Методическая статья

Парная наноинъекция Cisterna Magna и лазерная спекл-контрастная визуализация для изучения регуляции мозгового кровотока in vivo

1.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67544

⸱

8 июля 2025 г.

 , 
1Department of Neuroscience, Center for Brain Immunology and Glia (BIG), University of Virginia School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Для изучения регуляции мозгового кровотока in vivo традиционные фармакологические методы являются инвазивными, часто повреждая череп, твердую мозговую оболочку и лептоменинги. В этой работе мы разработали минимально инвазивную технику, которая сочетает в себе интрацистернальную магну (ICM) под контролем наноинъектора с лазерной спекл-контрастной визуализацией, сохраняя целостность черепа и лептоменингов.

Аннотация

Регуляция мозгового кровотока (ОЦК) имеет решающее значение для поддержания когнитивных функций, но ее основные механизмы остаются плохо изученными. Исследование клеточных и молекулярных процессов, участвующих в этой регуляции, требует фармакологического подхода, который позволяет точно доставлять лекарственные препараты в спинномозговую жидкость (СМЖ), обеспечивая при этом мониторинг динамики мозгового кровотока в режиме реального времени. В данной работе мы представляем метод изучения регуляции мозгового кровотока in vivo путем комбинации интрацистернальной инъекции magna (ICM) на основе наноинъекторов с лазерной спекл-контрастной визуализацией.

Технология инъекции ICM на основе нанолитровых инъекторов позволяет точно доставлять лекарство в динамическом диапазоне от нл/мин до мкл/мин. В наших экспериментах такой подход позволил значительно уменьшить объем инъекции с традиционных 5-10 мкл до всего 1,5 мкл, тем самым сохранив нормальное внутричерепное давление. В сочетании с лазерной спекл-контрастной визуализацией мы смогли контролировать динамику мозгового кровотока (КБК) в режиме реального времени до, во время и после инъекций ВКМ.

Используя этот метод, мы оценили изменения КБФ в ответ на инъекцию ВКМ трех различных вазодилататоров: (S)-3,5-дигидроксифенилглицин (DHPG), ацетилхолин и аденозин. В то время как все три сосудорасширяющих средства увеличивали базальный КБФ, они оказывали различное влияние на динамику КБФ. Например, воздействие аденозина было преходящим, в то время как DHPG и ацетилхолин вызывали долгосрочные эффекты. Обладая своими уникальными преимуществами, этот метод представляет собой ценное дополнение к набору инструментов для изучения регуляции CBF у грызунов in vivo.

Введение

Церебральный кровоток (КБН) обеспечивает непрерывное снабжение мозга кислородом и питательными веществами при одновременном удалении метаболических отходов, что необходимо для поддержания нормальных когнитивных функций 1,2. В гомеостатических условиях НБФ остается относительно стабильным, несмотря на колебания перфузионного давления, процесс, известный как ауторегуляция 3,4,5. В дополнение к ауторегуляции, локальная CBF может динамически корректироваться в ответ на активность близлежащих нейронов, явление, называемое нейроваскулярной связью 6,7. Как ауторегуляция, так и нейроваскулярная связь регулируются группой клеток — эндотелиальными клетками, мочными клетками, астроцитами, фибробластами и нейронами, известными как нейроваскулярные элементарные клетки 4,7. Тем не менее, клеточные и молекулярные механизмы, с помощью которых эти различные типы клеток координируются для модуляции CBF, до сих пор в значительной степени неизвестны.

Методы исследования регуляции КБФ обычно делятся на модели in vitro и in vivo. Исследования in vitro, часто с использованием острых срезов мозга, обычно сочетаются с электрофизиологическими или фармакологическими методами для изучения того, как нейроны и глиальные клетки регулируют расширение или сужение отдельных кровеносных сосудов 8,9,10. Основным ограничением моделей in vitro является то, что они не воспроизводят условия in vivo, в частности, отсутствие физиологического артериального давления. Модели in vivo для изучения регуляции НБФ варьируются от макромасштабных до микромасштабных подходов. Макромасштабные методы, такие как позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) и функциональная магнитно-резонансная томография (фМРТ), являются неинвазивными, но имеют низкое пространственное и временное разрешение 11,12,13,14.

Основным микромасштабным методом изучения КБТ in vivo является двухфотонная визуализация, обеспечивающая высокое пространственно-временное разрешение 9,15,16,17,18. Тем не менее, этот метод требует удаления черепа и твердой мозговой оболочки, а в сочетании с фармакологическими манипуляциями он становится еще более инвазивным, потенциально вызывая кровоизлияние, повреждая ткани мозга и изменяя внутричерепноедавление. Поэтому крайне важно иметь метод манипулирования и мониторинга КБФ in vivo, который соответствует определенным критериям: он должен быть неинвазивным (с сохранением целостности черепа, лептоменингов и сосудов), обеспечивать высокое пространственно-временное разрешение и позволять точные фармакологические манипуляции с КБФ. В этой статье мы представляем новый метод, который сочетает в себе интрацистернальную магну (ICM) на основе нанолитровых инъекторов и лазерную спекл-контрастную визуализацию, удовлетворяя всем этим требованиям.

Традиционные фармакологические подходы к изучению регуляции КБФ часто включают удаление черепа и мозговых оболочек для обнажения мозговой ткани для местной доставки лекарств. В отличие от этого, инъекция ICM позволяет избежать этого повреждения путем введения препаратов непосредственно в спинномозговую жидкость (СМЖ), позволяя им следовать естественному потоку СМЖ и, таким образом, лучше имитировать физиологические условия. Одна из проблем с инъекцией ICM заключается в том, что для нее обычно требуются большие объемы жидкости — часто 5 мкл или более у20 мышей. Учитывая, что общий объем спинномозговой жидкости у взрослых мышей составляет примерно 36 мкл, введение 5 мкл может увеличить внутричерепное давление и изменить динамику КБФ. Наша система наноинъекторов, в которой используются стеклянные пипетки, подает жидкость с точным контролем объема и скорости, не вызывая утечки спинномозговой жидкости в месте инъекции.

Уретан и альфа-хлоралоза используются в нашем исследовании, потому что они обеспечивают более стабильную физиологическую основу мозгового кровотока и сохраняют нейроваскулярное взаимодействие (ННВ) лучше, чем обычно используемые альтернативы, такие как изофлуран или кетамин/ксилазин (KX). Используя эту систему, мы протестировали три дифференциальных вазодилататора - (S)-3,5-дигидроксифенилглицин (DHPG), ацетилхолин и аденозин, и подтвердили, что он позволяет точно манипулировать и контролировать динамику КБФ in vivo.

Протокол

Этот протокол был одобрен Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию (IACUC) при Университете Вирджинии. Все эксперименты проводились в соответствии с Руководством Национального института здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных. Для экспериментов использовались шесть самцов мышей C57BL/6 в возрасте 10-14 недель. Хирургические процедуры описаны на рисунке 1А.

1. Подготовка к операции

  1. Расположите грелку на стереотаксической раме и разогрейте ее до 37 °C ~ 20 минут до операции. Приготовьте свежий уретан (750 мг/кг) и хлоралозу (50 мг/кг) в фосфатно-солевом буфере (PBS) для анестезии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для приготовления раствора альфа-хлоралозы в PBS мы нагревали раствор на водяной бане при температуре 40 °C и переворачивали его каждые 10-15 минут до полного растворения. Растворы уретана и альфа-хлоралозы перед использованием фильтровали с помощью шприцевого фильтра длиной 0,22 мкм.
  2. Перед операцией соберите все необходимые хирургические инструменты, включая ножницы, щипцы, микроиглодержатели, гемостатики, ватные палочки, салфетки и швы. Стерилизуйте инструменты путем автоклавирования (121 °C при 15 фунтах на квадратный дюйм в течение 60 минут).
  3. Подготовьте стеклянные капиллярные трубки (внешний диаметр 1,14 мм, внутренний диаметр 0,53 мм, длина 88,9 мм). Используйте стеклянный пуллер для создания стеклянных пипеток для инъекций21. Предпочтительное сопротивление пипетки составляет примерно 80 - 100 МОм. Простерилизуйте и храните стеклянные пипетки в чистом контейнере.
  4. Приготовьте наноинъектор с нужным объемом впрыска (25 нл - 4,5 мкл) и скоростью (6 нл/с - 644 нл/с).
  5. Готовят следующие растворы вазодилататоров в искусственной спинномозговой жидкости (КСФ): (S)-3,5-дигидроксифенилглицин (ДГПГ) в дозе 5 мМ, ацетилхолин в дозе 0,5 мМ и аденозин в дозе 10 мМ.
  6. Приготовьте мелоксикам (4,0 мг/кг) для облегчения боли во время операции. Введите мелоксикам подкожно мышам примерно за 30 минут до операции, чтобы обеспечить адекватную анальгезию.

2. Хирургическое вмешательство

  1. Взвесьте шесть мышей-самцов C57BL/6 (в возрасте 10-14 недель) и обезболите их с помощью внутрибрюшинной инъекции уретана (750 мг/кг) и хлоралозы (50 мг/кг). Поместите мышей в анестезиологическую камеру с 1% изофлураном для поддержания анестезии. Этот процесс занимает примерно от 40 минут до 1 часа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изофлуран может ускорить индукцию анестезии.
  2. Осторожно извлеките мышей из анестезиологической камеры и оцените глубину анестезии, подтвердив отсутствие рефлекса пальцев ног. С помощью ватного тампона нанесите крем для удаления волос на верхнюю часть черепа и заднюю часть шеи, чтобы удалить шерсть.
  3. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость, и повторно наносите по мере необходимости на протяжении всей процедуры. Регулярно контролируйте во время эксперимента и при необходимости вводите дополнительную мазь.
  4. Расположите мышь в положении лежа в стереотаксической раме, обеспечив достаточную вентиляцию медицинским воздухом со скоростью потока от 1 до 2 л/мин. Закрепите мышь ушными планками для правильной фиксации, затем аккуратно наклоните голову вниз, чтобы образовать угол 120° с корпусом, тем самым обнажив большую цистерну.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изофлуран используется исключительно для индукции анестезии, а не во время поддерживающей фазы.
  5. Продезинфицируйте операционную область, используя не менее трех чередующихся применений 70% спирта и хирургического скраба (например, хлоргексидина или повидон-йода), чтобы обеспечить надлежащую стерилизацию кожи.
  6. Найдите затылочный гребень под операционным микроскопом. Подтяните вышележащую кожу пинцетом и сделайте разрез по средней линии на 1 см. Контролируйте кровотечение с помощью ватных палочек.
  7. Обнажите мышцы шеи и аккуратно надрежьте и отделите их по средней линии с помощью щипцов. Используйте два изогнутых щипца, по одному в каждой руке, чтобы мягко втянуть мышцы и обнажить твердую мозговую оболочку, которая образует внешнюю границу большой цистерны.
  8. Отрегулируйте положение головы, наклонив ее вниз под углом 150° к телу для оптимального обнажения цистерны магна.
  9. Сделайте разрез 5 мм вдоль сагиттального шва, охватывающий обе точки лямбды и брегмы. С помощью двух изогнутых щипцов аккуратно оттяните кожу в сторону, и очистите поверхность черепа физиологическим раствором. Убедитесь, что на открытом черепе не осталось волос.
  10. После чистки нанесите слой геля для ультразвука толщиной ~1 мм на обнаженный череп с помощью ватных палочек для поддержания влажности в этой области. Поскольку гель для ультразвука может содержать пузырьки воздуха, убедитесь, что все пузырьки воздуха удалены перед визуализацией.
  11. Поместите мышь под объектив лазерной системы спекл-контрастной визуализации. Включите систему и сопутствующее программное обеспечение. Убедитесь, что мозг мыши центрирован в поле изображения, затем используйте функцию автофокусировки для достижения правильной фокусировки для изображения. При необходимости аккуратно удалите оставшиеся волоски или пузырьки воздуха из поля визуализации с помощью пинцета.

3. Настройка нановпрыска

  1. Закрепите насос на кронштейне стереотаксического манипулятора и подключите кабель к контроллеру. Включите контроллер и выберите целевой насос. На панели управления установите для параметра DIRECTION значение INFUSE. Установите скорость на 2 мкл в минуту и громкость на 4,5 мкл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Система нановпрыска состоит из двух основных компонентов: насоса впрыска и контроллера. Каждый контроллер может одновременно управлять двумя насосами. Для инъекции ICM мы используем только один насос.
  2. После завершения INFUSE достаньте одну стеклянную пипетку из контейнера и наполните ее бесцветным минеральным маслом без запаха с помощью гибкой иглы MicroFil плотностью 34 г или иглы аналогичного типа. Следите за тем, чтобы вся стеклянная пипетка была заполнена маслом.
  3. Открутите цангу насоса, вставьте стеклянную пипетку, а затем затяните цангу. Убедитесь, что внутри стеклянной пипетки нет пузырьков воздуха.
  4. Измените НАПРАВЛЕНИЕ в панели управления для WITHDRAW. Установите скорость на 2 μ л/мин и громкость на 4,5 μ л.
  5. Переместите стереотаксический рычаг, чтобы аккуратно ввести пипетку в приготовленный раствор и извлечь нужный объем.

4. Введение сосудорасширяющих средств в большую цистерну и мониторинг КБФ

  1. Убедитесь, что насос надежно закреплен на стереотаксическом манипуляторе. Отрегулируйте угол наклона стереотаксического манипулятора до 45° в передне-задней плоскости.
  2. С помощью изогнутого пинцета под микроскопом препарирования осторожно обнажите цистерну магна. Очистите эту область солевым раствором, чтобы удалить кровь. Используйте стереотаксический микроманипулятор для размещения стеклянной пипетки рядом с твердой мозговой оболочкой большой цистерны.
  3. Как только стеклянная пипетка коснется твердой мозговой оболочки, осторожно проведите ее, чтобы она прошла в центр большой цистерны, избегая проникновения в мозжечок или мозговое вещество. Перед выпуском пинцета убедитесь, что наконечник стеклянной пипетки вставлен на глубину 1-2 мм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Цифровая стереотаксическая рамка необходима для контроля глубины проникновения стеклянной пипетки в цистерну магна.
  4. Измените НАПРАВЛЕНИЕ на панели управления на INFUSE. Установите скорость впрыска на 300 нл/мин и объем на 1,5 μл.
  5. Запустите программное обеспечение для лазерной спекл-контрастной визуализации (LSCI) и отрегулируйте фокус для получения максимально четкого изображения кровеносных сосудов. Убедитесь, что в поле зрения нет волос или пузырьков воздуха.
  6. Установите интервал визуализации равным 5 с на панели управления LSCI. Запишите исходный CBF в течение примерно 10 минут, убедившись, что базовый уровень остается стабильным. Если в базовом уровне есть колебания, продолжайте запись в течение более длительного времени, пока не будет достигнута стабильность.
  7. Через 10 минут стабильной базовой записи инициируйте наноинжекцию и запишите время начала инжекции в системе регистрации LSCI. После завершения инъекции отметьте время окончания и продолжайте запись еще 20 минут или дольше. После завершения эксперимента мышам провели транскардиальную перфузию с помощью PBS и собрали ткани мозга для гистологического анализа.

Результаты

После завершения операции мы закрепили мышь в стереотаксической рамке с цифровым считыванием (рис. 1A,B). Для измерения мозгового кровотока (КБК) мы осторожно раздвинули кожу над черепом после разреза и нанесли прозрачный ультразвуковой гель для поддержания влаги на поверхности черепа (Рисунок 1C). Чтобы облегчить интрацистернальную инъекцию magna (ICM), мы рассекли мышцы шеи вокруг затылочного гребня, чтобы обнажить большую цистерну. После этого мы выводим целевой раствор с помощью стеклянной пипетки, и с помощью микроманипулятора направляем стеклянную пипетку на проникновение через мембраны цистерны магна на глубину 1-2 мм (рис. 1D,E). Стереотаксический рычаг был наклонен под углом 45° для облегчения введения.

Затем мы изучили динамические изменения КБФ в ответ на три различных вазодилататора: (S)-3,5-дигидроксифенилглицин (DHPG), ацетилхолин и аденозин 22,23,24,25. Первоначально мы регистрировали 10-минутный исходный уровень перед введением 1,5 мкл каждого сосудорасширяющего средства со скоростью 300 нл/мин в течение 5 минут. После инъекции мы записали дополнительные 20 минут данных. Наши результаты показали, что все три сосудорасширяющих средства увеличивают КБФ, хотя и с различной динамикой. ДГПГ индуцировал резкое увеличение КБФ с последующим постепенным снижением после инъекции (Рисунок 2A, B). Напротив, ацетилхолин вызывал постепенное увеличение КБФ в течение всего периода регистрации (Рисунок 2C,D). Аденозин также вызывал временное увеличение КБФ, которое возвращалось к исходному уровню примерно через 15-20 минут после инъекции (рис. 2E, F).

figure-results-1
Рисунок 1: Краткое описание хирургических процедур. (A) Пошаговые основные хирургические процедуры для наноинъекции + модель LSCI. (B) Схемы, показывающие комбинированную систему наноинжекции + LSCI. Наноинъектор устойчиво закреплен на стереотаксическом плече, а рычаг наклонен на 45° для облегчения проникновения атланто-затылочной мембраны в большую цистерну. (C) Вид сверху вниз на череп мыши под системой LSCI. Череп покрывается гелем для ультразвука. (D) Вид сзади, показывающий стеклянную пипетку, проникающую в цистерну. Стеклянная пипетка была наполнена синим цветом Эванса для облегчения визуализации. Для этого эксперимента используйте цифровую стереотаксическую рамку, чтобы можно было точно измерить расстояние проникновения. (E) Схемы, показывающие расположение стеклянного наконечника пипетки в цистерне. Голова мыши была наклонена на 30° , чтобы облегчить введение цистерны magna. Аббревиатура: LCSI = лазерная спекл-контрастная визуализация. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Увеличение мозгового кровотока после наноинъекции вазодилататоров. (A) Репрезентативные изображения, показывающие изменения мозгового кровотока до и после инъекции DHPG. Скорость крови имеет цветовую кодировку. Синий цвет обозначает низкую скорость, а красный — высокую скорость. (B) Кровоток в режиме реального времени в области, отмеченной красной линией, которая указывает на временное окно для инъекции DHPG. (C) Репрезентативные изображения, показывающие изменения мозгового кровотока до и после инъекции АЧ. Скорость крови имеет цветовую кодировку. Синим и красным обозначены низкие и высокие скорости соответственно. (D) Кровоток в реальном времени в области, отмеченной красной линией, которая указывает на временное окно для введения АЧ. (E) Репрезентативные изображения, показывающие изменения мозгового кровотока до и после инъекции аденозина. Скорость крови имеет цветовую кодировку. Синим и красным обозначены низкие и высокие скорости соответственно. (F) Кровоток в режиме реального времени в области, отмеченной красной линией, которая указывает временное окно для инъекции аденозина. Сокращения: DHPG = (S)-3,5-дигидроксифенилглицин; ACh = ацетилхолин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Мы представляем новый метод исследования регуляции мозгового кровотока (КБФ) in vivo путем сочетания точной наноинъекции цистерны magna с лазерной спекл-контрастной визуализацией (LSCI). Этот подход позволяет точно доставлять лекарственные препараты в спинномозговую жидкость (СМЖ), обеспечивая при этом мониторинг КБН в режиме реального времени, облегчая оценку реактивности сосудов головного мозга.

Фармакологические манипуляции и методы доставки лекарств имеют решающее значение для изучения КБФ и реактивности сосудов головного мозга in vivo. Традиционные методы применения лекарств, такие как использование вазодилататоров или констрикторов, часто требуют удаления черепа, что может повредить лептоменинги и даже паренхиму мозга 9,10,18. Эти инвазивные методы могут нарушить микроокружение мозга, в частности, вызывая повреждение сосудов и кровоизлияние, тем самым не воспроизводя реальные физиологические условия. В отличие от этого, наш метод имеет четыре существенных преимущества.

Во-первых, наш подход к применению лекарств является неинвазивным и сохраняет физиологические условия. Во-вторых, классические методы инъекций ICM обычно основаны на использовании шприцев или канюль, что может привести к утечке лекарств или следов и спинномозговой жидкости из-за большого размера наконечников. Эти традиционные методы часто требуют большого количества лекарств или следов - обычно 5 μл или более, которые могут изменить внутричерепное давление. В отличие от этого, для нашей инъекции ICM под контролем наноинъектора требуется лишь небольшой объем — всего 1,5 мкл или меньше. Кроме того, скорость впрыска можно точно контролировать в широком диапазоне, от 1 нл/с до 100 нл/с. Обычно мы используем скорость 5 нл/с (300 нл/мин), так как эта скорость не влияет на внутричерепное давление. В-третьих, в отличие от инъекций лекарств с помощью пипетки в паренхиму мозга или перфузии лекарств на поверхность коры головного мозга, наша доставка лекарств на основе цистернальных инъекций magna следует естественному потоку спинномозговой жидкости, точно имитируя физиологические условия. Наконец, поскольку наш метод сохраняет целостность черепа и мозговых оболочек, мы можем проводить измерения на одной и той же группе мышей в разные моменты времени, что позволяет проводить продольные сравнения, что невозможно при других методах применения лекарств. Для исследований выживаемости и продольных сравнений необходимо следовать строгим асептическим методам, включая надлежащую подготовку кожи, использование стерильных инструментов и материалов, а также соблюдение рекомендаций по уходу за животными в учреждении. Для заживления раны следует предусмотреть двухнедельный восстановительный период.

Метод анестезии может существенно повлиять на КБФ. Например, кетамин-кссилазиновая анестезия может повысить уровень КБК более чем на 50% по сравнению с исходным уровнем, в то время как изофлуран может удвоить базальный уровень КБФ. В наших экспериментах мы выбрали уретан и хлоралозу из-за их минимального воздействия на сердечно-сосудистую систему, что помогает поддерживать физиологический уровень CBF, обычно используемый в полевых условиях26,27. Кроме того, мы пропустили внутриартериальную канюляцию для повторного измерения газов крови, чтобы она была неинвазивной, хотя такие процедуры можно сочетать с нашим методом26.

Наш подход объединяет две системы: систему инжекции ICM28 на основе наноинжекции и систему лазерной спекл-контрастной визуализации (LSCI)29. Экспериментаторы должны быть обучены работе с обеими системами, чтобы успешно выполнить процедуру. Поскольку система LSCI занимает все пространство над головой мыши, наклон руки на 45° не только облегчает инъекцию ICM, но и обеспечивает совместимость между двумя системами. Такая установка имеет решающее значение для успеха эксперимента.

Для новичков, использующих инъекцию ICM с на-инъектором, требуется обширная практика, чтобы освоить координацию разделения мышц пинцетом в одной руке при маневрировании микроманипулятором для направления стеклянной пипетки другой. Хороший лазерный свет и стереомикроскоп с шарнирным манипулятором необходимы для оптимальной визуализации во время процедуры.

Используя этот метод, мы оценили, как классические вазодилататоры, такие как DHPG, ацетилхолин и аденозин, влияют на КБФ. Как и ожидалось, все три сосудорасширяющих средства увеличили уровень КБК; Однако они вызывали разную динамику. ДГПГ вызывал резкое увеличение КБФ с последующим медленным распадом, в то время как ацетилхолин вызывал постепенное увеличение. Напротив, аденозин вызывал лишь временное повышение КБФ.

Этот метод должен быть применим и к крысиным моделям. Однако, учитывая, что толщина черепа крысы составляет примерно 0,5-1 мм, его необходимо будет утончить для лазерной спекл-контрастной визуализации. Кроме того, в то время как текущий метод может быть адаптирован для мышей с фиксированной головой, он требует обширной тренировки, чтобы свести к минимуму движения животных во время экспериментов. Мы использовали ограниченное количество мышей для демонстрации нашего метода; Таким образом, наше исследование статистически ограничено, и следует проявлять осторожность при формулировании широких выводов из наших результатов.

Для последовательных и надежных измерений НБФ экспериментаторам важно признать, что другие физиологические параметры, такие как температура тела, артериальное давление и уровеньCO2 , играют решающую роль во всесторонней физиологической оценке и должны быть тщательно учтены в будущих исследованиях. Подводя итоги, мы представляем новый метод in vivo для изучения регуляции CBF у мышей. Этот подход является точным и минимально инвазивным, что делает его хорошо подходящим для исследования динамики КБФ, вызванной лекарственными препаратами.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами NIH (NS108763, NS127392, NS125788, NS125677).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
(RS)-3,5-дигидроксифенилглицинТокрисКат. No 0342
Ацетилхолина хлоридSigmaA6625-25G
АденозинSigmaA9251-25G
Спиртовой тампон 70% изопропиловый спиртVitrex Medical A/S520213
AmScope SM-8T Series Шарнирный манипулятор Зум СтереомикроскопAmScopeSM-8TZ-144S-10M
Aquasonic Прозрачный ультразвуковой пропускающий гельAquasonicGelPLI 03-50
Цифровая мышь Стереотаксические инструментыStoelting51730D
Этиловый спиртSigma459836-2L
Fiber-Lite DC950 ОсветительDolan-Jenner IndustriesDC950H
Замена стекла 1,14 ммWorld Precision Instruments504949
Kimtech Science Precision Wipes СалфеткиKimberly Clark Professional5511
Laser Speckle Contrast Imagermoor instrumentsMOORFLPI-2
Lasik Eye Spear (100 в кейсе) hospeqBV40815
MICROFIL FLEXIBLE NEEDLEWorld Precision InstrumentsMF34G-5
Минеральное маслоSigmaM5904
Грелка для мышиFisher scientific50-195-4000
Nair Cocoa Butter Лосьон для снятия волосAmazonASIN ‏ : ‎
НАНОЛИТР 2020 ИНЖЕКТОРWorld Precision InstrumentsNANOLITER2020
P-2000 микропипеткапуллер Sutter InstrumentP-2000
Puritan® тампоны, хлопчатобумажная головка, деревянный стержень,PuritanMedical806-WC
Стерильная глазная смазкаMedi-Vet11897
УретанSigmaU2500
Vetbond тканевый клейWorld Precision InstrumentsVETBOND
α-хлоралозаSigma23120
B000GCW5CS

Ссылки

  1. Lassen, N. A., Ingvar, D. H., Skinhøj, E. Brain function and blood flow. Sci Am. 239 (4), 62-71 (1978).
  2. Leenders, K., et al. Cerebral blood flow, blood volume and oxygen utilization: normal values and effect of age. Brain. 113 (Pt 1), 27-47 (1990).
  3. Armstead, W. M. Cerebral blood flow autoregulation and dysautoregulation. Anesthesiolo Clin. 34 (3), 465-477 (2016).
  4. Claassen, J. A., Thijssen, D. H., Panerai, R. B., Faraci, F. M. Regulation of cerebral blood flow in humans: physiology and clinical implications of autoregulation. Physiol Rev. 101 (4), 1487-1559 (2021).
  5. Strandgaard, S., Paulson, O. Cerebral autoregulation. Stroke. 15 (3), 413-416 (1984).
  6. Iadecola, C. The neurovascular unit coming of age: a journey through neurovascular coupling in health and disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
  7. Girouard, H., Iadecola, C. Neurovascular coupling in the normal brain and in hypertension, stroke, and Alzheimer disease. J. Appl. Physiol. 100 (1), 328-335 (2006).
  8. Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes. Nature. 443 (7112), 700-704 (2006).
  9. Zonta, M., et al. Neuron-to-astrocyte signaling is central to the dynamic control of brain microcirculation. Nat Neurosci. 6 (1), 43-50 (2003).
  10. Girouard, H., et al. Astrocytic endfoot Ca2+ and BK channels determine both arteriolar dilation and constriction. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (8), 3811-3816 (2010).
  11. Grafton, S. T., et al. Functional anatomy of human procedural learning determined with regional cerebral blood flow and PET. J Neurosci. 12 (7), 2542-2548 (1992).
  12. Tillfors, M., et al. Cerebral blood flow in subjects with social phobia during stressful speaking tasks: a PET study. Am J Psychiatry. 158 (8), 1220-1226 (2001).
  13. Goense, J., Merkle, H., Logothetis, N. K. High-resolution fMRI reveals laminar differences in neurovascular coupling between positive and negative BOLD responses. Neuron. 76 (3), 629-639 (2012).
  14. Wang, J., et al. Perfusion functional MRI reveals cerebral blood flow pattern under psychological stress. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (49), 17804-17809 (2005).
  15. Takano, T., et al. Astrocyte-mediated control of cerebral blood flow. Nat Neurosci. 9 (2), 260-267 (2006).
  16. Holstein-Rønsbo, S., et al. Glymphatic influx and clearance are accelerated by neurovascular coupling. Nat Neurosci. 26 (6), 1042-1053 (2023).
  17. Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1277-1309 (2012).
  18. Otsu, Y., et al. Calcium dynamics in astrocyte processes during neurovascular coupling. Nat Neurosci. 18 (2), 210-218 (2015).
  19. Cai, C., et al. Stimulation-induced increases in cerebral blood flow and local capillary vasoconstriction depend on conducted vascular responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (25), E5796-E5804 (2018).
  20. Xavier, A. L., et al. Cannula implantation into the cisterna magna of rodents. J Vis Exp. (135), e57378(2018).
  21. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. (20), e939(2008).
  22. Liu, X., et al. Epoxyeicosatrienoic acid-dependent cerebral vasodilation evoked by metabotropic glutamate receptor activation in vivo. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (2), H373-H381 (2011).
  23. Yamada, M., et al. Cholinergic dilation of cerebral blood vessels is abolished in M5 muscarinic acetylcholine receptor knockout mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (24), 14096-14101 (2001).
  24. O'Regan, M. Adenosine and the regulation of cerebral blood flow. Neurol Res. 27 (2), 175-181 (2005).
  25. Morii, S., Ngai, A., Ko, K. R., Winn, H. R. Role of adenosine in regulation of cerebral blood flow: effects of theophylline during normoxia and hypoxia. Am J Physiol. 253 (1 Pt 2), H165-H175 (1987).
  26. Park, L., et al. Aβ-induced vascular oxidative stress and attenuation of functional hyperemia in mouse somatosensory cortex. J Cereb Blood Flow Metab. 24 (3), 334-342 (2004).
  27. Park, L., et al. NADPH oxidase-derived reactive oxygen species mediate the cerebrovascular dysfunction induced by the amyloid β peptide. J. Neurosci. 25 (7), 1769-1777 (2005).
  28. Herz, J., et al. GABAergic neuronal IL-4R mediates T cell effect on memory. Neuron. 109 (22), 3609-3618.e9 (2021).
  29. Sun, Y. -Y., et al. Prophylactic edaravone prevents transient hypoxic-ischemic brain injury: implications for perioperative neuroprotection. Stroke. 46 (7), 1947-1955 (2015).

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Инъекция в большую цистернулазерная спекл-визуализациянейроваскулярное сопряжениемикроглиальная регуляцияинъекция вазодилататораанализ in vivoстереотаксическая хирургиявизуализация мозга грызуновинтрацистернальная инъекция
Парная наноинъекция Cisterna Magna и лазерная спекл-контрастная визуализация для изучения регуляции мозгового кровотока in vivo
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.