Методическая статья

Скрининг in vitro на основе светодиодов для оценки фотоактивируемых молекул при бактериальной фотодинамической инактивации

DOI:

10.3791/67550

⸱

24 января 2025 г.

 , 
1REQUIMTE/LAQV, Department of Chemistry and Biochemistry, Faculty of Sciences, University of Porto

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает простой и экономичный метод оценки эффективности потенциальных фотосенсибилизаторов в антибактериальной фотодинамической инактивации (aPDI) с использованием 96-луночного планшета в сочетании с источником света на светодиодной панели. Этот подход позволяет одновременно тестировать несколько экспериментальных условий, включая различные концентрации, соединения и штаммы бактерий.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рост инфекций с множественной лекарственной устойчивостью и отсутствие новых классов антибиотиков возобновили интерес к альтернативным методам лечения, таким как фотодинамическая инактивация бактерий (aPDI). Этот процесс включает в себя введение фотосенсибилизатора (ФС), активируемого подходящим источником видимого света, в результате чего повышаются уровни активных форм кислорода (АФК), которые повреждают важнейшие клеточные биомолекулы, что в конечном итоге приводит к гибели бактериальных клеток. Крайне важно создать стандартизированные, простые в использовании и воспроизводимые первоначальные испытания для оценки и сравнения эффективности светоиндуцированной фототоксичности потенциальных фотосенсибилизаторов. В этом исследовании представлен простой и эффективный метод in vitro для оценки фотодинамической активности в отношении планктонных бактериальных клеток. Используя 96-луночный формат микропланшетов вместе с большой светодиодной панелью, система облегчает систематическую оценку различных соединений. Такая конфигурация позволяет проводить высокопроизводительный скрининг потенциальных фотосенсибилизаторов в контролируемой и согласованной среде, упрощая процесс выявления перспективных кандидатов для дальнейшего развития. Эта гибкая платформа служит важным шагом в продвижении разработки инновационных фотодинамических методов лечения инфекций, устойчивых к антибиотикам.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Фотодинамическая терапия (ФДТ) является минимально инвазивным терапевтическим подходом, который в последние годы показал многообещающие результаты, особенно в дерматологическом клиническом лечении1. Одной из особенно интересных областей применения этого терапевтического метода является лечение микробных инфекций, процесс, известный как антимикробная фотодинамическая инактивация (aPDI)2. Несмотря на то, что первоначально на эту тему не обращали внимания, в основном из-за замечательной эффективности антибиотиков, в последние годы к эрадикации бактериального роста вновь возрос интерес, что было обусловлено появлением множественной лекарственной устойчивости к противомикробным препаратам (УПП) и необходимостью поиска альтернативных и эффективных стратегий для решения этой проблемы общественного здравоохранения 3,4. Значительные результаты могут быть достигнуты в течение нескольких секунд или минут, с пространственной и временной точностью, обеспечиваемой за счет целенаправленного облучения области интереса и функции включения/выключения процедуры, соответственно.

Механизм, лежащий в основе фотодинамического принципа, основан на комбинации светочувствительных молекул (фотосенсибилизатора), молекулярного кислорода и внешнего источника света. Хотя эти три компонента безвредны, при объединении они могут стать смертельными для клеток-мишеней из-за фотоактивации фотосенсибилизатора. Реакции, вызванные светом, приводят к массовому образованию активных форм кислорода (АФК), что в конечном итоге вызывает серьезные и необратимые повреждения в ключевых клеточных компонентах, что приводитк гибели клеток. Кроме того, комбинация aPDI с другими традиционными антимикробными препаратами показала многообещающие терапевтические результаты, включая более высокую эффективность лечения, сокращение времени лечения и более низкие дозировки препарата7.

Кроме того, местное применение фотосенсибилизаторов (ФС) при ФДТ позволяет проводить целенаправленное лечение с минимальным повреждением окружающих тканей и низкими системными эффектами, что делает его хорошо оцененным вариантом лечения поверхностных инфекций кожи8. Удобство местного лечения и поверхностный характер многих кожных инфекций и поражений делают его привлекательной мишенью для ФДТ. Исследования подтвердили эффективность aPDI в лечении ожоговых инфекций, инфекций хирургических ран, изъязвленных поражений и других поверхностных заболеваний, таких как акне и импетиго 9,10,11.

Многочисленные молекулы, как природные, так и синтетические, были протестированы и предложены для лечения aPDI. Тем не менее, использование различных и часто неопределенных параметров в экспериментальных протоколах затрудняет сравнение результатов, что влияет на ясность научных выводов. Разработка простых и воспроизводимых тестов может облегчить быстрый скрининг многочисленных соединений, ускоряя выявление перспективных кандидатов. Простые, воспроизводимые и экономичные протоколы особенно ценны на ранних стадиях тестирования, поскольку они позволяют сравнивать результаты в различных исследовательских центрах. Эффективные процессы скрининга также облегчают изучение более широкого спектра молекул, что потенциально может привести к открытию и выбору новых фотосенсибилизаторов для дальнейшего тестирования в рамках более продвинутых, сложных и дорогостоящих методологий.

В этом протоколе описан простой метод оценки фототоксичности потенциальных фотосенсибилизаторов на бактерии с использованием светодиодной панели с интенсивностью света 25 мВт/см2. Был использован репрезентативный штамм бактерий S. aureus, и был выбран канал белого света, обеспечивающий полный охват видимого спектра. Процедура включала в себя 30-минутный прединкубационный период с последующим 15-минутным воздействием света (22,5 Дж/см2). Хотя результаты основаны на этих конкретных экспериментальных условиях, они могут быть адаптированы в соответствии с индивидуальными протоколами. Важно четко определить эти настройки и включить их в описание процедуры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Общее описание протокола проиллюстрировано на рисунке 1. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Подготовка бактериальной культуры

  1. Выращивайте бактерии S. aureus (ATCC 29213) на агаре Мюллера-Хинтона (MH) из культур исходного материала. Инкубируйте планшеты MH при 37 °C в течение 24 ч перед анализом для получения свежих культур.
  2. Инокуляция бактерий: Соберите 2-3 свежие колонии из агаровой пластины и разведите в 6 мл предварительно подогретого фосфатно-солевого буфера (PBS) pH 7,4, стерильно отфильтрованного.
  3. Вихревой (1200 об/мин) внесите инокулянт 3-4 раза, чтобы обеспечить надлежащую гомогенизацию образца. Выведите 3 мл в одноразовую кювету.
  4. Измерьте внешний диаметр600 и отрегулируйте его до 0,1 (примерно 1 x 108 КОЕ/мл) с помощью PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Точное преобразование OD в КОЕ может варьироваться в зависимости от штамма S. aureus. Можно установить стандартную кривую роста для конкретного штамма и лабораторных экспериментальных условий, с которыми можно работать.

2. Приготовление фотосенсибилизатора

  1. Исходный раствор: Приготовьте исходный раствор представляющего интерес фотосенсибилизатора (подробнее см. раздел «Результаты») в подходящем растворителе (например, ДМСО или PBS; Рисунок 2).
  2. Рабочий раствор: Развести стоковый раствор в PBS. Использование PBS вместо бактериальных питательных сред гарантирует, что компоненты среды не будут препятствовать поглощению света во время экспериментов с aPDI.
  3. Сделайте образец вихревым для обеспечения полной гомогенизации. При необходимости используйте ультразвуковую ванну, чтобы гарантировать полную растворяемость и добиться прозрачного раствора (в этом случае тщательно контролируйте. Для гидрофобных соединений может потребоваться корректировка системы растворителя (например, добавление % ДМСО или этанола). Убедитесь, что влияние растворителя на жизнеспособность клеток всегда проверяется.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Условия для ультразвуковой обработки будут варьироваться в зависимости от типа соединения, концентрации и растворителя системы; Более короткое время (например, 5 минут) может быть достаточным для легко растворимых соединений, в то время как более длительное время (20-30 минут) может потребоваться для высокогидрофобных соединений.

3. Настройка пластин

  1. Подготовьте два отдельных 96-луночных планшета: один для экспонирования на свет, а другой для хранения в темноте (контроль темноты).
  2. В каждой из пластин смешайте 100 мкл раствора фотосенсибилизатора со 100 мкл бактериальной суспензии. Делайте пипеткой вверх и вниз 5-10 раз.
  3. Инкубируйте планшеты при температуре 37 °C в течение заранее определенного интервала времени (в этом исследовании использовался период 30 минут), чтобы фотосенсибилизатор мог взаимодействовать с бактериальными клетками.

4. Облучение

  1. Выньте пластины из инкубатора и подставьте одну из них под воздействие света, излучаемого светодиодной панелью (устройство, использованное в данном эксперименте, состояло из прямоугольного светодиодного проектора мощностью 50 Вт; IP65; входное напряжение: переменного тока 85-265 В), защищая другой от воздействия света.
  2. Поместите одну из пластин над светодиодной панелью. Чтобы обеспечить точную регулировку планшета с помощью нескольких повторений протокола, отметьте края 96-луночного планшета непосредственно на поверхности светодиода.
  3. Экспонируйте пластину в течение подходящего времени облучения (в этом исследовании использовался период 15 минут).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что доза света достаточна для активации фотосенсибилизатора без ущерба для жизнеспособности клеток. По этой причине необходимо включить контроль освещенности (бактерии, подвергающиеся воздействию света в отсутствие фотосенсибилизатора).

5. Отбор проб после облучения и отбора агаровых пластин

  1. Используйте другую 96-луночную пластину для подготовки последовательных разведений образцов (контрольных, необлученных и облученных лунок).
  2. Добавьте 180 μL PBS/лунку в зависимости от количества проб. Чтобы правильно определить схему, учтите, что для серийного разведения одной пробы необходим ряд из 6 лунок (10-кратное разубоживание, от 10−1 до 10−6).
  3. Аликвота 20 мкл из каждой лунки (из облученного и необлученного 96-луночного планшета) в первую колонну планшета, предварительно заполненного PBS.
  4. С помощью многоканальной микропипетки выполните простое последовательное разведение от лунки 1 до 6 (от 10-1 до 10-6). ПРИМЕЧАНИЕ: Гомогенизация образца имеет решающее значение на данном этапе для обеспечения однородной и однородной смеси. На каждом этапе разведения делайте пипетку вверх и вниз 5-10 раз.
  5. Разделите агаровую пластину на шесть равных частей, каждая секция которых соответствует одному из разведений (см. рисунок 3).
  6. Аликвоту по 10 мкл из каждой лунки на соответствующий участок на поверхности агаровой пластины (для каждого образца включают не менее 3 повторов). Не размещайте аликвоты слишком близко друг к другу. Аккуратно перенесите агаровые пластины в инкубатор и подождите 18-20 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Примите во внимание, что морфология КОЕ значительно варьируется в зависимости от вида бактерий. Например, в то время как колонии S. aureus относительно легко поддаются подсчету, P. aeruginosa имеет тенденцию образовывать колонии более диффузного типа. Количество повторов может быть скорректировано с учетом этого.

6. Определение жизнеспособности клеток (подсчет колониеобразующих единиц)

  1. Извлеките агаровые пластины из инкубатора и выберите участки, подходящие для подсчета клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте подсчета в секциях с обильными, перекрывающимися и плохо определенными колониями.
  2. В каждом секции подсчитайте количество колониеобразующих единиц (КОЕ) и определите среднее значение 3 реплик
  3. Переведите количество подсчитанных КОЕ в КОЕ/мл, умножив среднее значение подсчета на коэффициент разбавления и разделив на объем покрытой культуры в мл.

7. Анализ данных

  1. Преобразуйте данные КОЕ/мл в логарифмическую шкалу и представьте клеточную жизнеспособность в log10|КОЕ/мл| в зависимости от проверяемой концентрации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Соединения флавилия на основе аминоса (рис. 2): 7-диэтиламино-4'-диметиламинофлавилий (7NEt24′NMe2), 7-диэтиламино-2-(диметиламиностирил)-1-бензопирилий (7NEt2st4′NMe2), 7-диэтиламино-4'-аминофлавилий (7NEt24′NH2) и 7-диэтиламино-4'-гидроксифлавилий (7NEt24′OH), чья светочувствительная природа обсуждалась ранее12,13, инкубировали с S. aureus в течен...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Несмотря на то, что этот протокол служит платформой для тестирования на начальном этапе, важно рассмотреть более значимые условия тестирования для лечения микробных инфекций на более продвинутой стадии исследования. При оценке эффективности aPDI следует проводить эксперименты на бактериальных организациях биопленочного типа, а не на планктонных бактериях. Во многих клинических случаях микроорганизмы организованы в эту более устойчивую конфигурацию, например, в хронических ранах, муковисц...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была выполнена при финансовой поддержке проекта FCT FERMEN. К - Рекомендуемые продукты для борьбы с МЕтаболическим сНдромом. Интегрированный динамический подход in vitro (2023.00164.RESTART). Эта работа была поддержана Ассоциированной лабораторией зеленой химии - LAQV (LA/P/0008/2020 https://doi.org/10.54499/LA/P/0008/2020; UIDP/50006/2020 https://doi.org/10.54499/UIDP/50006/2020; UIDB/50006/2020 https://doi.org/10.54499/UIDB/50006/2020), которые национальные фонды финансируют за счет средств ФСТ/МСТЭС. .К. благодарит ее за получение докторской степени от FCT (SFRH/BD/150661/2020). Ива Фернандес подтверждает свой контракт с доцентом (https://doi.org/10.54499/CEECINST/00064/2021/CP2812/CT0004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Спектрофотометр Cary 60 UV-Vis AgilentG6860A
ДиметилсульфоксидSigma-AldrichD8418
Одноразовые кюветы PMMABRAND GMBH + CO KG759030
Eppendorfs (500 мл)Пробирки Fisher Scientific15625367
Falcon (15 мл)Трубки Corning430791
Falcon ( 50 мл)СветодиоднаяCorning 430291
IP65 50 Вт
Micropippete (100 мл)Transferpette S705874
Micropippete (1000 мкл)Transferpette S705880
Mueller Hinton agar OxoidCM0405
Многоканальный пипет 12-канальныйTransferpette S
Nunc MicroWell 96-луночные микропланшетыThermo Scientific260844
Фоспат Буферизованные солевые таблетки pH 7,4Panreac ApplichemA9177
Серологические пипеты (10 мл)Thermo Scientific170356N
Серологические пипетки (5 мл)Thermo Scientific170366N
Чашка для культуры тканейTPP Techno Plastic Products AG93150
панель

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Correia, J. H., Rodrigues, J. A., Pimenta, S., Dong, T., Yang, Z. Photodynamic therapy review: principles, photosensitizers, applications, and future directions. Pharmaceutics. 13 (9), 1332(2021).
  2. Hamblin, M. R. Antimicrobial photodynamic inactivation: A bright new technique to kill resistant microbes. Curr Opin Microbiol. 33 (6), 67-73 (2016).
  3. Aroso, R. T., Oliveira, S. M., Almeida, A., Carvalho, C. M. B. Photodynamic disinfection and its role in controlling infectious diseases. Photochem Photobiol Sci. 20 (11), 1497-1545 (2021).
  4. Rapacka-Zdończyk, A., Woźniak, A., Podbielska, H., Kasprzycka, A. Factors determining the susceptibility of bacteria to antibacterial photodynamic inactivation. Front Med. 8, 733501(2021).
  5. Dolmans, D. E. J. G. J., Fukumura, D., Jain, R. K. Photodynamic therapy for cancer. Nat Rev Cancer. 3 (5), 380-387 (2003).
  6. Lima, E., Reis, L. V., Silva, A. L. C., Carvalho, M. T. Photodynamic therapy: From the basics to the current progress of N-heterocyclic-bearing dyes as effective photosensitizers. Molecules. 28 (13), 5103(2023).
  7. Pérez-Laguna, V., Pérez-Artiaga, L., Royo-Díaz, D., Gilaberte, Y. A combination of photodynamic therapy and antimicrobial compounds to treat skin and mucosal infections: A systematic review. Photochem Photobiol Sci. 18 (5), 1020-1029 (2019).
  8. Babilas, P., Karrer, S., Szeimies, R. M. Photodynamic therapy in dermatology: state-of-the-art. Photodermatol Photoimmunol Photomed. 26 (3), 118-132 (2010).
  9. Pérez-Laguna, V., Pérez-Artiaga, L., Gilaberte, Y. Photodynamic therapy combined with antibiotics or antifungals against microorganisms that cause skin and soft tissue infections: a planktonic and biofilm approach to overcome resistances. Pharmaceutics. 14 (6), 1-16 (2021).
  10. Almenara-Blasco, M., López-Roca, A., Pérez-Sanchez, A., Valiente, R. Antimicrobial photodynamic therapy for dermatological infections: current insights and future prospects. Front Photobiol. 2, 773502(2024).
  11. de Oliveira, A. B., Reis, C., Soares, M. T., Batista, S. L. Photodynamic therapy for treating infected skin wounds: a systematic review and meta-analysis from randomized clinical trials. Photodiagnosis Photodyn Ther. 40 (5), 103-118 (2022).
  12. Correia, P., Oliveira, S. R., Batista, A. L. Light-activated amino-substituted dyes as dual-action antibacterial agents: bio-efficacy and AFM evaluation. Dyes Pigm. 224, 111975(2024).
  13. Oliveira, H., Santos, A. R., Costa, L. M. Photoactivated cell-killing amino-based flavylium compounds. Sci Rep. 11 (1), 22005(2021).
  14. Sharma, S., Singh, V., Kaur, S., Mehta, A. Microbial biofilm: A review on formation, infection, antibiotic resistance, control measures, and innovative treatment. Microorganisms. 11 (6), 1614(2023).
  15. Barolet, D., Christiaens, F., Misery, L. Light-emitting diodes (LEDs) in dermatology. Semin Cutan Med Surg. 27 (3), 227-238 (2009).
  16. Algorri, J. F., López-Higuera, J. M., Rodríguez-Cobo, L., Cobo, A. Advanced light source technologies for photodynamic therapy of skin cancer lesions. Pharmaceutics. 15 (7), 2075(2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Staphylococcus aureus96

Похожие статьи