Обнаружение аутоантител к MDA5 с использованием клеток HeLa и иммуноцитохимии с помощью световой микроскопии

Идиопатические воспалительные миопатии (ИИМ), обычно называемые миозитами, представляют собой гетерогенную группу аутоиммунных заболеваний, характеризующихся хроническим воспалением мышц, вариабельными клиническими проявлениями и разнообразными терапевтическими результатами. Общие симптомы включают мышечную слабость, снижение выносливости и миалгию¹. К первичным подтипам ИИМ относятся полимиозит (ПМ) и дерматомиозит (СД), в то время как клинически амиопатический дерматомиозит (ИБС) характеризуется характерными кожными высыпаниями, сходными с теми, которые наблюдаются при СД, но с минимальным вовлечением мышц или без него. Основным осложнением при ПМ, СД и ИБС является интерстициальное заболевание легких (ИЗЛ), которое поражает примерно 40% пациентов и связано с повышенной^{смертностью2}.

Клиническое течение и прогноз ИЗЛ при ИИМ варьируют в широких пределах. ИЗЛ, ассоциированная с СД и КАДМ (СД/КАДМ-ИЗЛ), как правило, более устойчива к лечению и имеет худший прогноз по сравнению с ПМ-ассоциированной ИЗЛ. Среди них острая или подострая ИЗЛ, которая быстро прогрессирует в течение трех месяцев³, является особенно тяжелой, с зарегистрированной пятилетней выживаемостью всего 52% по сравнению с 87% для хронической ИЗЛ, которая прогрессирует медленно или остается стабильной. Быстро прогрессирующая ИЗЛ (РП-ИЗЛ), подтип острой/подострой ИЗЛ, характеризуется быстрым началом одышки и обширным повреждением альвеол, видимым на визуализации грудной клетки. РП-ИЗЛ является опасным для жизни состоянием с плохим прогнозом, что подчеркивает настоятельную необходимость ранней диагностики и оперативного вмешательства для улучшения исходов лечения пациентов ^4,5,6.

Миозит-специфические аутоантитела (МСА) стали критическими биомаркерами при миозит-ассоциированной ИЗЛ, при этом особенно важную роль играют аутоантитела к MDA5. Эти аутоантитела часто обнаруживаются у пациентов с ПМ-/СД-/КАДМ-ИЗЛ и служат важными прогностическими показателями для RP-ILD ^7,8,9. MDA5 (ген 5, ассоциированный с дифференцировкой меланомы) представляет собой цитозольный рецептор распознавания образов, кодируемый индуцируемым интерфероном геном, который обнаруживает вирусную и митохондриальную двухцепочечную РНК, инициируя интерферон-опосредованные иммунные реакции¹⁰. Хотя точные патогенетические механизмы остаются неясными, считается, что аутоантитела к MDA5 нарушают функцию MDA5, тем самым способствуя аутоиммунному патогенезу.

Своевременное выявление аутоантител к MDA5 имеет важное значение для раннего выявления и лечения RP-ИЗЛ. Традиционно радиоактивно меченая иммунопреципитация (ИП) с использованием ³⁵меченых S-метионином клеточных экстрактов K562 считалась золотым стандартом для обнаружения аутоантител к MDA5¹¹. Однако этот метод нецелесообразен для рутинного клинического использования из-за его высокой стоимости, зависимости от специализированного оборудования и обученного персонала, строгих правил утилизации радиоактивных отходов и ограниченного срока годности реагентов с радиоактивной меткой. В клинической практике в качестве альтернативы обычно используются блот-тесты; однако они связаны с высоким уровнем ложноположительных результатов на аутоантитела к MDA5^12,13, что вызывает опасения по поводу точности диагностики. Следовательно, существует острая потребность в надежном, нерадиоактивном подтверждающем анализе для подтверждения положительных результатов и повышения достоверности диагностики.

Чтобы восполнить этот пробел, мы предлагаем использовать иммуноцитохимию (ИКХ) в качестве дополнительного подтверждающего теста на аутоантитела к MDA5. Этот подход включает в себя трансфекцию клеток HeLa с помощью конструкции MDA5, инкубацию клеток с плазмой пациента и обнаружение связанных аутоантител против MDA5 с использованием конъюгированных ферментом вторичных антител (например, пероксидазы хрена) в сочетании с хромогенным субстратом для визуализации под световой микроскопией. ICC предоставляет нерадиоактивную, высокочувствительную и стандартизированную платформу для визуализации аутоантител против MDA5 в клеточных компартментах. Интегрируя ICC с блоттинговым анализом, этот метод направлен на снижение частоты ложноположительных результатов, повышение точности диагностики и, в конечном итоге, улучшение клинического ведения и результатов для пациентов.

Целью данного исследования является создание надежного, нерадиоактивного протокола для выявления аутоантител к MDA5, учитывающего ограничения существующих методов обнаружения и предлагающего клиницистам практический и надежный инструмент для ранней диагностики RP-ILD у пациентов с ПМ, СД и КАДМ. В сопроводительном видеоповествовании этот опасный для жизни курс в просторечии описывается как «быстрая смерть»; С научной точки зрения, это соответствует быстро прогрессирующему ILD (RP-ILD). Эта работа основана на существующих доказательствах и имеет потенциал для значительного улучшения прогностической оценки и принятия терапевтических решений в клинической практике.

1. Культивирование и трансфекция клеток

1. Поддерживайте клетки HeLa с помощью модифицированной орлиной среды Dulbecco, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% антибиотика-антимикотика при температуре 37 °C во влажной атмосфере с содержанием_CO2 5%.
2. Проходите через клетки каждые 2-3 дня или когда клетки достигают 90%-100% слияния.
3. Засейте 7 × 10⁴ клеток HeLa в каждую лунку 24-луночного планшета (1,9^см2/лунка) за 24 ч до трансфекции, чтобы клетки достигли примерно 90% конфлюенции.
4. Разведите по 500 нг плазмиды (pENTER-MDA5) и по 1,5 мкл трансфекционного реагента в 25 мкл восстановленной сывороточной среды.
5. Добавьте разбавленную ДНК к разбавленному реагенту для трансфекции (соотношение 1:1). Хорошо перемешайте и выдерживайте 5 минут.
6. Добавьте смесь к клеткам, посеянным за день до этого, и взбалтывайте, чтобы немедленно смешать ДНК-липидный комплекс. Убедитесь, что клетки на 80-90% сливаются.
7. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C во влажной атмосфере с содержанием_CO2 5% в течение 24 ч и приступайте к выполнению ICC.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали коммерчески доступный вектор (pEnter-MDA5); Более подробную информацию можно найти в Таблице материалов. Эффективность трансфекции составляет ~50%.
   Успех трансфекции и экспрессии целевого белка может быть определен путем трансфекции клеток плазмидой, экспрессирующей флуоресцентный белок, и проведения вестерн-блоттинга для визуализации экспрессии целевого белка.

2. Фиксация клеток

1. После инкубации промойте клетки 2 раза PBS, чтобы удалить остатки среды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Промывка может быть выполнена путем встряхивания пластины на орбитальном шейкере.
2. Зафиксируйте клетки в 4% параформальдегиде в PBS. Оставьте клетки на 15 минут при комнатной температуре.
   ВНИМАНИЕ: Параформальдегид токсичен. Используйте соответствующие рекомендации по обращению.
3. Аспирируйте фиксирующий реагент и используйте PBS для промывания клеток 2 раза.

3. Пермеабилизация клеток

1. Добавьте реагент Triton X-100 (0,3% в PBS) и дайте ячейкам постоять 10 минут при комнатной температуре.
2. Через 10 минут утилизируйте моющее средство.
3. Добавьте PBS, чтобы промыть клетки один раз.

4. Блокировка ячеек

1. Проведите блокирование 10% фетальной сывороткой крупного рогатого скота в PBS (1x) и инкубируйте клетки в течение 1 ч при комнатной температуре.
2. Удалите блокирующий реагент, затем добавьте PBS, чтобы промыть клетки один раз.

5. Гибридизация антител пациента

1. Добавьте в клетки разведенную плазму пациента. Перед применением обязательно разбавьте образец пациента (1:5 000 в PBS) в PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте разбавление, чтобы усилить сигнал или уменьшить фон по мере необходимости. Чтобы обеспечить объективность результатов, персонал, проводивший тесты, не знал, какие образцы принадлежали пациентам, а какие — здоровым людям.
2. Инкубируйте образец при температуре 4 °C в течение 12-16 часов (на ночь).
3. После инкубационного периода извлеките образец пациента и промойте клетки 3 раза PBS.

6. Гибридизация вторичных антител

1. Обработайте клетки разведенным конъюгированным с пероксидазой хрена козьим античеловеческим IgG (разведение 1:250 в PBS) и оставьте клетки на 1 час при комнатной температуре.
2. Через час утилизируйте вторичные антитела.
3. Смойте PBS 3x.

7. Окрашивание клеток

1. После промывки ячеек окрасьте их 300 μл рабочего раствора DAB/лунка.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор был приготовлен путем смешивания концентрата хромогена DAB и разбавителя DAB в соответствии с инструкциями производителя.
2. После окрашивания клеток в течение 5 минут удалите краситель, промойте деионизированной дистиллированной водой и встряхните в течение 5 минут.

8. Противоклеточное окрашивание

1. Противозаварить ядро клетки разведенным гематоксилином.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем Гематоксилин Гилл II в 10-кратном разведении и ждем 5 минут для процесса окрашивания.
2. Через 5 минут утилизируйте гематоксилин, затем промойте деионизированной дистиллированной водой в течение 2 х 5 минут.

9. Наблюдение

1. Наблюдайте за результатами окрашивания с помощью оптического микроскопа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Истинный положительный результат показывает сильное коричневое окрашивание внутри клеток HeLa, экспрессирующих MDA5; это подтверждает наличие аутоантител к MDA5 в образце пациента. Отрицательный результат показывает клетки HeLa без коричневого окрашивания, что указывает на отсутствие аутоантител к MDA5. Ложноположительный результат показывает обширное коричневое окрашивание во всех клетках, независимо от экспрессии MDA5. Это неспецифическое окрашивание, наблюдаемое при других аутоиммунных заболеваниях, необходимо отличать от истинно положительного, чтобы избежать ошибочного диагноза.

Персонал, проводивший тесты, был слеп к идентичности образцов, включая конкретных пациентов, от которых они были получены, чтобы свести к минимуму потенциальную систематическую ошибку в процессе оценки. Однако, несмотря на то, что здоровые контрольные образцы не подвергались ослеплению, они неизменно давали четкие и однозначные результаты.

На рисунке 1A показана успешная экспрессия MDA5 в клетках HeLa, трансфицированных с помощью конструкции pENTER-MDA5. Для валидации эффективности трансфекции ИКХ проводили с использованием коммерческого антитела против MDA5. Сильное коричневое цитоплазматическое окрашивание наблюдалось примерно в 50% трансфицированных клеток, что указывает на устойчивую экспрессию белка MDA5. Напротив, нетрансфицированные клетки, обработанные в идентичных условиях, не показали цитоплазматического окрашивания, что подтверждает специфичность антитела и отсутствие эндогенной экспрессии MDA5.

В соответствии с протоколом ICC репрезентативные образцы от анти-MDA5-положительных пациентов, подтвержденные иммунопреципитацией с радиоактивными метками, продемонстрировали прозрачное коричневое цитоплазматическое окрашивание в MDA5-экспрессирующих клетках HeLa, в то время как нетрансфицированные клетки оставались неокрашенными (рис. 1B). Этот характер окрашивания указывает на присутствие аутоантител к MDA5 в плазме крови пациента и согласуется с установленным золотым стандартом обнаружения с использованием 35S-метионин-меченых клеточных экстрактов K562.

Характеристики пациентов обобщены в Дополнительнойтаблице S1, в которой описаны клинические диагнозы, статус антител к MDA5 и классификация на три группы: анти-MDA5-положительные, ложноположительные и здоровые контрольные. В дополнение к статусу антител, в дополнительной таблице S1 теперь также обобщены демографические данные пациентов, включая возраст, пол и основной диагноз для каждой когорты. Реактивность антител была оценена полуколичественно как слабая (1+), умеренная (2+) или сильная (3+) в зависимости от интенсивности полосы, отражающей повышение уровня антител. Это обеспечивает клинический контекст для интерпретации результатов ICC, сохраняя при этом основную методологическую направленность настоящего исследования. Когорта исследования включала 10 пациентов с подтвержденными аутоантителами к MDA5 (положительная группа), 5 пациентов с аутоиммунными заболеваниями с ложноположительными результатами коммерческого блот-тестирования (ложноположительная группа) и 10 здоровых лиц (здоровая контрольная группа). Каждый образец был протестирован вместе с положительным и отрицательным контрольными показателями и проверен независимо с помощью иммунопреципитации, меченной радиоактивными веществами. Для образцов с четкими и убедительными результатами окрашивания было сочтено достаточным проведение одного прогона ICC. В тех случаях, когда окрашивание было неоднозначным или пограничным, проводилось дополнительное тестирование, включая серийные разведения и повторные анализы ICC, чтобы обеспечить точную интерпретацию. Такой подход обеспечил как методологическую строгость, так и эффективность использования ресурсов при валидации эффективности метода обнаружения на основе ICC.

Ложноположительные результаты показаны на рисунке 2. В этих образцах использовали плазму крови пациентов с аутоиммунными заболеваниями, отличными от идиопатических воспалительных миопатий (ИИМ). В отличие от рисунка 1, коричневое цитоплазматическое окрашивание широко наблюдалось во всех клетках, независимо от статуса экспрессии MDA5. Этот рисунок окрашивания указывает на неспецифическое связывание и подчеркивает возможность ложноположительных результатов в образцах от пациентов с другими аутоиммунными заболеваниями. Отрицательные результаты представлены на рисунке 3, где была протестирована плазма здоровых людей. Практически не наблюдалось коричневого цитоплазматического окрашивания ни в трансфицированных, ни в нетрансфицированных клетках HeLa, что указывает на отсутствие аутоантител к MDA5 в этих образцах.

Рисунок 1: Валидация экспрессии MDA5 и обнаружение аутоантител против MDA5 с помощью ICC. (A) Клетки HeLa, трансфицированные плазмидой, экспрессирующей MDA5, окрашивали с использованием коммерческого антитела против MDA5. Наблюдалось сильное коричневое цитоплазматическое окрашивание, указывающее на устойчивую экспрессию белка MDA5. Напротив, нетрансфицированные клетки, обработанные в идентичных условиях, не показали окрашивания, что подтверждает как специфичность антител, так и отсутствие эндогенной экспрессии MDA5. (B) Клетки HeLa, трансфицированные MDA5, инкубировали с плазмой крови пациентов, у которых был подтвержден анти-MDA5-положительный результат с помощью иммунопреципитации, меченной радиоактивными метками. Наблюдалось прозрачное цитоплазматическое коричневое окрашивание, демонстрирующее наличие аутоантител к MDA5 в образце пациента. Масштабные линейки = 50 μм. Сокращение: ICC = иммуноцитохимия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Обнаружение ложноположительных сигналов с помощью плазмы крови у пациентов с аутоиммунными заболеваниями, отличными от ИИМ. Широко распространенное коричневое цитоплазматическое окрашивание наблюдалось как в трансфицированных, так и в нетрансфицированных клетках, что свидетельствует о связывании неспецифических антител. Эти результаты иллюстрируют потенциал ложноположительного обнаружения в анализах блоттинга при использовании плазмы крови пациентов с аутоиммунными заболеваниями, не связанными с пациентами с анти-MDA5-положительным результатом IIM. Масштабные линейки = 50 μм. Сокращение: IIM = идиопатические воспалительные миопатии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Отрицательные результаты окрашивания плазмой у здоровых лиц из контрольной группы. Клетки HeLa, трансфицированные MDA5 и инкубированные с плазмой здоровых людей, практически не показали коричневого цитоплазматического окрашивания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительная таблица S1: Характеристика пациента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

У авторов нет конкурирующих интересов, о которых они могли бы заявить.

Части этой рукописи были созданы с помощью GPT-4 от OpenAI. Авторы проверили и отредактировали контент, чтобы обеспечить точность и оригинальность.