных лигандов на 1HQU. В таблице представлены расчеты молекулярной механики с обобщенными расчетами Борна и площади поверхности, которые показывают среднюю свободную энергию связи (ΔGbind) комплекса белок-лиганд. В таблице показано сравнение между исходно оптимизированными лигандами, которые показывают хорошие показатели стыковки относительно кристаллических лигандов, и их перечисленными аналогами. Выбранное соединение с более высокой оценкой докинга и хорошей молекулярно-динамической флуктуацией RMSD при балансировке также должно удовлетворять расчетам MMGBSA, показывая наиболее отрицательнуюсвободную энергию связывания (ΔG_{связывания}). В этом случае перечисленный Этравирин удовлетворяет обоим расчетным параметрам.

Дополнительный файл 1: Другие rXt, полученные в этом исследовании. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Discussion

Метод DFT²⁶ был использован для анализа электронных свойств и стабильности различных производных пиримидина, чего нельзя сказать об аналогичных исследованиях. Использование DFT позволяет глубже понять молекулярные взаимодействия на квантовом уровне, улучшая процесс проектирования ННИОТ. В этом исследовании мы выбрали шесть ННИОТ с неизвестными значениями активности. Мы извлекли их молекулярные структуры из базы данных PubChem и провели геометрическую оптимизацию с использованием функционального набора Minnesota 15 Local (MN15-L)³² и базисного набора 6-31++G (d,p)² в программном пакете квантовой механики Gaussian 16 revision C01³³ . Для настройки входных файлов моделирования мы использовали GaussView 6.0²⁶. Затем квантовые структуры были пристыкованы к активному центру белка HIV-1.

В исследовании использовался подход QSAR⁵¹, который предназначен для прогнозирования биологической активности ННИОТ на основе их химической структуры. Эта модель создана с использованием набора данных из 94 производных дигидрофуро[3,4-d] пиримидина, что позволяет идентифицировать ключевые функциональные группы, влияющие на противовирусную активность. Внедрение надежной модели QSAR является важным достижением, поскольку она помогает фильтровать соединения на ранних этапах процесса разработки, повышая эффективность разработки лекарств.

Была рассмотрена прогнозируемая активность новых соединений, а также подтверждены баллы стыковки. Усовершенствованный метод молекулярного докинга исследовал связывающие взаимодействия между ННИОТ и ферментом обратной транскриптазой ВИЧ-1. Это было дополнено моделированием молекулярной динамики в течение длительного периода времени (200 нс), что дало представление о стабильности и поведении комплексов лекарство-белок в физиологических условиях. Молекулярная динамика⁵² подтвердила результаты исследований докинга. Моделируя поведение комплексов лекарство-фермент с течением времени, мы можем оценить динамическую стабильность и взаимодействия, которые могут быть не зафиксированы^{в исследованиях} статического докинга. Такой подход обеспечивает более реалистичную оценку того, как ННИОТ могут функционировать в биологических системах. Моделирование показало, что этравирин вызывает среднеквадратичные колебания примерно на 4,5 Å, в то время как перечисленный этравирин дает среднеквадратичные колебания на уровне 3,5 Å. Было обнаружено различное сходство между Этравирином и перечисленным Этравирином, при этом перечисленное соединение обладает усиленными аминокислотными взаимодействиями в активном центре белка. Более низкий RMSD, улучшенное взаимодействие аминокислот и высокая свободная энергия связывания позволяют предположить, что перечисленный этравирин может служить жизнеспособной альтернативой для лечения ВИЧ/СПИДа.

Использование методов перечисления⁵⁴ для генерации стереоизомеров и выполнения изостерного сканирования является заслуживающим внимания аспектом данного исследования. Этот метод позволяет исследователям исследовать более широкое химическое пространство для потенциальных ННИОТ, систематически модифицируя существующие структуры, что может привести к открытию соединений с повышенной эффективностью и сниженной резистентностью.

Исследование объединяет анализ HOMO-LUMO, полученный на основе квантово-механических расчетов, для оценки реакционной способности и стабильности соединений. Этот аспект часто упускается из виду в подобных исследованиях55, однако он дает ценную информацию о свойствах электроники, которые могут влиять на биологическую активность

Использование метода MMGBSA в данном исследовании для оценки свободных энергий связывания перечисленных ННИОТ в качестве потенциальных ингибиторов обратной транскриптазы (ОТ) ВИЧ-1 представляет собой новый аспект, который повышает значимость и потенциальное влияние этой работы на разработку лечения ВИЧ.

Применение MMGBSA в данном исследовании обеспечивает более точную оценку свободных энергий связи для перечисленного этравирина по сравнению с его аналогом. Рассчитывая значения свободной энергии связывания, в исследовании количественно оценивается аффинность связывания перечисленного этравирина, которая была значительно выше (9,133 ккал/моль), чем у стандартного этравирина. Такой уровень детализации в расчетах энергии связывания позволяет получить более детальное представление о том, как структурные модификации могут влиять на эффективность ННИОТ, чего часто не хватает в аналогичных исследованиях, которые могут основываться исключительно на качественных оценках.

Указанное_{ковалентное} значение ΔG в размере 1,477 ккал/моль также указывает на силу взаимодействия для перечисленного соединения. Сравнительный подход является инновационным, поскольку он не только определяет перспективного кандидата, но и помещает его в более широкий контекст существующих методов лечения, обеспечивая ориентир для будущего развития ННИОТ.

Сравнение, приведенное в таблице 8 , также показывает, что перечисленный этравирин может быть потенциальным соединением для использования в качестве альтернативного АРТ, поскольку его свободная энергия связывания (_{связывание} ΔG) является самой высокой по сравнению с этравирином, HBY56, этравирином и их перечисленными аналогами.

Результаты нашего исследования могут оказать существенное влияние на разработку новых терапевтических препаратов для лечения ВИЧ-инфекции. Кроме того, такой подход может позволить выявить наиболее перспективного кандидата на анти-ВИЧ. Эти результаты могут проложить путь к рациональному дизайну новых ННИОТ ВИЧ-1.

Включение MMGBSA в сочетании с другими вычислительными методами (такими как молекулярный докинг, моделирование QSAR и моделирование молекулярной динамики) повышает надежность полученных результатов. Этот интегрированный подход позволяет проводить всестороннюю оценку соединений, от структурной оптимизации до динамического поведения в биологическом контексте. Такая методология является относительно новой в исследованиях ННИОТ, где исследования часто сосредоточены на изолированных методах без целостного представления о процессе разработки лекарств. Исследование подчеркивает несколько многообещающих результатов и более глубокое понимание молекулярных взаимодействий между ННИОТ и ферментом обратной транскриптазой, что может помочь в разработке будущих лекарств.

В то время как другие исследования в области разработки ННИОТ часто сосредоточены на одиночных вычислительных методах или базовом докинговом анализе, это исследование выделяется тем, что сочетает квантово-химические расчеты с молекулярной динамикой и моделированием QSAR, используя подход систематического перечисления, который расширяет потенциальное химическое пространство для ННИОТ, и используя всестороннюю систему in-silico . структура, которая не только предсказывает аффинность связывания, но и оценивает стабильность и динамику взаимодействия лекарственного препарата и фермента.

В целом, новизна этого исследования заключается в его многогранном подходе, использующем передовые вычислительные методы для решения проблем лекарственной устойчивости при лечении ВИЧ, тем самым прокладывая путь к разработке более эффективных ННИОТ. Полученные данные подчеркивают потенциал для разработки более эффективных ННИОТ, которые могут преодолеть ограничения современных методов лечения.

Некоторые будущие применения подхода, описанного в этом протоколе, включают следующее.

Интеграция с машинным обучением

Будущие исследования могут интегрировать MMGBSA с алгоритмами машинного обучения для повышения прогностической способности связывания оценок свободной энергии. Обучая модели на больших наборах данных, исследователи могут повысить точность и надежность прогнозов, что позволит лучше идентифицировать перспективных кандидатов в ННИОТ.

Применение в дизайне лекарств на основе фрагментов

MMGBSA может быть эффективно использована в разработке лекарств на основе фрагментов, где небольшие молекулярные фрагменты оптимизируются для улучшения аффинности связывания. Такой подход может привести к выявлению новых ННИОТ с повышенной активностью и селективностью в отношении ВИЧ-1.

Изучение механизмов лекарственной устойчивости

Методика может быть применена для изучения связывающих взаимодействий ННИОТ с мутантными штаммами ВИЧ-1. Сравнивая связывающие свободные энергии ННИОТ с дикими и устойчивыми вариантами, исследователи могут получить представление о механизмах лекарственной устойчивости и получить информацию для разработки ингибиторов следующего поколения.

Оценка фармакокинетических свойств

MMGBSA также может быть использован для оценки фармакокинетических свойств ННИОТ, таких как растворимость и проницаемость. Понимая, как эти свойства коррелируют со сродством связывания, исследователи могут оптимизировать кандидаты в лекарства для улучшения терапевтических профилей.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
GaussView	GaussView		V6.1.1
KNIME	KNIME		V4.7.1
Schrodinger Maestro V13.6	SCHRODINGER INC.		Год выпуска лицензии 2023-2