Методическая статья

Идентификация функционально значимых сайтов интеграции лентивирусов в библиотеке клеток инсерционного мутагенеза

DOI:

10.3791/67552

⸱

10 января 2025 г.

 ,  , 
1Institute of Genomics, School of Medicine, Huaqiao University, 2State Key Laboratory of Cellular Stress Biology, School of Life Sciences, Xiamen University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Инсерционный мутагенез является важным инструментом в прямой генетике для идентификации функциональных элементов генома. Здесь мы описываем Скрининг функциональных элементов и транскриптов на основе инсерций (InSET) — метод обнаружения сайтов интеграции лентивируса в библиотеке клеток инсерционного мутагенеза на основе лентивируса.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Степень функциональных последовательностей в геноме человека является ключевой, но обсуждаемой темой в биологии. Несмотря на то, что высокопроизводительные обратные генетические скрининги добились успехов в изучении этого вопроса, они часто ограничивают свою область известными геномными элементами и могут вызывать неспецифические эффекты. Это подчеркивает острую потребность в новых инструментах функциональной геномики, которые обеспечивают более глубокое и непредвзятое понимание функциональности генома. Этот протокол представляет Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts (InSET) — метод идентификации сайтов интеграции лентивируса в библиотеке клеток инсерционного мутагенеза на основе лентивируса. InSET облегчает захват сайтов интеграции лентивирусов по всему геному, а секвенирование нового поколения используется для обнаружения и количественного определения фланговых последовательностей. Дизайн InSET позволяет анализировать вариации распространенности сайтов интеграции в фенотипических скринингах в больших масштабах, делая его надежным инструментом для прямой генетики и идентификации функциональных элементов генома. Ключевым преимуществом InSET является его способность выявлять ранее не идентифицированные геномные элементы, в том числе новые функциональные экзоны как белок-кодирующих, так и некодирующих РНК, независимо от предшествующей аннотации. В целом, InSET имеет значительную ценность для изучения сложной структуры генома и транскриптома человека, где многие элементы генома ожидают функциональной характеристики.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Функциональная геномика остается важной и сложной областью, даже в постгеномную эпоху, где значительной части областей генома все еще не хватает функциональной характеристики. Ключевая причина этих проблем заключается в сложной природе генома и транскриптома человека, которые характеризуются всепроникающей транскрипцией и универсальным альтернативным сплайсингом как в кодирующих белки, так и в некодирующих областях1,2,3,4,5. Эта сложность была широко освещена в исследованиях обогащения, нацеленных на РНК6,7,8,9. Все чаще признается, что многочисленные новые элементы генома остаются неотображенными и функционально неаннотированными10,11,12в дополнение к хорошо аннотированным сегментам человеческого генома.

В последние годы были замечены достижения в инструментах обратной генетики, таких как РНК-интерференция (РНК-интерференция) и системы CRISPR/Cas13,14,15,16,17,18,19,20,21. Тем не менее, эти методы имеют заметные недостатки, включая неспецифические эффекты и высокие затраты, связанные с созданием сложных библиотек коротких РНК (shRNAs) или одиночных направляющих РНК (sgRNAs)22,23,24,25. Кроме того, эти методы преимущественно ориентированы на аннотированные элементы генома. В отличие от этого, прямая генетика имеет преимущество в выявлении новых, неаннотированных функциональных элементов генома. Учитывая сложность генома и транскриптома человека, а также огромное количество новых геномных элементов, эта способность прямой генетики имеет большое значение.

Библиотеки клеток прямой генетики часто генерируются путем случайной ретровирусной интеграции, что делает эффективное обнаружение сайтов интеграции всего генома критически важным для прямого генетического анализа. Обнаружение этих сайтов интеграции обычно включает в себя инструменты обхода генома26. Несмотря на значительные успехи в этих инструментах, лишь немногие из них оптимизированы для применения в секвенировании нового поколения (NGS) и впоследствии применяются в исследованиях инсерционного мутагенеза. Инсерционный мутагенез в клеточных линиях часто использует такие методы, как обратная ПЦР (I-ПЦР) или ПЦР с линейной амплификацией (LAM-ПЦР) для обнаружения сайтов интеграции27,28,29. Эти методы, однако, обычно требуют этапов расщепления ферментов рестрикции или лигирования, что может снизить эффективность и внести погрешности в результаты.

Для повышения эффективности обнаружения полногеномных сайтов интеграции в прямых генетических скринингах, здесь был представлен метод, называемый методом Insert-based Screen for functional Elements and Transcripts (InSET). Интегрируя обход генома с NGS, InSET обеспечивает высокопроизводительную идентификацию сайтов интеграции лентивируса в библиотеках инсерционного мутагенеза на основе лентивирусов. По сравнению с существующими методами27,28,29, InSET относительно прямолинеен и прост, устраняя этапы переваривания ферментов рестрикции или лигирования, что делает его более удобным и доступным. Более того, несмотря на то, что существующий прямой генетический скрининг в клетках млекопитающих ограничен очень небольшим числом гаплоидных или почти гаплоидных клеточных линий27,28,29,30,31, было доказано, что InSET работает в анеуплоидных клеточных линиях32.

Это исследование предоставляет подробный, пошаговый протокол для реализации метода InSET. Кроме того, в нем демонстрируется применение InSET в исследованиях инсерционного мутагенеза. InSET служит мощным инструментом для идентификации новых экзонов в геномных элементах, охватывающих как кодирующие белки, так и некодирующие РНК в клеточных линиях человека.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На рисунке 1 представлен схематический обзор метода InSET. Для оптимального покрытия подготовьте пять параллельных библиотек из 1 г геномной ДНК, а затем объедините их для секвенирования следующего поколения. Эта процедура была успешно завершена в предыдущих тестах, хотя пользователи могут вводить точки паузы по своему усмотрению. Подробную информацию о реактивах и оборудовании, использованных в данном исследовании, можно найти в Таблице материалов.

1. Захват сайтов интеграции лентивируса в геноме

  1. Используйте геномную ДНК, выделенную из библиотеки клеток инсерционного мутагенеза на основе лентивируса (1 мкг), как описано в предыдущем исследовании32, в качестве матрицы для линейной ПЦР в реакции объемом 50 мкл, содержащей 1x Taq буфер, 2,5 U Taq ДНК-полимеразы, 4 мкл смеси dNTP (2,5 мМ каждая) и 0,3 мкМ биотинилированного праймера 3-LTR_prime (Таблица 1) в ПЦР-пробирке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 3-LTR_prime отжиг праймера в область LTR последовательности лентивируса. Если он отжигает до 5'LTR, амплифицированный фрагмент включает в себя фланкирующую геномную последовательность. Если он отжигается до 3'LTR, амплифицированный фрагмент содержит внутреннюю последовательность лентивируса, которая не может быть выровнена по геному хозяина и, следовательно, будет отфильтрована во время последующего анализа данных секвенирования. Этот праймер также может быть модифицирован для адаптации к другим типам векторов, используемых для создания библиотеки клеток инсерционного мутагенеза.
  2. Выполните 50 циклов линейной ПЦР в стандартном термоциклере для ПЦР, добавив 2,5 U Taq DNA Polymerase в начале и снова сразу после 25 циклов. Условия ПЦР следующие: 94 °C в течение 5 мин; 50 циклов при температуре 94 °C в течение 30 с, 55 °C в течение 30 с и 72 °C в течение 30 с; 72 °C в течение 5 мин.<бр/> Примечание: Для поддержания активности Taq DNA Polymerase во время длительных реакций рекомендуется добавлять фермент как в начале, так и в середине реакции.
  3. Переложите продукты ПЦР в новую, чистую центрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
  4. Продукты ПЦР тщательно перемешать с 10 мкл магнитных шариков биотин-стрептавидина.
  5. Выдерживать смесь в течение 2 часов при комнатной температуре, встряхивая при 400 об/мин в металлической ванне.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Вынимайте пробирку, чтобы хорошо перемешать с пипеткой каждые 15 минут.
  6. С помощью магнитной подставки соберите бусины, затем аккуратно удалите надосадочную жидкость.
  7. Промойте шарики 300 μL Binding/Wash Buffer (10 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,1% Tween-20) 6 раз и выбросьте надосадочную жидкость.
  8. Дважды промойте дистиллированной водой без ДНКазы/РНКазы объемом 300 мкл (65 °C) и выбросьте надосадочную жидкость.
  9. Для синтеза второй цепи ресуспендируйте гранулы в реакционном объеме 24 мкл, содержащем 1x буфер фрагментов Кленова, 2 мкл смеси dNTP (по 2,5 мМ каждая) и 6,25 мкМ праймер P5_N6 а (табл. 1) в пробирке для ПЦР><. ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте стоковый раствор P5_N6 грунтовке в массе 100 μM. Праймер P5_N6 состоит из фиксированной последовательности адаптера P5 на 5'-конце и случайной последовательности гексамера на 3'-конце. Случайный гексамер может связываться с различными последовательностями-мишенями, что делает его пригодным для амплификации различных фрагментов ДНК, полученных с помощью линейной ПЦР.
  10. Предварительно инкубируйте смесь при 15 °C в течение 20 минут в термоамплификаторе для ПЦР.
  11. Добавьте 2 U фрагмента Кленоу (большой фрагмент ДНК-полимеразы E.coli).
  12. Инкубируйте смеси в амплификаторе для ПЦР в следующих условиях: медленное нарастание при 0,5 °C/мин от 15 °C до 25 °C с последующей инкубацией в течение 30 минут; затем медленное нарастание при 0,5 °C/мин до 37 °C с последующей инкубацией в течение 1 часа.
  13. Переложите продукты ПЦР в новую, чистую центрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
  14. Используйте магнитную подставку, чтобы захватить бусины, затем выбросьте надосадочную жидкость.
  15. Аккуратно промойте шарики 300 μл дистиллированной воды без ДНКазы/РНКазы 4 °C. Соберите бусины и выбросьте надосадочную жидкость.

2. Построение библиотеки NGS с вложенной ПЦР

  1. Ресуспендируйте шарики с этапа 1.15 в 25 мкл реакционного объема ПЦР, содержащего 1x Taq-буфер, 1,25 U Taq ДНК-полимеразы, 0,5 мкМ праймера P5 (Таблица 1), 2 мкл смеси dNTP (по 2,5 мМ каждая) и 0,5 мкМ праймера 3-LTR_Nest (Таблица 1) в ПЦР-пробирке.
  2. Проводят ПЦР-реакции в амплификаторе ПЦР при следующих условиях: 94 °C в течение 3 мин; 20 циклов 94 °C в течение 30 с, 55 °C в течение 30 с и 72 °C в течение 30 с; 72 °C в течение 7 мин.
  3. Используйте 5 мкл продуктов ПЦР из этапа 2.2 в качестве матрицы для следующего раунда ПЦР объемом 50 мкл, содержащим 1x Taq буфер, 2,5 ед Taq ДНК-полимеразы, 4 мкл смеси dNTP (по 2,5 мМ каждая), 0,4 мкМ праймера Illumina_P5 (Таблица 1) и 0,4 мкМ праймера Illumina_P7-3LTR (Таблица 1).
  4. Проводят ПЦР-реакции в амплификаторе ПЦР при следующих условиях: 94 °C в течение 3 мин; 15 циклов при 94 °C в течение 30 с, 55 °C в течение 30 с и 72 °C в течение 30 с; 72 °C в течение 7 мин.
  5. Переложите продукты ПЦР в чистую центрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе протокол может быть приостановлен, а образцы могут храниться при температуре -20 °C.
  6. Очистите продукты ПЦР с помощью 1,2-кратного объема чистых гранул ДНК, доведя конечный объем до 21 μл<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Возьмите по 10 мкл ПЦР-продуктов из каждой из 5 библиотек, приготовленных параллельно, объедините их вместе и очистите до конечного объема 21 мкл. Протокол очистки для продуктов ПЦР адаптирован из инструкции производителя для чистых гранул ДНК (см. Таблицу материалов).
    1. Уравновесьте шарики от 2-8 °C до комнатной температуры в течение 30 минут.
    2. Тщательно перемешайте бусины, переворачивая или закручивая.
    3. Пипетка в 1,2 раза больше шариков в чистую центрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
    4. Добавьте продукты ПЦР в бусины и тщательно перемешайте, пипетируя вверх и вниз 10 раз.
    5. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 минут, чтобы ДНК могла сцепиться с шариками.
    6. Поместите образцы на магнитную подставку и удалите надосадочную жидкость, как только раствор станет прозрачным (около 5 минут).
    7. Добавьте 200 мкл 80% этанола для мытья шариков, выдержите при комнатной температуре в течение 30 секунд и удалите надосадочную жидкость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 80% этанол должен быть приготовлен свежим.
    8. Повторите шаг 2.6.7 один раз.
    9. Высушите бусины на воздухе при комнатной температуре при открытой крышке около 5 минут.
    10. Снимите пробирку с магнитной подставки, добавьте 22 мкл дистиллированной воды, не содержащей ДНКазы/РНКазы, тщательно перемешайте, пипетируя вверх и вниз 10 раз, и оставьте при комнатной температуре на 2 минуты.
    11. Поместите пробирку на магнитную подставку до тех пор, пока раствор не станет прозрачным (около 2 мин), затем перенесите 21 мкл надосадочной жидкости в чистую центрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе протокол может быть приостановлен, а образцы могут храниться при температуре -20 °C.
  7. Используйте 1 мкл очищенных продуктов ПЦР для измерения концентрации с помощью флуориметра с коммерчески доступным набором для обнаружения флуоресценции дцДНК (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол измерения концентрации соответствует инструкциям производителя для набора для обнаружения дцДНК.
    1. Приготовьте приготовление рабочего раствора, смешав реагент и буфер (входит в комплект) в соотношении 1:200.
    2. Приготовьте стандарты для анализа, смешав 10 μL Стандарта #1 и 10 μL Стандарта #2 (входит в комплект), каждый со 190 μL Рабочего раствора. Аккуратно перебейте смесь в течение 2-3 с.
    3. Приготовьте образец анализа, смешав 1 мкл очищенных продуктов ПЦР со 190 мкл рабочего раствора. Аккуратно перебейте смесь в течение 2-3 с.
    4. Инкубируйте стандарты и образцы в течение 2 минут при комнатной температуре, защищая их от света.
    5. Включите флуориметр.
    6. Выберите программу dsDNA High Sensitivity в главном меню.
    7. Для калибровки вставьте стандарт #1 в машину, нажмите кнопку «Прочитать стандарт», чтобы измерить первый стандарт, затем вставьте стандарт #2 и нажмите кнопку «Прочитать стандарт», чтобы измерить второй стандарт.
    8. Для измерения образца нажмите кнопку Запустить образцы, чтобы перейти на страницу измерения образца. Вставьте каждую пробирку, содержащую образец анализа, и нажмите кнопку «Прочитать пробирку», чтобы получить концентрацию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе протокол может быть приостановлен, а образцы могут храниться при температуре -20 °C.
  8. Выполняйте NGS на платформах Illumina, используя парную стратегию 150 bp (PE150) в масштабе 30 гигабаз (GB).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап обычно перекладывается на аутсорсинг компаниям, занимающимся секвенированием.

3. Анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве примера в этом разделе был использован анализ на линиях клеток человека.

  1. Картирование сайтов интеграции с лентивирусами
    1. Отфильтруйте чтения секвенирования с более чем 50% оснований низкого качества (оценка по Phred <20), более чем 15 основаниями 'N' или короче 150 оснований с помощью fastp tool33 (см. Таблицу материалов).
    2. Выберите только считывание с парным концом при чтении 2, начинающемся с тега LTR "GCCTTGTGTGTGTGTTAGATCCACAG
      ATCAAGGATATCTTGTCTTCGTTGGGAGTGAAT
      TAGCCCTTCCA".
      Примечание: Эта последовательность зависит от последовательности вектора, используемого для создания библиотеки клеток инсерционного мутагенеза.
    3. Обрежьте последовательность тегов LTR из операций чтения, выбранных на шаге 3.1.2.
    4. Выровняйте обрезанные чтения по GRCh37/hg19 с помощью BWA-MEM 34 (см. Таблицу материалов) с настройками по умолчанию.
    5. Сохраняйте только пары чтения, в которых оба чтения 1 и чтения 2 однозначно отображены в геноме с правильной конфигурацией и интервалами, обозначенными FLAG 147 и FLAG 163.
    6. Определите положение вставки в качестве первого выровненного основания обрезанного чтения 2.
    7. Нормализуйте количество прочтений в каждом уникальном месте вставки в соответствии с общим числом уникально выровненных операций чтения в каждом образце.
  2. Идентификация вставок, влияющих на клеточную приспособленность (IACF)
    Примечание: При статистическом анализе целесообразно проводить попарные сравнения между тремя биологическими репликами как контрольных, так и обработанных образцов для выявления значительно обогащенных или истощенных позиций. Количество повторов, о которых говорилось выше, минимально. Рекомендуется использовать как можно больше повторов, чтобы обеспечить достоверность и точность результатов.
    1. Преобразуйте нормализованное количество операций чтения для каждой позиции в логарифм10 значений.
    2. Установите логарифмические10 значений позиций с нулевыми чтениями как −5.
    3. Выполните двусторонний парный t-критерий Стьюдента на log10 значениях.
    4. Настройте p-значения для множественных сравнений с помощью метода Беньямини-Хохберга в среде R.
    5. Выбирайте позиции с пороговым значением коэффициента ложных открытий (FDR) 25% в качестве IACF.
  3. Идентификация кластеров, влияющих на приспособленность клеток (CACF)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого анализа были рекомендованы три биологические реплики контрольных и обработанных образцов.
    1. Определите значительно обогащенные или истощенные кластеры вставки между контрольными и обработанными образцами с помощью SICER35 (см. Таблицу материалов) с пороговым значением FDR 1%. Команда для анализа SICER выглядит следующим образом: "sh $SICER/SICER.sh $InputDir $In $Control $OutputDir hg19 1 10 1 0.8 30 0.01".
      ПРИМЕЧАНИЕ: Значения параметров в приведенной выше команде следующие: ["InputDir"] ["обработанные участки вставки образцов bed file"] ["контрольные участки вставки образцов bed file"] ["OutputDir"] ["виды"] ["порог избыточности"] ["размер окна (bp)"] ["размер фрагмента"] ["эффективная фракция генома"] ["размер разрыва (bp)"] ["E-значение"].
    2. Получите кластерные области, общие по крайней мере для двух биологических репликатов, с помощью функции "intersect" класса BEDTools suite36 (см. Таблицу материалов) и обозначьте эти кластерные области как CACF.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оценка контроля качества библиотеки NGS, обычно выполняемая поставщиком секвенирования, служит стандартной проверкой качества перед секвенированием. Чтобы продемонстрировать влияние качества библиотеки, были сравнены две выборки. Высококачественная библиотека, помеченная как s2-20-15, была подготовлена с использованием стандартного вложенного протокола ПЦР, состоящего из двух этапов последовательной амплификации: первый с 20 циклами, за которым следует второй с 15 циклами. В отличие от этого, библиотека низкого качества,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В прямом генетическом анализе обход генома имеет важное значение для профилирования сайтов интеграции в библиотеках клеток инсерционного мутагенеза. Классические методы обхода генома, такие как I-ПЦР и ЛАМ-ПЦР, часто требуют рестрикционного расщепления фермента и лигирования, что может снизить сложность библиотеки и привести к систематическим ошибкам из-за зависимости от сайта фермента 27,28,29. Метод InSET позволяет обойти эти ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не раскрывают информацию.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.X. поддерживается Национальным фондом естественных наук Китая (32000441), Фондом естественных наук провинции Фуцзянь, Китай (2023J01130), Фондами фундаментальных исследований для центральных университетов Университета Хуацяо (ZQN-924) и Фондами научных исследований Университета Хуацяо (18BS205). P.K. поддерживается Национальным фондом естественных наук Китая (32170619), Исследовательским фондом для старших международных ученых из Национального университета естественных наук. Научный фонд Китая (32150710525) и Фонд естественных наук провинции Фуцзянь, Китай (2020J02006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,5 м ЭДТАИнвитрогенAM9260Gизготовления связующего буфера
м трис-HCl (Ph 8,0)Инвитроген15568025изготовления переплетающего / промывочного буфера
10 раз; Буфер фрагментов Кленоу Takara2140A
10&раз; Taq BufferTiangenET101-01-01
5 M NaClInvitrogenAM9659Для изготовления связывающего/промывочного буфера
Beaver StreptavidinBeaver22307-11 μ m
BEDToolsSoftware, v2https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/
BWA-MEMSoftware, v0.7.12
dNTP СмесьTakara40302,5 мМ каждый
Equalbit dsDNA HS Assay KitVazymeEQ111-02
fastpSoftware
HiSeq X TenIlluminaSY-412-1001Платформа Illumina, передана на аутсорсинг корпорации Novogene (Пекин)
Klenow FragmentTakara2140A
NovaSeq 6000Платформа Illumina20012850Illumina, передана на аутсорсинг корпорации Novogene (Пекин)
Флуориметр Qubit 3.0ThermoFisher ScientificQ33216
SICERSoftware, v1.1
Taq DNA PolymeraseTiangenET101-01-01
Tween-20HuShi30189328Для изготовления связывающего/промывочного буфера
UltraPure Дистиллированная водаInvitrogen10977015
VAHTS DNA Clean BeadsVazymeN411-01
для 1 для

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kapranov, P., et al. Large-scale transcriptional activity in chromosomes 21 and 22. Science. 296 (5569), 916-919 (2002).
  2. Bertone, P., et al. Global identification of human transcribed sequences with genome tiling arrays. Science. 306 (5705), 2242-2246 (2004).
  3. Carninci, P., et al. The transcriptional landscape of the mammalian genome. Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).
  4. Kapranov, P., et al. The majority of total nuclear-encoded non-ribosomal RNA in a human cell is 'dark matter' un-annotated RNA. BMC Biol. 8, 149(2010).
  5. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
  6. Kapranov, P., et al. Examples of the complex architecture of the human transcriptome revealed by race and high-density tiling arrays. Genome Res. 15 (7), 987-997 (2005).
  7. Denoeud, F., et al. Prominent use of distal 5' transcription start sites and discovery of a large number of additional exons in encode regions. Genome Res. 17 (6), 746-759 (2007).
  8. Mercer, T. R., et al. Targeted RNA sequencing reveals the deep complexity of the human transcriptome. Nat Biotechnol. 30 (1), 99-104 (2011).
  9. Deveson, I. W., et al. Universal alternative splicing of non-coding exons. Cell Syst. 6 (2), 245-255.e5 (2018).
  10. Xu, D., Tang, L., Kapranov, P. Complexities of mammalian transcriptome revealed by targeted RNA enrichment techniques. Trends Genet. 39 (4), 320-333 (2023).
  11. Amaral, P., et al. The status of the human gene catalogue. Nature. 622 (7981), 41-47 (2023).
  12. Mattick, J. S., et al. Long non-coding RNAs: Definitions, functions, challenges and recommendations. Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (6), 430-447 (2023).
  13. Bassik, M. C., et al. A systematic mammalian genetic interaction map reveals pathways underlying ricin susceptibility. Cell. 152 (4), 909-922 (2013).
  14. Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
  15. Zhu, S., et al. Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library. Nat Biotechnol. 34 (12), 1279-1286 (2016).
  16. Liu, S. J., et al. CRISPRi-based genome-scale identification of functional long non-coding RNA loci in human cells. Science. 355, 6320(2017).
  17. Bester, A. C., et al. An integrated genome-wide CRISPRa approach to functionalize lncRNAs in drug resistance. Cell. 173 (3), 649-664.e20 (2018).
  18. Liu, Y., et al. Genome-wide screening for functional long non-coding RNAs in human cells by Cas9 targeting of splice sites. Nat Biotechnol. 36, 1203-1210 (2018).
  19. Xu, D., et al. A CRISPR/Cas13-based approach demonstrates biological relevance of vlinc class of long non-coding RNAs in anticancer drug response. Sci Rep. 10 (1), 1794(2020).
  20. Noguchi, Y., Matsui, R., Suh, J., Dou, Y., Suzuki, J. Genome-wide screening approaches for biochemical reactions independent of cell growth. Annu Rev Genomics Hum Genet. 25 (1), 51-76 (2024).
  21. Recinos, Y., et al. CRISPR-dCas13d-based deep screening of proximal and distal splicing-regulatory elements. Nat Commun. 15 (1), 3839(2024).
  22. Cho, S. W., et al. Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases. Genome Res. 24 (1), 132-141 (2014).
  23. Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. Off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Mol Ther Nucleic Acids. 4 (11), e264(2015).
  24. Stojic, L., et al. Specificity of RNAi, LNA and CRISPRi as loss-of-function methods in transcriptional analysis. Nucleic Acids Res. 46 (12), 5950-5966 (2018).
  25. Gao, F., Cai, Y., Kapranov, P., Xu, D. Reverse-genetics studies of lncRNAs-what we have learnt and paths forward. Genome Biol. 21 (1), 93(2020).
  26. Leoni, C., Volpicella, M., De Leo, F., Gallerani, R., Ceci, L. R. Genome walking in eukaryotes. FEBS J. 278 (21), 3953-3977 (2011).
  27. Carette, J. E., et al. Haploid genetic screens in human cells identify host factors used by pathogens. Science. 326 (5957), 1231-1235 (2009).
  28. Carette, J. E., et al. Global gene disruption in human cells to assign genes to phenotypes by deep sequencing. Nat Biotechnol. 29 (6), 542-546 (2011).
  29. Burckstummer, T., et al. A reversible gene trap collection empowers haploid genetics in human cells. Nat Methods. 10 (10), 965-971 (2013).
  30. Carette, J. E., et al. Ebola virus entry requires the cholesterol transporter niemann-pick c1. Nature. 477 (7364), 340-343 (2011).
  31. Cao, J. Y., et al. A genome-wide haploid genetic screen identifies regulators of glutathione abundance and ferroptosis sensitivity. Cell Rep. 26 (6), 1544-1556.e8 (2019).
  32. Xu, D., et al. Evidence for widespread existence of functional novel and non-canonical human transcripts. BMC Biol. 21 (1), 271(2023).
  33. Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., Gu, J. Fastp: An ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor. Bioinformatics. 34 (17), i884-i890 (2018).
  34. Li, H. Aligning sequence reads, clone sequences and assembly contigs with bwa-mem. arXiv preprint arXiv:1303.3997. , (2013).
  35. Zang, C., et al. A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification chip-seq data. Bioinformatics. 25 (15), 1952-1958 (2009).
  36. Quinlan, A. R., Hall, I. M. Bedtools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  37. Pule, M. A., et al. Flanking-sequence exponential anchored-polymerase chain reaction amplification: A sensitive and highly specific method for detecting retroviral integrant-host-junction sequences. Cytotherapy. 10 (5), 526-539 (2008).
  38. Demeulemeester, J., De Rijck, J., Gijsbers, R., Debyser, Z. Retroviral integration: Site matters: Mechanisms and consequences of retroviral integration site selection. Bioessays. 37 (11), 1202-1214 (2015).
  39. Kvaratskhelia, M., Sharma, A., Larue, R. C., Serrao, E., Engelman, A. Molecular mechanisms of retroviral integration site selection. Nucleic Acids Res. 42 (16), 10209-10225 (2014).
  40. Ambrosi, A., et al. Estimated comparative integration hotspots identify different behaviors of retroviral gene transfer vectors. PLoS Comput Biol. 7 (12), e1002292(2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Lentivirus Integration SitesInsertional MutagenesisFunctional GenomicsForward Genetic ScreenGenome Wide ScreeningNext Generation SequencingFunctional Genomic ElementsPCR AmplificationMagnetic Bead PurificationHuman Genome Analysis

Похожие статьи