Методическая статья

Обнаружение аутоантител к MDA5 с использованием клеток HeLa и иммуноцитохимии с помощью световой микроскопии

DOI:

10.3791/67575

⸱

31 октября 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1Graduate Institute of Biomedical Sciences, China Medical University, 2College of Medicine, China Medical University, 3Rheumatology and Immunology Center, China Medical University Hospital, 4Rheumatic Diseases Research Center, China Medical University Hospital, 5Drug Development Center, China Medical University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы предоставляем пошаговую методологию иммуноцитохимии (ИКХ) для выявления анти-MDA5. Этот подход включает в себя фиксацию клеток, пермеабилизацию, инкубацию антител и методы визуализации, которые позволяют точно обнаруживать аутоантитела к MDA5, помогая в диагностике быстро прогрессирующего интерстициального заболевания легких у пациентов с миозитом.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Аутоантитела к MDA5 являются важнейшими биомаркерами дерматомиозита (СД), амиопатического дерматомиозита (КАДМ) и полимиозита (ПМ), особенно при выявлении пациентов с риском быстро прогрессирующего интерстициального заболевания легких (РП-ИЗЛ). Раннее выявление этих аутоантител имеет важное значение для улучшения результатов лечения пациентов, поскольку поздняя диагностика часто приводит к плохим прогнозам. В настоящее время радиоиммунный анализ является золотым стандартом для выявления анти-MDA5, но его использование ограничено высокой стоимостью, длительными процедурами и необходимостью специализированных знаний. Кроме того, блот-тест, широко используемый клинический инструмент, демонстрирует высокий уровень ложноположительных результатов на аутоантитела MDA5, что потенциально ставит под угрозу точность диагностики. Чтобы устранить эти ограничения, мы предлагаем нерадиоактивный, высокочувствительный и стандартизированный подтверждающий метод тестирования с использованием иммуноцитохимии (ИКХ). Этот протокол включает обработку клеток HeLa конструкцией MDA5, пермеабилизацию клеток Triton X-100 для облегчения связывания первичных аутоантител против MDA5 и обнаружение связанных антител с использованием конъюгированных ферментом вторичных антител (например, пероксидазы хрена) с хромогеном DAB для микроскопической визуализации. ICC предлагает практичный, экономически эффективный и высокочувствительный подход к визуализации аутоантител против MDA5 в клеточных структурах. Интегрируя ICC в качестве дополнительной подтверждающей процедуры, данное исследование направлено на повышение надежности обнаружения анти-MDA5, тем самым улучшая диагностические и прогностические стратегии для RP-ILD у пациентов с СД, КАДМ и ПМ.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Идиопатические воспалительные миопатии (ИИМ), обычно называемые миозитами, представляют собой гетерогенную группу аутоиммунных заболеваний, характеризующихся хроническим воспалением мышц, вариабельными клиническими проявлениями и разнообразными терапевтическими результатами. Общие симптомы включают мышечную слабость, снижение выносливости и миалгию1. К первичным подтипам ИИМ относятся полимиозит (ПМ) и дерматомиозит (СД), в то время как клинически амиопатический дерматомиозит (ИБС) характеризуется характерными кожными высыпаниями, сходными с теми, которые наблюдаются при СД, но с минимальным вовлечением мышц или без него. Основным осложнением при ПМ, СД и ИБС является интерстициальное заболевание легких (ИЗЛ), которое поражает примерно 40% пациентов и связано с повышеннойсмертностью2.

Клиническое течение и прогноз ИЗЛ при ИИМ варьируют в широких пределах. ИЗЛ, ассоциированная с СД и КАДМ (СД/КАДМ-ИЗЛ), как правило, более устойчива к лечению и имеет худший прогноз по сравнению с ПМ-ассоциированной ИЗЛ. Среди них острая или подострая ИЗЛ, которая быстро прогрессирует в течение трех месяцев3, является особенно тяжелой, с зарегистрированной пятилетней выживаемостью всего 52% по сравнению с 87% для хронической ИЗЛ, которая прогрессирует медленно или остается стабильной. Быстро прогрессирующая ИЗЛ (РП-ИЗЛ), подтип острой/подострой ИЗЛ, характеризуется быстрым началом одышки и обширным повреждением альвеол, видимым на визуализации грудной клетки. РП-ИЗЛ является опасным для жизни состоянием с плохим прогнозом, что подчеркивает настоятельную необходимость ранней диагностики и оперативного вмешательства для улучшения исходов лечения пациентов 4,5,6.

Миозит-специфические аутоантитела (МСА) стали критическими биомаркерами при миозит-ассоциированной ИЗЛ, при этом особенно важную роль играют аутоантитела к MDA5. Эти аутоантитела часто обнаруживаются у пациентов с ПМ-/СД-/КАДМ-ИЗЛ и служат важными прогностическими показателями для RP-ILD 7,8,9. MDA5 (ген 5, ассоциированный с дифференцировкой меланомы) представляет собой цитозольный рецептор распознавания образов, кодируемый индуцируемым интерфероном геном, который обнаруживает вирусную и митохондриальную двухцепочечную РНК, инициируя интерферон-опосредованные иммунные реакции10. Хотя точные патогенетические механизмы остаются неясными, считается, что аутоантитела к MDA5 нарушают функцию MDA5, тем самым способствуя аутоиммунному патогенезу.

Своевременное выявление аутоантител к MDA5 имеет важное значение для раннего выявления и лечения RP-ИЗЛ. Традиционно радиоактивно меченая иммунопреципитация (ИП) с использованием 35меченых S-метионином клеточных экстрактов K562 считалась золотым стандартом для обнаружения аутоантител к MDA511. Однако этот метод нецелесообразен для рутинного клинического использования из-за его высокой стоимости, зависимости от специализированного оборудования и обученного персонала, строгих правил утилизации радиоактивных отходов и ограниченного срока годности реагентов с радиоактивной меткой. В клинической практике в качестве альтернативы обычно используются блот-тесты; однако они связаны с высоким уровнем ложноположительных результатов на аутоантитела к MDA512,13, что вызывает опасения по поводу точности диагностики. Следовательно, существует острая потребность в надежном, нерадиоактивном подтверждающем анализе для подтверждения положительных результатов и повышения достоверности диагностики.

Чтобы восполнить этот пробел, мы предлагаем использовать иммуноцитохимию (ИКХ) в качестве дополнительного подтверждающего теста на аутоантитела к MDA5. Этот подход включает в себя трансфекцию клеток HeLa с помощью конструкции MDA5, инкубацию клеток с плазмой пациента и обнаружение связанных аутоантител против MDA5 с использованием конъюгированных ферментом вторичных антител (например, пероксидазы хрена) в сочетании с хромогенным субстратом для визуализации под световой микроскопией. ICC предоставляет нерадиоактивную, высокочувствительную и стандартизированную платформу для визуализации аутоантител против MDA5 в клеточных компартментах. Интегрируя ICC с блоттинговым анализом, этот метод направлен на снижение частоты ложноположительных результатов, повышение точности диагностики и, в конечном итоге, улучшение клинического ведения и результатов для пациентов.

Целью данного исследования является создание надежного, нерадиоактивного протокола для выявления аутоантител к MDA5, учитывающего ограничения существующих методов обнаружения и предлагающего клиницистам практический и надежный инструмент для ранней диагностики RP-ILD у пациентов с ПМ, СД и КАДМ. В сопроводительном видеоповествовании этот опасный для жизни курс в просторечии описывается как «быстрая смерть»; С научной точки зрения, это соответствует быстро прогрессирующему ILD (RP-ILD). Эта работа основана на существующих доказательствах и имеет потенциал для значительного улучшения прогностической оценки и принятия терапевтических решений в клинической практике.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Культивирование и трансфекция клеток

  1. Поддерживайте клетки HeLa с помощью модифицированной орлиной среды Dulbecco, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% антибиотика-антимикотика при температуре 37 °C во влажной атмосфере с содержаниемCO2 5%.
  2. Проходите через клетки каждые 2-3 дня или когда клетки достигают 90%-100% слияния.
  3. Засейте 7 × 104 клеток HeLa в каждую лунку 24-луночного планшета (1,9см2/лунка) за 24 ч до трансфекции, чтобы клетки достигли примерно 90% конфлюенции.
  4. Разведите по 500 нг плазмиды (pENTER-MDA5) и по 1,5 мкл трансфекционного реагента в 25 мкл восстановленной сывороточной среды.
  5. Добавьте разбавленную ДНК к разбавленному реагенту для трансфекции (соотношение 1:1). Хорошо перемешайте и выдерживайте 5 минут.
  6. Добавьте смесь к клеткам, посеянным за день до этого, и взбалтывайте, чтобы немедленно смешать ДНК-липидный комплекс. Убедитесь, что клетки на 80-90% сливаются.
  7. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C во влажной атмосфере с содержаниемCO2 5% в течение 24 ч и приступайте к выполнению ICC.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали коммерчески доступный вектор (pEnter-MDA5); Более подробную информацию можно найти в Таблице материалов. Эффективность трансфекции составляет ~50%.
    Успех трансфекции и экспрессии целевого белка может быть определен путем трансфекции клеток плазмидой, экспрессирующей флуоресцентный белок, и проведения вестерн-блоттинга для визуализации экспрессии целевого белка.

2. Фиксация клеток

  1. После инкубации промойте клетки 2 раза PBS, чтобы удалить остатки среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Промывка может быть выполнена путем встряхивания пластины на орбитальном шейкере.
  2. Зафиксируйте клетки в 4% параформальдегиде в PBS. Оставьте клетки на 15 минут при комнатной температуре.
    ВНИМАНИЕ: Параформальдегид токсичен. Используйте соответствующие рекомендации по обращению.
  3. Аспирируйте фиксирующий реагент и используйте PBS для промывания клеток 2 раза.

3. Пермеабилизация клеток

  1. Добавьте реагент Triton X-100 (0,3% в PBS) и дайте ячейкам постоять 10 минут при комнатной температуре.
  2. Через 10 минут утилизируйте моющее средство.
  3. Добавьте PBS, чтобы промыть клетки один раз.

4. Блокировка ячеек

  1. Проведите блокирование 10% фетальной сывороткой крупного рогатого скота в PBS (1x) и инкубируйте клетки в течение 1 ч при комнатной температуре.
  2. Удалите блокирующий реагент, затем добавьте PBS, чтобы промыть клетки один раз.

5. Гибридизация антител пациента

  1. Добавьте в клетки разведенную плазму пациента. Перед применением обязательно разбавьте образец пациента (1:5 000 в PBS) в PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте разбавление, чтобы усилить сигнал или уменьшить фон по мере необходимости. Чтобы обеспечить объективность результатов, персонал, проводивший тесты, не знал, какие образцы принадлежали пациентам, а какие — здоровым людям.
  2. Инкубируйте образец при температуре 4 °C в течение 12-16 часов (на ночь).
  3. После инкубационного периода извлеките образец пациента и промойте клетки 3 раза PBS.

6. Гибридизация вторичных антител

  1. Обработайте клетки разведенным конъюгированным с пероксидазой хрена козьим античеловеческим IgG (разведение 1:250 в PBS) и оставьте клетки на 1 час при комнатной температуре.
  2. Через час утилизируйте вторичные антитела.
  3. Смойте PBS 3x.

7. Окрашивание клеток

  1. После промывки ячеек окрасьте их 300 μл рабочего раствора DAB/лунка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор был приготовлен путем смешивания концентрата хромогена DAB и разбавителя DAB в соответствии с инструкциями производителя.
  2. После окрашивания клеток в течение 5 минут удалите краситель, промойте деионизированной дистиллированной водой и встряхните в течение 5 минут.

8. Противоклеточное окрашивание

  1. Противозаварить ядро клетки разведенным гематоксилином.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем Гематоксилин Гилл II в 10-кратном разведении и ждем 5 минут для процесса окрашивания.
  2. Через 5 минут утилизируйте гематоксилин, затем промойте деионизированной дистиллированной водой в течение 2 х 5 минут.

9. Наблюдение

  1. Наблюдайте за результатами окрашивания с помощью оптического микроскопа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Истинный положительный результат показывает сильное коричневое окрашивание внутри клеток HeLa, экспрессирующих MDA5; это подтверждает наличие аутоантител к MDA5 в образце пациента. Отрицательный результат показывает клетки HeLa без коричневого окрашивания, что указывает на отсутствие аутоантител к MDA5. Ложноположительный результат показывает обширное коричневое окрашивание во всех клетках, независимо от экспрессии MDA5. Это неспецифическое окрашивание, наблюдаемое при других аутоиммунных заболеваниях, необходимо отличать от истинно положительного, чтобы избежать ошибочного диагноза.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Персонал, проводивший тесты, был слеп к идентичности образцов, включая конкретных пациентов, от которых они были получены, чтобы свести к минимуму потенциальную систематическую ошибку в процессе оценки. Однако, несмотря на то, что здоровые контрольные образцы не подвергались ослеплению, они неизменно давали четкие и однозначные результаты.

На рисунке 1A показана успешная экспрессия MDA5 в клетках He...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наша методика выявления аутоантител к MDA5 на основе ICC имеет значительные преимущества по сравнению с традиционными методами, такими как блоттинг и радиоиммунный анализ. Ранее Nombel et al. сообщали о значениях чувствительности и специфичности 96% и 100% соответственно, сравнивая непрямую иммунофлюоресценцию (IIF) на MDA5-трансфицированных клетках с ИФА в когорте из 23 пациентов с анти-MDA5-положительным дерматомиозитом и 22 анти-MDA5-отрицательных пациентов контрольной

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конкурирующих интересов, о которых они могли бы заявить.

Части этой рукописи были созданы с помощью GPT-4 от OpenAI. Авторы проверили и отредактировали контент, чтобы обеспечить точность и оригинальность.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами Национального совета по науке и технике Тайваня, предоставленными Цзе-Линь Сюй (NSTC 114-2320-B-039-038 и NSTC 113-2320-B-039-032). Это исследование также было частично поддержано грантами Китайского медицинского университета и больницы, предоставленными Jye-Lin Hsu (CMU113-MF-89 и C1110812016-12).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
24-колодцевальные пластины (1,9 см²/скважины)Корнинг354541
Антибиотик-антимикотикGibco15240062
СтаканыПИРЕКС1000-600
Конические трубки (15 мл)Корнинг430052
Конические трубки (50 мл)Корнинг430290
Деионизированная дистиллированная водаНаша деионизированная дистиллированная вода производится на собственном месте с использованием системы Milli-Q (Столбец 1: Quantum TEX, SN: F4EB53476; Колонка 2: Препак, SN: F1CB11442)
Характеризованная сыворотка плодаЦитиваSH30396.03
градуированные цилиндры (50 мл)VITLAB64804
Гематоксилин Гилл IILeica3801522
Гиклон Дульбекко s Модифицированный Eagle Medium с высоким уровнем глюкозыЦитиваSH30243.02
Реагент трансфекции Липофектамина 2000Инвитроген11668019Трансфекционный реагент
MDA-5 (D74E4) Rabbit mAbТехнология клеточной сигнализации5321
Микроцентрифугные трубки (1,5 мл трубок Эппендорфа)AXYGEN142503
Opti-MEM I редуцированная сывороточная средаGibco31985070
Орбитальный шейкер (по желанию)FIRSTEKS300R
ПараформальдегидСигма-Олдрич4% в 1x PBS
PBSPRO TECHME222605
pENTER-MDA5Vigene Biosciences Inc.CH863586
Пероксидаза Affini Pure Goat Anti-Human IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch109-035-003
Контроллер пипеткиThermo Scientific130165
Пипеты ГИЛСОН
Пипетки и наконечники пипеток (10 µ L)QSP104-Q
Пипетки и наконечники пипеток (200 µ L)QSPT090-Q
Пипетки и наконечники пипеток (1000 µ L)QSP111-Q
Серологические пипетки (5 мл)Уровень звукового давления91005
Серологические пипетки (10 мл)Уровень звукового давления91010
Серологические пипетки (25 мл)Уровень звукового давления91025
Комплект для подкладки DAB SignalStainСотовая сигнализация80590,3% в PBS

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mehta, P., Machado, P. M., Gupta, L. Understanding and managing anti-MDA5 dermatomyositis, including potential COVID-19 mimicry. Rheumatol Int. 41 (6), 1021-1036 (2021).
  2. Tansley, S. L., McHugh, N. J., Wedderburn, L. R. Adult and juvenile dermatomyositis: are the distinct clinical features explained by our current understanding of serological subgroups and pathogenic mechanisms. Arthritis Res Ther. 15 (2), 211(2013).
  3. Fujisawa, T. Management of myositis-associated interstitial lung disease. Medicina. 57 (4), 347(2021).
  4. Sasaki, N., et al. Early initiation of plasma exchange therapy for a patient with anti-MDA5 autoantibody-positive dermatomyositis developing rapidly progressive interstitial lung disease. Mod Rheumatol Case Rep. 5 (1), 87-92 (2021).
  5. Go, D. J., et al. Survival benefit associated with early cyclosporine treatment for dermatomyositis-associated interstitial lung disease. Rheumatol Int. 36 (2), 125-132 (2015).
  6. Tsuji, H., et al. Multicenter prospective study of the efficacy and safety of combined immunosuppressive therapy with high-dose glucocorticoid, tacrolimus, and cyclophosphamide in interstitial lung diseases accompanied by anti-melanoma differentiation-associated gene 5-positive dermatomyositis. Arthritis Rheumatol. 72 (3), 488-498 (2020).
  7. Hozumi, H., et al. Comprehensive assessment of myositis-specific autoantibodies in polymyositis/dermatomyositis-associated interstitial lung disease. Respir Med. 122, 1-8 (2016).
  8. Nakashima, R., Hosono, Y., Mimori, T. Clinical significance and new detection system of autoantibodies in myositis with interstitial lung disease. Lupus. 25 (8), 925-933 (2016).
  9. Koga, T., et al. The diagnostic utility of anti-melanoma differentiation-associated gene 5 antibody testing for predicting the prognosis of Japanese patients with DM. Rheumatology. 51 (7), 1278-1284 (2012).
  10. Fuzzi, E., et al. Anti-MDA5 dermatomyositis: an update from bench to bedside. Curr Opin Rheumatol. 34 (6), 365-373 (2022).
  11. Sato, S., et al. Autoantibodies to a 140-kd polypeptide, CADM-140, in Japanese patients with clinically amyopathic dermatomyositis. Arthritis Rheum. 52 (5), 1571-1576 (2005).
  12. Tansley, S. L., Diederichsen, L. P., Zampeli, V. A., McHugh, N. J. The reliability of immunoassays to detect autoantibodies in patients with myositis is dependent on autoantibody specificity. Rheumatology. 59 (5), 1029-1034 (2020).
  13. Chen, Y. L., Li, A. Positive predictive value of myositis antibody line blot testing in patients with suspected idiopathic inflammatory myopathy. Muscle Nerve. 69 (3), 345-350 (2024).
  14. Nombel, A., Pin, J. J., Fabien, N., Miossec, P., Coutant, F. Evaluation of the performance of an indirect immunofluorescence assay for the detection of anti-MDA5 antibodies. Biomedicines. 10 (12), 3125(2022).
  15. Nakashima, R., Hosono, Y., Mimori, T. Clinical significance and new detection system of autoantibodies in myositis with interstitial lung disease. Lupus. 25 (8), 925-933 (2016).
  16. Sato, S., et al. Autoantibodies to a 140-kd polypeptide, CADM-140, in Japanese patients with clinically amyopathic dermatomyositis. Arthritis Rheum. 52 (5), 1571-1576 (2005).
  17. Chang, Y. C., Yang, L., Budhram, A. Positive predictive value of myositis antibody line blot testing in patients with suspected idiopathic inflammatory myopathy. Muscle Nerve. 69 (5), 626-630 (2024).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Triton X 100DAB

Похожие статьи