Методическая статья

Электропорация срезанных кортикальных органоидов человека для изучения функции генов

2.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67598

⸱

29 ноября 2024 г.

 ,  ,  , 
1Center for Regenerative Therapies Dresden, TUD Dresden University of Technology

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем острую генетическую манипуляцию срезанными кортикальными органоидами человека с помощью электропорации. Эти кортикальные органоидные модели особенно хорошо поддаются инъекции, поскольку желудочковые структуры могут быть легко идентифицированы после разреза, что позволяет проводить функциональное исследование развития коры головного мозга человека, нарушений развития нервной системы и эволюции коры головного мозга.

Аннотация

Органоиды коры головного мозга человека стали важными инструментами для изучения развития мозга человека, нарушений развития нервной системы и эволюции мозга человека. Исследования, анализирующие функцию генов по сверхэкспрессии или нокауту, были полезны на животных моделях и позволили получить механистическое представление о регуляции развития неокортекса. Здесь мы представляем подробный протокол CRISPR/Cas9-опосредованного острого нокаута гена путем электропорации срезанных кортикальных органоидов человека. Срез кортикальных органоидов помогает идентифицировать желудочковые структуры для инъекции и последующей электропорации, что делает эту модель особенно подходящей для острых генетических манипуляций во время развития коры головного мозга человека. Мы описываем дизайн направляющих РНК и проверку эффективности нацеливания in vitro и в кортикальных органоидах. Электропорация кортикальных органоидов выполняется на средних нейрогенных стадиях, что позволяет нацеливаться на большинство основных классов клеток в развивающемся неокортексе, включая апикальную радиальную глию, базальные клетки-предшественники и нейроны. В совокупности электропорация срезанных кортикальных органоидов человека представляет собой мощный метод исследования функции генов, регуляции генов и морфологии клеток во время развития коры головного мозга.

Введение

Неокортекс относится к внешнему покрытию полушарий головного мозга и представляет собой структуру, которая является уникальной для млекопитающих. Неокортекс представляет собой вместилище высших когнитивных функций 1,2,3,4,5. Во время развития нейральные стволовые клетки и клетки-предшественники дают начало нейронам в процессе, называемом нейрогенезом. Функциональные исследования, изучающие развитие неокортекса человека, обеспечивают основу для выяснения механизмов, лежащих в основе регуляции нервных стволовых клеток человека, нейронных патологий и эволюции человеческого мозга 2,6,7.

Исторически сложилось так, что исследования развития человеческого мозга основывались на описательных гистологических подходах с использованием посмертной ткани, а более современные системы культивирования свободно плавающих тканей позволяли проводить функциональные исследования с тканями человеческого плода 8,9. Кроме того, было показано, что мозговая ткань человеческого плода обладает способностью к самоорганизации в долговременные расширяющиеся органоиды. Исследования тканей плода позволили получить важную информацию о развитии человека11,12, однако ограниченная доступность тканей и этические соображения ограничивают их широкое применение для механистических исследований развития человеческого мозга. В последнее десятилетие были разработаны протоколы, которые позволяют получать трехмерные нейронные органоиды из плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSC), включая индуцированный человеком PSC (hiPSC)13,14.

Церебральные органоиды демонстрируют важные особенности развивающегося мозга, такие как формирование желудочковых структур, апикобазальная полярность, цитоархитектура коры головного мозга, интеркинетическая миграция ядер при делении радиальной глии и миграция нейронов. Важно отметить, что эти новые модели органоидов человека повторяют характеристики развивающегося мозга человека, которые не были хорошо смоделированы у мышей, включая эволюционно значимые ключевые типы нейронных предшественников, в частности, базальную радиальную глию (или внешнюю радиальную глию)7,14,15. Некоторые ограничения ранних протоколов церебральных органоидов, такие как проблемы с гетерогенностью органоидов, ограниченная поступление питательных веществ во внутреннее ядро и разнообразная региональная идентичность, были учтены в последних достижениях протокола, и вближайшие годы можно ожидать дальнейших улучшений. Церебральные и корковые органоиды человека быстро стали ключевыми моделями для изучения развития коры головного мозга человека20, неврологических расстройств 21,22,23,24 и эволюции мозга 25,26,27,28,29, а также для проведения широкомасштабных подходов к скринингу 30,31,32.

Для острых генетических манипуляций в основном использовались два метода на животных моделях развития неокортекса: вирусная доставка путем инфицирования клеток-мишеней33 и внутриутробная или in vitro электропорация34,35. Инъекция комплексов36-го рибонуклеопротеина (RNP) CRISPR/Cas9 в боковые желудочки с последующей электропорацией дает преимущество, заключающееся в том, что определенные области мозга могут быть нацелены на основе ориентации электродов электропорации. Электропорация включает в себя короткие электрические импульсы, которые временно увеличивают проницаемость клеточных мембран, позволяя вводить в клетки ДНК и другие заряженные молекулы. Внутриутробная электропорация была впервые проведена на мышах37, где она быстро стала широко применяемой методологией нейробиологии развития. Впоследствии метод был также применен к другим видам, таким как крыса38,39 и хорек 40,41,42, гирецефальный вид, используемый для изучения расширения неокортекса и сворачивания коры головного мозга 3,43,44,45.

Электропорация также стала важным методом в исследованиях органоидов человеческого мозга46. В церебральных органоидах электропорация применялась для визуализации морфологии клеток и нейрональных аксонов14,47, для доставки реагентов нокдауна генов 22,48,49 и для исследования функции генов при сверхэкспрессии50. Метод не ограничивается человеческими моделями, но также применяется для генетической модификации церебральных органоидов приматов50,51. Кроме того, была описана электропорация кортикальных органоидов, генерируемых в спиновом Ω вращающемся биореакторе52.

В этом протоколе мы описываем электропорацию срезанных корковых органоидов человека15 для изучения функции генов в развитии коры головного мозга. Органоиды, специфичные для областей мозга, повышают воспроизводимость и согласованность, что имеет решающее значение для успеха количественного анализа, например, при моделировании заболеваний. В протоколе15 срезанной коры головного мозга человека во время дифференцировки iPSC применяются мощные сигналы паттернинга для получения однородной популяции предшественников дорсального переднего мозга, после чего следует применение питательных сред, способствующих росту тканей с меньшим количеством инструктивных сигналов53,54. Было показано, что срез кортикальных органоидов снижает гибель клеток в результате снижения доступности питательных веществ и кислорода в органоидном ядре15. Кроме того, срезирование способствует развитию желудочковидных структур, содержащих обильную базальную радиальную глию, с устойчивым нейрогенезом, приводящим к формированию расширенной кортикальной пластинчатой области15. Повторное срез в этом протоколе также делает эти кортикальные органоиды особенно подходящими для электропорации, поскольку просветы желудочков могут быть легко идентифицированы и нацелены на них с помощью инъекции. Электропорация срезанных корковых органоидов была применена для изучения регуляторных областей генов и эволюции коры головного мозга 26,55.

Во время процедуры электропорации инъекционная смесь доставляется в просвет желудочковых структур. При приложении импульсного электрического поля смесь поглощается апикальной радиальной глией, которая выстилает желудочек. По мере того, как апикальная радиальная глия делится и дает начало более коммитированным клеткам4 типа, электропорированные агенты передаются базальным прогениторным клеткам и нейронам. Электропорированное потомство распределяется в желудочковой зоне (ВЗ) и субвентрикулярной зоне (СВЗ) через 3 дня и охватывает большую часть кортикальной стенки, включая область, подобную кортикальной пластине (СР), через 7 дней после электропорации на средних нейрогенных стадиях26,55.

Здесь мы описываем CRISPR/Cas9-опосредованное разрушение гена56 путем электропорации в срезанных корковых органоидах человека26. Кроме того, метод электропорации также может быть применен для сверхэкспрессии генов, визуализации морфологии клеток и клеточных процессов путем экспрессии флуоресцентных белков, доставки библиотек плазмид для массивных параллельных репортерных анализов (MPRA), доставки инструментов редактирования эпигенома и мечения клеток для визуализации в реальном времени.

Протокол

Все эксперименты с индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками человека (hiPSC) проводились в соответствии с этическими нормами, изложенными в Хельсинкской декларации 1964 года и одобренными Комитетом по этическому обзору Дрезденской университетской больницы (IRB00001473; IORG0001076; номер этического одобрения SR-EK-456092021).

1. Дизайн направляющих РНК для острого CRISPR/Cas9-опосредованного нокаута гена

  1. Разработайте пару направляющих РНК (гРНК), нацеленных на один и тот же экзон, с идеальным расстоянием 7-11.о. (избегая кратности 3.о.) между протоспейсерными соседними мотивами (PAM), чтобы увеличить вероятность разрушения белка с помощью программного обеспечения или онлайн-инструментов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале экзоны, кодирующие функциональные домены, должны быть целевыми. В качестве альтернативы можно выбрать первые экзоны транскрипта (рис. 1A). Выбирайте направляющие РНК на основе оценки активности (близка к 1)57 и оценки специфичности (близка к 100%)58.

2. Культивирование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека

  1. Для получения органоидов коры головного мозга человека и проверки функции гРНК используйте линию hiPSC CRTDi004-A59 , полученную от здорового донора.
  2. Культивирование ИПСК в соответствии с ранее описанным60 на 6-луночных планшетах, покрытых базальной мембраной, в среде стволовых клеток в стандартных условиях (37 °С, 5%СО2). Индуцированные ПСК следует пропускать при 80% конфлюенции с использованием фермента для диссоциации одиночных клеток с добавлением ингибитора пути ROCK (1:1000) в течение первых 24 ч.
    Примечание: Другие линии iPSC могут быть использованы для генерации органоидов и валидации гРНК.

3. Экстракция геномной ДНК из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека

  1. Используйте 2 лунки с 80%-90% конфлюентным hiPSC 6-луночного планшета для экстракции геномной ДНК. Диссоциируйте клетки от пластины с помощью фермента, чтобы получить одноклеточную суспензию. Поместите клетки в 1 мл среды стволовых клеток (общий объем), затем открутите в течение 10 минут при 600 x g и удалите надосадочную жидкость.
  2. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 250 мкл буфера для лизиса (50 мМ TrisHCl (pH 7,5), 100 мМ NaCl, 0,5 % SDS, 5 мМ ЭДТА в H2O) и 12,5 мкл протеиназы К (10 мг/мл запаса). Выдерживать в течение 2 ч при температуре 55 °C и 250 об/мин.
  3. Смешайте в 100 мкл 5 мМ NaCl. Вращайте в течение 10 минут при 18 000 x g при 4 °C и перенесите надосадочную жидкость в новые реакционные пробирки объемом 1,5 мл.
  4. Добавьте 250 мкл изопропанола, переверните пробирки несколько раз и вращайте в течение 15 минут при 18 000 x g при 4 °C.
  5. Удалите надосадочную жидкость, промойте 500 мкл 70 % EtOH (класс молекулярной биологии), переверните пробирки и отжимайте в течение 10 минут при 18 000 x g при 4 °C.
  6. Наконец, полностью удалите надосадочную жидкость, тщательно отпив ее пипетированием и прижав открытые реакционные пробирки к бумажным полотенцам.
  7. Дайте грануле высохнуть на воздухе в течение 10 минут при температурной терапии, затем растворите гранулу в 100 μл воды, не содержащей нуклеаз, в течение 30 минут при 37 °C.
  8. Измерьте концентрацию ДНК с помощью спектрометра. Выделенная геномная ДНК стабильна при -20 °C в течение нескольких месяцев.

4. Верификация распознавания матриц по гРНК (in vitro)

Примечание: В качестве первого подхода к валидации успешного распознавания матриц гРНК необходимо провести реакцию Cas9 in vitro, в которой двухцепочечная ДНК расщепляется на два фрагмента, которые можно различить с помощью электрофореза в агарозном геле 40,61,62.

  1. Для создания матрицы проводят полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с высокоточной ПЦР-мастер-смесью и 10 мкМ праймерами на геномной ДНК, выделенной из hiPSC (раздел 3), используя следующие условия циклирования: начальная денатурация при 98 °C в течение 30 с, 40 циклов [98 °C, 10 с; 60 °C, 30 с; 72 °C, 1 мин] и конечная элонгация при 72 °C в течение 5 мин.
    1. Отрегулируйте температуру отжига в соответствии с праймерами PCR. Убедитесь, что ампликон имеет размер от 800.о. до 1,5.н. с асимметричной локализацией сайтов связывания гРНК.
    2. Рассосите продукт ПЦР методом гель-электрофореза на 1,5% агарозном геле, вырежьте из геля соответствующую полосу и извлеките ДНК26.
    3. Измерьте концентрацию ДНК экстрагированного продукта ПЦР с помощью спектрометра.
  2. Соберите функциональную гРНК путем объединения 10 мкМ РНК CRISPR (crRNA, пользовательская последовательность, 100 мкМ сток) и 10 мкМ тракрРНК (100 мкМ сток) в безнуклеазном дуплексном буфере (общий объем 5 мкл). Инкубируйте смесь в течение 5 минут при температуре 95 °C, затем дайте ей остыть до комнатной температуры (RT).
  3. Создать комплекс рибонуклеопротеинов (РНП) путем объединения 10 мкМ гРНК из стадии 4.2 и 1 мкМ фермента Cas9 (из Streptococcus pyogenes, 62 мкМ стока) в PBS в течение 15 мин при ЛТ (общий объем 25 мкл).
  4. Для проведения реакции экстрагирования in vitro смешивают 1 мкМ комплекса РНП (начиная с этапа 4.3) с 0,1 мкМ матрицей ДНК (продукт ПЦР с этапа 4.1) и 1x реакционным буфером нуклеазы Cas9 (содержащим 200 мМ HEPES, 1 М NaCl, 50 мМ MgCl2, 1 мМ ЭДТА; рН 6,5; может храниться в аликвотах при -20 °С).
    1. Заполните до конечного объема 10 мкл водой, не содержащей нуклеаз.
    2. Инкубировать реакцию при 37 °C в течение 1 ч.
    3. Добавьте 2 мг/мл протеиназы К и инкубируйте еще 10 минут при 56 °C, чтобы высвободить субстрат ДНК из фермента Cas9. Храните переваренную реакционную смесь при температуре 4 °C или -20 °C до окончательного анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучшей эффективности расщепления рекомендуется использовать молярное соотношение субстрата Cas9-RNP:ДНК в соотношении 10:1. При необходимости разведите продукт ПЦР в воде, не содержащей нуклеаз, до необходимой концентрации. В качестве отрицательного контроля можно использовать реакционную смесь, в которой отсутствует либо гРНК, либо фермент Cas9.
  5. Визуализируйте расщепленные продукты с помощью электрофореза в агарозном геле на 2% агарозном геле.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале должны быть видны две полосы разного размера, а матричная полоса должна исчезнуть или быть сильно уменьшена для эффективных гРНК (рис. 1B).

5. Верификация функции гРНК в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках человека

Примечание: Рекомендуется проверить эффективность гРНК, нацеленных на ту же клеточную линию, из которой будут генерироваться кортикальныеорганоиды26. Для этого комплексы РНП, содержащие соответствующие гРНК, котрансфицируют с экспрессирующей GFP плазмидой в ИПСК, клетки культивируют в течение 3 дней, а затем выделяют геномную ДНК для анализа секвенирования. Для каждого теста на гРНК требуется примерно 200 000 клеток. Клетки не должны быть слиты более чем на 70-80% и должны быть пропущены не менее двух раз после размораживания. Важно взять с собой отрицательный контроль (gLACZ)36,63 и фиктивное состояние (нуклеофекционный раствор без РНП).

  1. За 2 ч до начала эксперимента измените среду hiPSC, включив в нее ингибитор ROCK (1:1000), чтобы повысить жизнеспособность клеток в колпаке для клеточных культур.
  2. Покройте соответствующее количество лунок 6-луночной пластины базальной мембранной матрицей.
  3. Запустите нуклеофекторную единицу («X-единица» для 16-луночных полосок) и выберите программу «ES cells, H9» в качестве предварительно запрограммированной (импульс CB150). Выберите соответствующее количество лунок полосы.
  4. Подготовьте комплексы РНП путем объединения 24 мкМ кРНК и 24 мкМ трацРНК в дуплексном буфере.
    1. Инкубируйте при температуре 95 °C в течение 5 минут, затем дайте остыть до RT, как описано в шаге 4.2.
    2. Тем временем разведите фермент Cas9 до 8 мкМ в PBS.
    3. Соедините 3 мкл гРНК и 3 мкл Cas9 и инкубируйте 15 мин в RT для сборки RNP.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Молярное соотношение 3:1 гРНК:Cas9 обеспечивает оптимальную эффективность расщепления. Чтобы протестировать гРНК в паре, подготовьте каждую РНП отдельно и соедините 1,5 мкл каждой РНП в конце.
  5. Во время 15-минутной инкубации РНП подготовьте ИППК к нуклеофекции под колпаком для клеточных культур.
    1. Замените базальное мембранное покрытие 1,5 мл среды стволовых клеток с добавлением ингибитора ROCK (1:1000) и 1x пенициллин/стрептомицин на лунку.
    2. Приготовьте раствор нуклеофекции в виде основной смеси на льду, следуя инструкциям производителя.
    3. Отделите ИПСК от планшета, чтобы получить суспензию для одного клетка (как описано в разделе 2), и подсчитайте клетки с помощью окрашивания Trypan Blue в счетной камере Нейбауэра.
    4. Гранулируйте 200 000 живых клеток на пару гРНК при 600 x g в течение 5 минут.
  6. В колпак для клеточных культур на льду добавьте 3 мкл РНП к 20 мкл нуклеофекционного раствора плюс 0,2 мкг/мкл pCAG-GFP плазмида.
  7. Ресуспендируйте гранулированные клетки в 23 мкл окончательной нуклеофекционной смеси и перенесите их в 1 лунку 16-луночной нуклеофекционной полоски на льду.
  8. Как только все условия будут в полоске, поместите ее в блок нуклеофекторной машины X за пределами колпака и нажмите кнопку «Пуск », чтобы начать нуклеофекцию.
  9. Затем транспортируют полоску нуклеофекции обратно под колпак для клеточной культуры и переносят нуклеофectированные клетки на подготовленную 6-луночную пластину, промывая полосковые лунки некоторой средой с планшета.
  10. Культивируйте ИПСК в течение 3 дней, меняя среду, содержащую 1x Пенициллин/Стрептомицин, ежедневно. Через 24 ч ингибитор ROCK больше не нужен.
  11. Проверьте наличие сигнала GFP под обычным флуоресцентным микроскопом (рис. 1C).
    1. На 3-й день отсортируйте и соберите GFP-положительные клетки с помощью сортировки флуоресцентных активированных клеток (FACS).
    2. Приготовьте сортировочный буфер с 2% FBS в PBS и поддерживайте при температуре 4 °C.
    3. Охладите настольную центрифугу до 4 °C. Подготовить реакционные пробирки объемом 1,5 мл с сортировочным буфером объемом 50 мкл, содержащим ингибитор ROCK (1:1000) для сбора клеток после FACS на льду и полистирольные пробирки с круглым дном объемом 5 мл с крышками клеточного фильтра на льду.
    4. Делают одноклеточные суспензии из нуклеофectированных клеток.
    5. Ресуспендируйте клетки в 1 мл среды стволовых клеток, содержащей ингибитор ROCK (1:1000) на образец и центрифугируйте при 600 x g в течение 5 минут.
    6. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 200 мкл сортировочного буфера с ингибитором ROCK (1:1000), затем добавьте 0,4 мкл DAPI (2 нг/мкл) для идентификации живых клеток с помощью FACS.
    7. Пипетируйте клеточный раствор через крышку сетчатого фильтра охлаждаемых трубок с круглым дном, чтобы удалить остатки клеточных комков.
      DAPI может со временем ухудшить жизнеспособность клеток, поэтому лучше всего добавлять свежий продукт в каждый образец перед сортировкой.
    8. Отсортируйте 10 000 живых GFP-положительных (DAPI-отрицательных) клеток в заранее подготовленные 1,5 мл реакционные пробирки с 50 мкл сортировочного буфера, содержащего ингибитор ROCK (на льду).
  12. После FACS непосредственно извлекают геномную ДНК из отсортированных клеток.
    1. Уменьшите собранные, отсортированные ячейки в сортировочном буфере при 600 x g в течение 10 минут.
    2. Удалите надосадочную жидкость и возьмите клеточную гранулу в 250 мкл буфера для лизиса плюс 12,5 мкл протеиназы К на образец.
    3. Продолжайте, как описано в разделе 3.
    4. Наконец, растворите гранулу ДНК в 50 мкл воды, не содержащей нуклеаз.
  13. Выполните ПЦР для создания шаблона для секвенирования по Сэнгеру, как описано в шаге 4.1. В качестве контроля используйте ДНК из условия gLACZ и праймеры, нацеленные на интересующий ген (те же праймеры, что и в разделе 4). Извлеките соответствующие полосы из электрофореза в агарозном геле, очистите его над колонкой и отправьте на секвенирование по Сэнгеру.
  14. Выровняйте результаты секвенирования по Сэнгеру с помощью попарного глобального выравнивания.
    Примечание: Успешное нацеливание может быть идентифицировано по наложенным сигналам или неполным последовательностям, возникающим в результате случайных вставок/делеций вокруг сайта связывания гРНК (рис. 1D).

6. Генерация нарезанных корковых органоидов человека

Примечание: Органоиды коры головного мозга человека (hCO) генерируются в соответствии с методом среза неокортикального органоида (SNO), как описано ранее в деталях15,60.

  1. Отделите небольшие колонии ИПСК из 1 лунки 6-луночного планшета с 1 мг/мл коллагеназы путем инкубации в течение 30-40 мин при 37 °С в инкубаторе. Тем временем покройте новую 6-луночную пластину базальной мембранной матрицей.
    1. Остановите фермент с помощью 1 мл среды стволовых клеток и соберите колонии с широким наконечником в 5 мл среды стволовых клеток в коническую пробирку объемом 15 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Любые шаги, в которых упоминаются «наконечники пипеток с широким отверстием», также могут быть выполнены с наконечниками, обрезанными до отверстия диаметром не менее 2 мм.
    2. Как только колонии осядут на дно, удалите старую среду и замените ее свежей средой стволовых клеток.
    3. С помощью наконечника с широким отверстием равномерно распределите колонии на 6-луночном планшете с покрытием 1,5 мл среды стволовых клеток на лунку.
    4. Культивируют гиПСК в течение 2-3 дней в стандартных условиях.
  2. Как только колонии ИПСК достигнут примерно 1,5 мм в диаметре, снова отделите все колонии с помощью коллагеназы 1 мг/мл путем инкубации в течение 1 ч при 37 °C.
    1. Остановите фермент с помощью 6 мл среды переднего мозга 1:15 и соберите оторвавшиеся колонии в коническую пробирку объемом 15 мл с помощью наконечников с широким отверстием.
    2. Как только колонии осядут, удалите старую среду и промойте 5 мл среды переднего мозга 1.
    3. Наконец, переведите колонии в 6-луночный планшет со сверхнизким уровнем прикрепления, содержащий 3 мл среды переднего мозга 1 на лунку с широкими наконечниками, и дайте им сформировать эмбриоидные тельца (БЭ). Этот шаг указывает на 0-й день протокола исследования кортикальных органоидов человека. С этого момента следуйте опубликованному протоколу15.
  3. На 7-й день внедрите БЭ в базальную мембранную матрицу, примерно по 20 БЭ на «печенье» и бактериологическое исследование в течение 1 недели в среду переднего мозга 2 15. На 14-е сутки механически высвобождают органоиды из матрицы и продолжают культивирование в 6-луночных сверхнизких прикрепляющих пластинах в среде переднего мозга 315 на орбитальном вибростенде при 120 об/мин.
  4. С 35-го дня к среде добавляется 1% v/v матрицы базальной мембраны.
  5. На 6-й неделе заложите органоиды в агарозу с температурой 3% с низкой температурой плавления и разрежьте на вибратоме на ломтики толщиной 500 мкм (рис. 2A, B), которые поддерживают снабжение органоидов кислородом и питательными веществами. При необходимости повторяйте нарезку органоидов каждые 4 недели.
  6. С 70-го дня культивируют органоиды в среде переднего мозга 415.

7. Электропорация срезанных кортикальных органоидов человека

Примечание: Органоиды коры головного мозга человека могут быть введены и электропорированы, как только станут видны желудочковые структуры, примерно со 2-й недели. Для органоидов на более поздних стадиях (неделя 5 и старше) электропорация наиболее эффективна, а жизнеспособность клеток наиболее эффективна, когда процедура проводится через 2 дня после среза органоидов26,55. После разреза легко идентифицировать желудочковые структуры, что способствует процедуре инъекции (рис. 2C, D). Кроме того, желудочковидные структуры остаются частично открытыми в течение некоторого времени после разрезания, что позволяет избытку раствора для инъекций выходить, что защищает целостность пояса адгезивного соединения, выстилающего желудочки. График нарезки может быть сдвинут в соответствии с графиком эксперимента. Срез следует повторять каждые 3-4 недели для долговременных культур.

  1. Вытягивайте капилляры из боросиликатного стекла для инъекций на микрокапиллярном пуллере со следующими настройками: Р 500, нагрев 600, вытягивание 30, скорость 40, время 1. Храните капилляры в большой чашке Петри, используя для фиксации скотч.
  2. В день электропорации свежеприготовьте комплекс CRISPRR/Cas9 RNP, как описано в шаге 5.4, с конечной концентрацией 24 мкМ RNP. Совместная электропорация 0,1 г/мкл pCAG-GFP плазмиды (или любого другого флуоресцентного репортера) способствует идентификации электропорированных элементов. Кроме того, добавьте 0,1% раствор Fast Green в воду в окончательную инъекционную смесь, что позволяет подтвердить успешную доставку смеси.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Составляйте отдельные смеси для каждого интересующего гена и контроля gLACZ .
  3. Подогреть раствор Tyrode (одна упаковка соли Tyrode, 1 г NaHCO3, 13 мл 1 M HEPES pH 7,25 в 1 л dH2O) до 37 °C. Храните оставшийся раствор Tyrode при температуре 4 °C в течение нескольких месяцев.
  4. Выберите hCO с хорошо развитыми желудочковыми структурами (рисунок 2E) и отбросьте все органоиды, которые не имеют желудочковых структур (рисунок 2F). Перенесите до 10 органоидов в чашку Петри диаметром 6 см, содержащую раствор Тироде, и храните оставшиеся hCOs в инкубаторе.
  5. Заполните стеклянный микрокапилляр 10 μЛ раствора для инъекций с помощью наконечника пипетки микрозагрузчика и откройте капилляр, отщипнув тонкий конец пинцетом. Проверьте, открыт ли капилляр, выпустив немного инъекционной смеси в раствор Tyrode. Выполняйте инъекции с помощью микроинъектора в непрерывном режиме с контролируемым стробированием с помощью ножного переключателя.
  6. Введите капилляр в центр желудочковых структур (рис. 2С) и введите 0,2-0,5 мкл смеси, нажав на ножной переключатель.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На один hCO может быть введено до 5 желудочков, при этом всего на репликацию обрабатывается 7-8 hCOs. В идеале следует нацеливаться на желудочки, обращенные к внешней стороне hCO, так как они, как правило, наиболее хорошо развиты (рис. 2G, H).
  7. Используйте тонкие щипцы, чтобы прижать органоид к поверхности, чтобы ограничить движения. На самом деле не хватайте органоиды (Рисунок 2C).
  8. После инъекции с помощью наконечника пипетки с широким отверстием перенесите 1-2 органоида в камеру электропорации, содержащую раствор Тироде (рис. 2C, D).
  9. Ориентируйте вводимые органоиды по направлению к электродам таким образом, чтобы апикальная радиальная глия в желудочковидных областях, обращенных к внешней стороне органоида, была нацелена.
  10. Прикрепите кабели к камере электропорации инжектируемой стороной органоида обращенной к положительному полюсу (аноду; Рисунок 2D).
  11. Нажмите кнопку Pulse аппарата электропоратора для электропорации пятью импульсами по 38 В в течение 50 мс каждый с интервалом 1 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки электропорации могут зависеть от доступного электропоратора и, возможно, потребуется оптимизировать.
  12. Повторяйте этапы инъекции и электропорации до тех пор, пока не будет обработано желаемое количество органоидов.
  13. Соберите электропорированные органоиды в среду в режиме RT до тех пор, пока не будут обработаны все образцы для одного и того же состояния. Следите за тем, чтобы они не находились за пределами инкубатора в общей сложности более 30 минут.
  14. Затем верните электропорированные hCOs в соответствующую питательную среду и культивируйте их без встряхивания в течение первых 24 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Через 2-3 дня сигнал GFP должен быть виден в электропорированных чКО под флуоресцентным стереоскопом (Рисунок 2H). Временной момент анализа после электропорации следует выбирать в зависимости от биологического вопроса, на который необходимо ответить. Через 3-7 дней GFP-положительные клетки располагаются поперек VZ, SVZ и CP15,60.

8. Фиксация и криосекция электропорированных корковых органоидов человека

  1. Зафиксировать электропорированные органоиды в 4% параформальдегиде (PFA) в течение 30 мин при RT в реакционной пробирке объемом 2 мл.
    ВНИМАНИЕ: ПФА токсичен и канцерогенен. Выполняйте любые действия с использованием ПФА под вытяжным шкафом. Настоятельно рекомендуется использовать нитриловые перчатки и защитные очки.
  2. Промыть один раз в PBS в течение 5 минут и хранить в стерильно отфильтрованной 30% сахарозе в PBS при температуре 4 °C до полного насыщения ткани сахарозой.
  3. Встраивайте фиксированные органоиды в закладную среду для замороженных образцов тканей плюс 15% сахарозы в PBS в блоках на сухом льду.
  4. Подготовьте срезы 20-30 мкм на криостате и соберите ткань на адгезивных предметных стеклах26,64.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен либо после того, как фиксированные органоиды окажутся в сахарозе (стабильно при 4 °C в течение нескольких месяцев), либо встроен в среду для встраивания (замороженные блоки могут храниться в герметичных пакетах при температуре -20 °C от нескольких месяцев до нескольких лет).

9. Иммуногистохимический анализ электропорированных корковых органоидов человека

  1. Для иммуногистохимического анализа26,64 проводят забор антигена в цитратном буфере (10 мМ цитрата натрия, 0,05% полисорбата 20 в dH2O, pH 6,0) в течение 1 ч при 70 °C на водяной бане.
  2. Промойте один раз в PBS в течение 5 минут, затем кратко высушите предметные стекла и обведите срезы восковой ручкой.
  3. Закалить с помощью 0,1 М глицина в PBS (pH 7,4) в течение 30 минут при RT, а затем дважды промыть PBS по 5 минут каждый.
  4. Покрыть срезы блокирующим буфером (10% лошадиная сыворотка, 0,1% октоксинол 9 в PBS) и инкубировать в течение 30 мин при РТ.
  5. Первичные антитела готовят в блокирующем буфере и инкубируют на срезах в течение ночи при 4 °С.
  6. На следующий день трижды промыть PBS по 5 мин каждый, инкубировать со вторичными антителами и DAPI в блокирующем буфере в течение 1 ч при РТ и снова трижды промыть PBS по 5 мин каждый.
  7. Установите предметные стекла в монтажный носитель и сделайте изображение на флуоресцентном микроскопе (рис. 3).
    Примечание: Рекомендуется включать антитело против флуорофора, используемого в смеси для инъекций, для идентификации клеток-мишеней, поскольку нативный сигнал часто гасится после фиксации. Антитела и красители, используемые для иммунофлуоресцентного окрашивания, как показано на рисунке 3, перечислены в таблице 1.

10. Верификация CRISPR/Cas9-опосредованного нокаута на уровне белка

  1. Чтобы проверить нокаут на уровне белка, проведите иммуногистохимическое исследование целевого белка на электропорированных органоидах (рис. 3I).
  2. Визуализируйте как регуляторg LACZ, так и целевые органоиды с использованием одних и тех же настроек, чтобы можно было сравнить интенсивность флуоресценции (рис. 3I, J). Делайте это зоноспецифичным образом, чтобы сравнить влияние на различные типы клеток развивающегося неокортекса. Подсчет ячеек в ImageJ/Fiji (плагин Cell Counter) или путем сегментации с помощью плагина StarDist 65.

Результаты

CRISPR/Cas9-опосредованная абляция генов требует разработки гРНК. Как правило, хорошо работает нацеливание на один из первых экзонов интересующего гена с помощью пары гРНК, расположенных на расстоянии 7-11.о. друг от друга (избегая кратных 3.о.) (рис. 1A). В качестве первого теста эффективность распознавания матрицы гРНК может быть исследована in vitro с использованием ПЦР-матрицы 26,40,62. Эффективное нацеливание и Cas9-опосредованное резание проявляются в редукции матричной ДНК и появлении продуктов расщепленной ДНК на агарозном геле (рис. 1B). Дальнейшее тестирование гРНК может быть выполнено в линии iPSC, которая используется для генерации кортикальных органоидов. Для этого требуется нуклеофекция иПСК, которая может быть визуализирована с помощью успешной экспрессии флуоресцентных репортеров (рис. 1C). Эффективное нацеливание на интересующий локус может быть проверено с помощью секвенирования по Сэнгеру, в результате чего получается хроматограмма, которая резко обрывается или накладывается вокруг сайта нацеливания (рисунок 1D) в результате спектра инделов от репарации двухцепочечного разрыва путем негомологичного соединенияконцов 66. Тесты на эффективность направляющей РНК in vitro и в клетках iPSC помогают выбрать эффективные пары гРНК для абляции генов в кортикальных органоидах.

Перед электропорацией кортикальные органоиды срезаются, что способствует идентификации просветов желудочков для инъекции электропорационной смеси (рис. 2A-C). Затем введенные органоиды переводятся в камеру электропорации (Рисунок 2D). Для электропорации следует использовать корковые органоиды с хорошо развитыми желудочковыми структурами (рисунок 2E), в то время как корковые органоиды без видимых структур следует отбросить (рисунок 2F). Смесь для электропорации содержит краситель, который позволяет визуализировать введенные желудочки во время процедуры (Рисунок 2G). Через 1-3 дня в культуре успешно целевые желудочки видны по нативному сигналу GFP под флуоресцентным микроскопом (рис. 2H).

Для углубленного гистологического анализа может быть выполнена иммуногистохимия криорезов. В идеале в электропорированном корковом органоиде присутствуют несколько целевых желудочков (рис. 3A, B). Наиболее оптимальные электропорации нацелены на желудочковые структуры во внешней области органоида, обращенной наружу (рисунок 3C), поскольку они, как правило, являются наиболее расширенными желудочками. В некоторых случаях электропорация может привести к чрезмерной гибели клеток (рис. 3D, E), например, когда концентрации плазмид слишком высоки или настройки электропорации неоптимальны. Электропорации, обращенные внутрь органоида (рис. 3F), часто затрагивают менее расширенные области желудочковидных структур по сравнению с наружными. По нашему опыту, полезно сосредоточить количественный анализ на определенных областях органоида, чтобы уменьшить изменчивость. Иногда электропорация может привести к нарушению апикальной поверхности (рис. 3G), например, когда объем инъекции слишком велик, что приводит к разрыву желудочков, или когда электрические импульсы слишком сильны, что приводит к расслоению клеток. Наконец, когда мишенью являются два соседних желудочка (рисунок 3H), может стать затруднительно определить границы корковых зон и происхождение целевых клеток.

Иммуногистохимия может быть использована для проверки успешного CRISPR/Cas9-опосредованного нокаута на уровне белка в представляющих интерес клетках (рисунок 3I), примером чего является нацеливание на белок поликомбового репрессивного комплекса 1 (PRC1) PCGF467. Интенсивность сигнала может быть проанализирована в GFP-положительных клетках в контрольных и экспериментальных условиях (рис. 3J). В качестве альтернативы, если подходящее антитело недоступно, клетки-мишени могут быть выделены с помощью FACS из кортикальных органоидов60 и дополнительно проанализированы с помощью Sanger или Next Generation Sequencing36. Кроме того, снижение уровня белка также может быть проанализировано с помощью вестерн-блоттинга.

figure-results-1
Рисунок 1: Дизайн направляющей РНК и валидация острого CRISPR/Cas9-опосредованного нокаута гена. (A) Схематическая иллюстрация стратегии дизайна направляющей РНК (гРНК) с двумя гРНК, нацеленными на экзон интересующего гена. Черными стрелками обозначены праймеры ПЦР для подготовки матриц, используемые для валидации гРНК. (B) Валидация эффективности гРНК in vitro. Амплифицированные ПЦР матрицы расщепляли с комплексами РНП. При успешном расщеплении после гель-электрофореза видны две полосы разного размера (слева), в то время как для низкоэффективных гРНК шаблон остается неразрезанным (справа). (C) Светлопольное изображение (слева), флуоресценция GFP (в центре) и объединенные изображения (справа) индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (hiPSCs) через 3 дня после нуклеофекции с комплексом RNP и плазмидой GFP. Масштабные линейки: 350 мкм. (D) Валидация эффективности гРНК в гиПСК методом секвенирования по Сэнгеру амплифицированной ДНК из GFP-положительных клеток. При успешном расщеплении двухцепочечной ДНК следы секвенирования показывают наложенные сигналы, начинающиеся с сайта-мишени гРНК (вверху, KO1). В случае неудачного нацеливания траектория последовательности ДНК остается неизменной (нижняя часть, KO2) по сравнению с контролем LACZ . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Электропорация срезанных корковых органоидов человека. (A) Схематическая иллюстрация, показывающая рабочий процесс электропорации корковых органоидов (hCOs) человека. Во-первых, hCOs разрезаются на срезы толщиной 500 мкм. Через два дня смесь РНП, содержащая плазмиду GFP и Fast Green, вводят в просветы желудочковых структур, преимущественно во внешнюю область hCOs. Для электропорации hCOs помещаются в камеру электропорации. После нескольких дней культивирования сигнал GFP может быть обнаружен в электропорированных зонах. (B) Изображения вибратомного секционирования hCOs. Органоиды погружены в 3% агарозу с низкой температурой плавления в среде в виде блока (слева). Блок разрезается на ломтики толщиной 500 мкм (середина). Нарезанные органоиды переносят обратно в чашку для культивирования с помощью наконечника пипетки с широким отверстием (справа). (C) Изображения, показывающие введение смеси, содержащей RNP, pCAG-GFP и 0,1% Fast Green, в желудочковые структуры органоидов. Органоиды погружают в раствор Тирода, а тонкий стеклянный капилляр встраивают в просвет центра желудочковых структур (слева). Щипцы используются для стабилизации органоидов (левого и среднего). Желудочки на внешней стороне органоидов являются целевыми (средними). Введенные органоиды переносятся в камеру электропорации, а затем в чашку для культивирования с широкими наконечниками пипеток (справа). (D) Изображения камеры электропорации, которая состоит из стеклянной чашки Петри и двух металлических лопастей, приклеенных к стеклу. Металлические лопасти служат электродами и содержат отверстия для крепления кабелей для подключения к электропоатору. Инжектируемая сторона hCO, видимая сквозь зеленую тень, должна быть обращена к аноду (положительный полюс, красный кабель) (справа). (E) Репрезентативные изображения hCOs с хорошо развитыми желудочковыми структурами. Более светлое кольцо представляет собой область, похожую на желудочковую зону. Более темный круг в центре желудочковой структуры представляет собой просвет и должен быть мишенью для инъекций. (F) Репрезентативные изображения hCOs без хорошо развитых желудочковых структур, которые мы не рекомендуем включать в дальнейшие эксперименты. (G) Репрезентативные изображения hCOs после введения электропорационной смеси, на которых целевые участки видны зеленым цветом (оранжевые стрелки). (H) Репрезентативное изображение hCO, показывающее нативный сигнал GFP через 24 часа после электропорации. Масштабные линейки: 100 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Иммуногистохимический анализ электропорированных срезов корковых органоидов человека. (A) Схема, представляющая электропорированный корковый органоид человека (hCO) с зеленым флуоресцентным сигналом. (B) Окрашивание DAPI (серый) и иммунофлюоресценция на GFP (зеленый) криосекционированного hCO с множественными электропорированными желудочками, через 7 дней после электропорации. (К-Н) Примеры изображений различных результатов электропорации, окрашенных для GFP (зеленый) и ядер (DAPI, серый). (C) Оптимальная электропорация с интактными ядрами (см. вставку 1, D), ненарушенной желудочковой структурой и электропорированными клетками в области, обращенной к внешней стороне органоида, который обычно наиболее расширен. (E) Пример hCO, демонстрирующего массивную гибель клеток в электропорированной области (см. также вставку 2, D), характеризующуюся маленькими, DAPI-плотными и искаженными ядрами. (F) Успешная электропорация, направленная внутрь органоида, которую часто труднее интерпретировать из-за слияния областей коры головного мозга с соседними желудочками. (G) Нарушение желудочковидных структур в центре электропорированной области (оранжевая стрелка). (H) Пример hCO, содержащего несколько меньших желудочков, которые частично слиты и, следовательно, трудно поддаются количественной оценке. (I) Окрашивание DAPI (серый) и иммунофлюоресценция для GFP (зеленый) и PCGF4 (пурпурный) через 7 дней после электропорации комплекса RNP, нацеленного на LACZ (gLACZ KO, слева) или PCGF4 (gPCGF4 KO, справа) для CRISPR/Cas9-опосредованного нокаута. Обведенные кружком клетки указывают на сниженную интенсивность PCGF4, что указывает на успешную абляцию генов. Равномерный сигнал можно увидеть в блоке управления LACZ (слева). (J) На графике показана количественная интенсивность PCGF4 после иммунофлюоресценции в GFP-положительных клетках для контроля (gLACZ KO) и KO PCGF4 (gPCGF4 KO) относительно медианы экспрессии PCGF4 в состоянии gLACZ. Каждая точка представляет собой клетку. Данные от 3-4 органоидов из двух разных партий (серой и черной) одной и той же линии hiPSC. p < 0,0001, тест Манна-Уитни. Все изображения были получены с помощью лазерного сканирующего конфокального (В, С) или флуоресцентного (Е-I) микроскопа. Изображения представляют собой проекции максимальной интенсивности z-стеков толщиной 10-15 мкм. Белыми пунктирными линиями обозначена апикальная поверхность, обращенная к просвету желудочка и наружным поверхностям hCOs. Оранжевыми пунктирными линиями обозначена граница VZ/SVZ в слившихся желудочках. Масштабные линейки: 100 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Антитела/красителиРазбавление
Курица анти-GFP1:2,000
Мышь анти-PCGF41:300
Alexa Fluor 488 Donkey Анти-Курица1:1,000
Alexa Fluor 555 Donkey Anti-Rabbit1:1,000
DAPI1 мг/мл бульона; 1:1,000

Таблица 1: Список антител и красителей и их разбавление, используемых для иммунофлуоресцентного окрашивания.

Обсуждение

Церебральные и корковые органоиды человека стали ключевыми моделями для исследования развития неокортекса головного мозга человека 7,16,17. Для моделирования заболеваний человека золотым стандартом стали изогенные линии ИПСК и органоиды68. Однако, поскольку создание новых линий iPSC является трудоемким и дорогостоящим процессом, острые манипуляции с моделями органоидов коры головного мозга для изучения функции генов получили широкое применение.

Электропорация церебральных и корковых органоидов 14,22,26,46,47,48,49,50,51,55 легко осуществима, и многие лаборатории, которые традиционно использовали животные модели для функциональных исследований, оснащены необходимыми инструментами. Для инъекции in vivo боковые желудочки обычно нацеленына 34,36,37,39,40,41,42. Они моделируются в кортикальных органоидах желудочковыми структурами с центральным просветом, который также может быть инъецирован. Электропорация кортикальных органоидов в первую очередь нацелена на конечные ножки клеток, выстилающих желудочки, обычно апикальную радиальную глию69. Эффективность нацеливания варьируется от эксперимента к эксперименту, но, как правило, после 3-7 дней электропорации можно получить от 100 до 1000 GFP-положительных клеток на один органоид. Продолжительность клеточного цикла в нейронных клетках-предшественниках человека примерно в два раза больше по сравнению с мышами, где апикальная радиальная глия имеет продолжительность клеточного цикла 14 часов, а базальные клетки-предшественники — 23 часа70 часов. Таким образом, через 3 дня в основном апикальная радиальная глия и промежуточные клетки-предшественники являются GFP-положительными, тогда как GFP-положительные клетки распределяются по всем зонам через 7 дней. GFP-сигнал все еще можно наблюдать через несколько месяцев после электропорации, при этом GFP-положительные клетки в основном представляют собой нейроны, которые разбросаны по всему органоиду, что позволяет нам анализировать морфологию отдельных клеток. Нацеливание на нейральные клетки-предшественники, выстилающие желудочек, возможно на стадиях, когда желудочковые области могут быть идентифицированы под светлопольным микроскопом. В действующем протоколе15 это возможно со 2 по 12 неделю развития корковых органоидов, после чего желудочки сокращаются и уже не видны. Для опытного экспериментатора вполне реально ввести 50-80 органоидов за один сеанс.

В то время как потомки апикальной радиальной глии наследуют реагенты, манипулирующие генами, во время деления клеток, прямое нацеливание на зрелые клетки, такие как нейроны и астроциты, невозможно при стандартном подходе к электропорации. Вместо этого методы вирусного нацеливания были применены к постмитотическим клеткам нервной системы33,71. В частности, рекомбинантные аденоассоциированные вирусы (AAV) широко используются для переноса генов в нервной системе, поскольку они легко продуцируются и трансдуцируют терминально дифференцированные клетки свысокой эффективностью. Более того, AAV могут быть нацелены на определенные субпопуляции нейронов. Различные подходы к таргетированию вирусов, включая использование адено, сендая и лентивирусов, уже были применены к церебральным и корковым органоидам 15,25,29,30,32,47,72,73,74.

Одним из ограничений протоколов церебральных органоидов является развитие некротического ядра из-за ограниченного снабжения кислородом и питательными веществами. Для улучшения жизнеспособности клеток в органоидном центре было реализовано несколько стратегий, включая культивирование органоидов во вращающихся биореакторах14,54, совместное культивирование эндотелиальных клеток или биоинженерные подходы к моделированию васкуляризации75,76, трансплантацию органоидов в модели грызунов18,77 и срез органоидов15,47. В данной работе мы использовали протокол среза кортикального органоида человека, который, как было показано, демонстрирует снижение гипоксии в органоидном ядре и поддерживает расширение желудочковых структур и пластинчатой области коры головного мозга15. Кроме того, срез церебральных органоидов также полезен для визуализации базальной радиальной глии в реальном времени, которая расположена в субвентрикулярной зоне, что позволяет создавать карты принятия решений о судьбе клеток72. Аналогичным образом, визуализация в реальном времени была использована для изучения срезов церебральных органоидов, культивируемых на границе между воздухом и жидкостью, что поддерживает выживание нейронов и рост аксонов47. Мы обнаружили, что срез органоидов коры головного мозга человека также делает эти органоидные модели особенно восприимчивыми к электропорации, поскольку желудочковые структуры могут быть легко идентифицированы после среза. Электропорация кортикальных органоидов позволяет вводить ДНК-плазмиды, классически используемые для сверхэкспрессии генов и, в последнее время, для доставки целых плазмидных библиотек55, а также инструменты редактирования генов CRISPR/Cas9 для инактивации функциигенов26.

Технология CRISPR/Cas9 произвела революцию в исследовании функции генов 56,57,58,63,66. В этом протоколе мы описали применение рибонуклеопротеиновых комплексов36 гРНК/Cas9 для острой инактивации генов в корковых органоидах человека. Первоначальная валидация эффективности гРНК проводилась in vitro, сначала в пробирке, а затем в иПСК. Мы обнаружили, что эти простые первоначальные тесты помогают выбрать перспективные пары гРНК, особенно в отсутствие работающих антител. По мере того, как все больше и больше инструментов для CRISPR/Cas9-опосредованного нокаута генов становятся охарактеризованными, первоначальные этапы валидации могут быть пропущены в будущем. В то время как секвенирование Next Generation целевых участков ДНК, выделенных из iPSCs, является более количественным и имеет более высокую информативность, мы обнаружили, что секвенирование по Сэнгеру часто может дать гораздо более быстрые результаты во время предварительного скрининга гРНК. В конечном счете, валидация эффективного редактирования CRISPR/Cas9 в кортикальных органоидах и снижение уровня белка в исследуемых клетках является наиболее убедительным доказательством успешной CRISPR/Cas9-опосредованной абляции генов.

Электропорация срезанных кортикальных органоидов человека позволяет проводить острые генетические манипуляции для исследований прироста и потери функций, визуализации морфологии клеток и нейрональных аксонов, доставки плазмидных библиотек для скрининговых подходов и массивных параллельных репортерных анализов, мечения клеток для визуализации в реальном времени и предоставления инструментов редактирования эпигенома. Таким образом, электропорация срезов корковых органоидов человека является мощным методом, который может выявить механистическое понимание развития коры головного мозга человека, нарушений развития нервной системы и эволюции коры головного мозга.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

Мы благодарны партнерам CRTD и Dresden Concept за оказанную выдающуюся поддержку, в частности, К. Нейман и ее команде в Центре инженерии стволовых клеток, Х. Хартманн и ее команде в Центре световой микроскопии, А. Гомпф и ее команде в Центре проточной цитометрии и Хартмуту Вольфу из мастерской MPI-CBG за строительство камер электропорации. Мы благодарим Джошуа Шмидта за его отзыв о рукописи. MA выражает признательность за финансирование от Центра регенеративной терапии TU Dresden, DFG (Emmy Noether, AL 2231/1-1) и Фонда Шрама.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Центрифужные пробирки из полипропилена 15 мл, коническиеCorning430791
4D-нуклеофектор Core UnitLonza
4D-Nucleofector X UnitLonza
5 мл полистирольная трубка с круглым дном и крышкой клеточного фильтраCorningFalcon 352235
6-луночная пластина, обработанная нунклономThermo Fisher140675Для ИПСК
6-луночный планшет для посева, сверхнизкоеприкрепление Corning3471Для органоидной культуры
A83-01STEMCELL Technologies72022Среда переднего мозга 1 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
воздушный компрессорAerotec
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L)Jackson Immuno Research703-545-155Вторичное антитело, RRID: AB_2340375; разведение 1:1000
Alexa Fluor 555 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)InvitrogenA-31572Вторичное антитело, RRID: AB_162543; разведение 1:1000
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA, 2 нмольИнтегрированныеИндивидуальный дизайн (заказ как 2 нмоль)
Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNAИнтегрированные технологии ДНК10725325 нмоль
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3Интегрированные технологии ДНК1081060100 и микро; g, из Streptococcus pyogenes
Amphotericin B (Fungizone)Gibco15290018среде переднего мозга 2, 3 и 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15Первичное
антитело против GFP (куриное, поликлональное)Abcamab13970RRID: AB_300798; разведение 1:2000
Первичное антитело против PCGF4 (мышиное, моноклональное)Millipore05-637 RRID: AB_309865; разведение 1:300
Флуоресцентный микроскоп ApoTomeZeiss
Ascorbic AcidSigma Aldrich1043003среде переднего мозга 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
B27-добавка (+ витамин A)Gibco17504044среда переднего мозга 3, 4    (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Набор кабелей от банана к микрограбберуHarvard Apparatus BTX45-0216
Biometra TRIO-Thermocycler (ПЦР-машина)Analytik Jena846-2-070-723
Капилляры, боросиликатное стекло с нитью, внешний диаметр 1,2 мм; Внутренний диаметр 0,69 мм; Длина 10 смНаучные продуктыBF120-69-10Необходимо натянуть до определенной толщины
CHIR-99021STEMCELL Technologies72052Передний мозг среда 2  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
коллагеназа типа IVGibco17104019
CRTDi004-AЦентр инженерии стволовых клеток в CMCB DDhttps://hpscreg.eu/cell-line/CRTDi004-AОдноклеточная адаптированная линия hiPSC от здорового донора
DAPIRoche102362760011 мг/мл в запасе, использовать 1:1000, разведенный для IF
Dibutyryl-cAMPSTEMCELL Technologies73884Среда переднего мозга 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Диметилсульфоксид (ДМСО)Sigma AldrichD2650
DMEM/F-12, HEPESFisher Scientific31330095среде переднего мозга 1, 2 и 3  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
DorsomorphinSTEMCELL Technologies72102Среда переднего мозга 1  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Dumont #55 Щипцы, стригт, 11 смFine Science Tools11295-51
ECM 830 Система электропорации прямоугольной волныHarvard Apparatus BTX45-2052
ЭтанолSigma Aldrich32205-1L-M
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)Sigma AldrichEDS-500G
Fast GreenFCF Sigma AldrichF7252
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS)GE Healthcare SH30070.03 
Пылающий/коричневый пуллер для микропипетокSutter Instrument Co.P-97Для вытягивания микрокапилляров
Geneious Prime GraphPadSoftware LLC d.b.a GeneiousSoftware версии 2024.0.5
gLACZKalebic et al., 2016; Platt et al., 20145'-TGCGAATACGCCCACGCGATCGG; подчеркнутые нуклеотиды = PAM
GlutaMAXGibco 35050038Среда переднего мозга 1, 2, 3 и 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
глицинсигма ОлдричG8898
gPCGF4 KO1this paper5'-TGAACTTGGACATCACAAATAGG (соответствует изображениям KO на рисунке 3I+J)
gPCGF4 KO2this paper5'-ACAAATAGGACAATACTTGCTGG (соответствует KO изображения на рисунке 3I+J)
HEPESсделано в доме1 M stock
Horse Serum, термоинактивированныйGibco26050088
человеческий GDNF Рекомбинантный белокThermo Fisher450-10Среда переднего мозга 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Человек/мышь/крыса BDNF рекомбинантный белок ThermoFisher450-02Среда переднего мозга 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Соляная кислота (HCl)Sigma Aldrich258148Для изготовления TrisHCl
ImmEdge (wax) PenVector LaboraoriesH-4000
Раствор инсулина для человекаSigma Aldrich  I9278Среда переднего мозга 3  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
IsopropanolFisher ScientificBP2618-1
Замена сыворотки с нокаутомGibco 10828-010Среда переднего мозга 1  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Лазерный сканирующий конфокальный 980 МикроскопZeiss
с низкой температурой плавления Агароза, ультрачистый16520100 Thermo Fisherдлявстраивания hCOs во время секционирования вибратома
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Матрица базальной мембраны, без LDEVCorning354230Для культуры
органоидовMatrigel hESC-Qualified Matrix, не содержащий LDEVCorning354277для культуры hiPSC
MgCl2, 1 мThermo FisherAM9530G
микроинъектор PicoPump + ножной переключательWorld Precision InstrumentsSYS-PV820
Наконечники для микрозагрузчиков для пипеток от 0,5 до 20 &; LEppendorf5242956003Для загрузки стеклянных капилляров
Mowiol 4-88Sigma Aldrich81381
mTeSR 1STEMCELL Technologies85850Среда стволовых клеток
N-2 добавкаGibco17502048Среда переднего мозга 2 и 3  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
NaClSigma AldrichS5886
NaHCO3Sigma AldrichS5761
NEB Next High Fidelity 2x PCR Mastermix New England BiolabsM0541S
Счетная камера NeubauerБренд718605
Нейробазальная средаGibco21103049Среда переднего мозга 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Заменимые аминокислотыGibco 11140050Среда переднего мозга 1, 2, 3 и 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Нуклеаза Дуплексный буферИнтегрированные технологии ДНК1072570
O. C. T. CompoundTissue-Tek4583Среда для встраивания для замороженного образца ткани
P3 Первичная клетка 4D-Nucleofector X Kit SLonzaV4XP-3032
ПараформальдегидFisher ChemicalP/0840/53
pCAG-GFPAddgene11150
Отслаивающая форма для встраивания усеченнаяT12Polysciences Inc.18986-1Для встраивания hCOs для вибратома и криосекции
Пенициллин-стрептомицин (10 000 Ед/мл)Gibco15140122среда переднего мозга 1, 2, 3 и 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 и для среды стволовых клеток после нуклеофекции
Чашка Петри 60 мм x 15 мм, без вентиляционных отверстий, стерильнаяCorningBP50-02
Чашка Петри Платиновая электродная камера, зазор 5 ммГарвардский аппарат BTX45-0504
Фосфатный буферный раствор (PBS)собственного
производства Протеиназа KSigma AldrichP2308From Titrachium album; 10 мг/мл стоковый
набор QIAquick Gel Extraction KitQiagen28706
Ингибитор пути RHO/ROCK (Y-27632)STEMCELL Technologies72308
SB-431542STEMCELL Technologies72232Среда переднего мозга 2  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Дигидрат цитрата натрия SigmaAldrichW302600-1KG-K
Додецилсульфат натрия (SDS)Sigma AldrichL3771
сахароза Sigma AldrichS7903
SuperFrost PlusFisher Scientific10149870
SZX10 с KL 300 LEDOlympusSZX10или альтернативный стереоскоп
Thermo ShakerGrant bioPSC24N
Triton-XSigma AldrichT9284также известный как октоксинол 9
Тризма основаSigma AldrichT1503Для производства TrisHCl
Trypan Blue Solution, 0,4%Thermo Fisher15250061
TrypLE Express Enzyme (1x)Thermo Fisher12604021Dissociation enzmye для получения одноклеточных суспензий
Tween 20Sigma AldrichP1379также известный как Polysorbate 20
Tyrode's saltSigma AldrichT2145-10x1l
Vibrating Микротом (вибратом)LeicaVT1200 S
Wide-Bore 1000 &микро; L Универсальные фильтрующие наконечникиCorningTF-1005-WB-R-S
β-меркаптоэтанолGibco 21985-023Среда переднего мозга 1, 3 и 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
технологии ДНК чашка Адгезионные слайды

Ссылки

  1. Rakic, P. Evolution of the neocortex: A perspective from developmental biology. Nat Rev Neurosci. 10 (10), 724-735 (2009).
  2. Pollen, A. A., Kilik, U., Lowe, C. B., Camp, J. G. Human-specific genetics: New tools to explore the molecular and cellular basis of human evolution. Nat Rev Genet. 24, 687-711 (2023).
  3. Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Deconstructing cortical folding: Genetic, cellular and mechanical determinants. Nat Rev Neurosci. 20 (3), 161-176 (2019).
  4. Florio, M., Huttner, W. B. Neural progenitors, neurogenesis and the evolution of the neocortex. Development. 141 (11), 2182-2194 (2014).
  5. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
  6. Bölicke, N., Albert, M. Polycomb-mediated gene regulation in human brain development and neurodevelopmental disorders. Dev Neurobiol. 82 (4), 345-363 (2022).
  7. Arlotta, P., Pasca, S. P. Cell diversity in the human cerebral cortex: From the embryo to brain organoids. Curr Opin Neurobiol. 56, 194-198 (2019).
  8. Long, K. R., et al. Extracellular matrix components HAPLN1, lumican, and collagen I cause hyaluronic acid-dependent folding of the developing human neocortex. Neuron. 99 (4), 702-719.e6 (2018).
  9. Namba, T., et al. Human-specific arhgap11b acts in mitochondria to expand neocortical progenitors by glutaminolysis. Neuron. 105 (5), 867-881.e9 (2020).
  10. Hendriks, D., et al. Human fetal brain self-organizes into long-term expanding organoids. Cell. 187 (3), 712-732.e38 (2024).
  11. Voices: The importance of fetal tissue research. Cell Stem Cell. 24 (3), 357-359 (2019).
  12. Temple, S., Goldstein, L. S. B. Why we need fetal tissue research. Science. 363 (6424), 207(2019).
  13. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  14. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  15. Qian, X., et al. Sliced human cortical organoids for modeling distinct cortical layer formation. Cell Stem Cell. 26 (5), 766-781.e9 (2020).
  16. Kelava, I., Lancaster, M. A. Dishing out mini-brains: Current progress and future prospects in brain organoid research. Dev Biol. 420 (2), 199-209 (2016).
  17. Pasca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
  18. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nat Biotechnol. 36 (5), 432-441 (2018).
  19. Andrews, M. G., et al. Lif signaling regulates outer radial glial to interneuron fate during human cortical development. Cell Stem Cell. 30 (10), 1382-1391.e5 (2023).
  20. Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
  21. Bershteyn, M., et al. Human ipsc-derived cerebral organoids model cellular features of lissencephaly and reveal prolonged mitosis of outer radial glia. Cell Stem Cell. 20 (4), 435-449.e4 (2017).
  22. Klaus, J., et al. Altered neuronal migratory trajectories in human cerebral organoids derived from individuals with neuronal heterotopia. Nat Med. 25 (4), 561-568 (2019).
  23. Qian, X., et al. Loss of non-motor kinesin KIF26A causes congenital brain malformations via dysregulated neuronal migration and axonal growth as well as apoptosis. Dev Cell. 57 (20), 2381-2396.e13 (2022).
  24. Watanabe, M., et al. Self-organized cerebral organoids with human-specific features predict effective drugs to combat zika virus infection. Cell Rep. 21 (2), 517-532 (2017).
  25. Benito-Kwiecinski, S., et al. An early cell shape transition drives evolutionary expansion of the human forebrain. Cell. 184 (8), 2084-2102.e19 (2021).
  26. Cubillos, P., et al. The growth factor epiregulin promotes basal progenitor cell proliferation in the developing neocortex. EMBO J. 43 (8), 1388-1419 (2024).
  27. Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
  28. Mora-Bermudez, F., et al. Differences and similarities between human and chimpanzee neural progenitors during cerebral cortex development. Elife. 5, e18683(2016).
  29. Pollen, A. A., et al. Establishing cerebral organoids as models of human-specific brain evolution. Cell. 176 (4), 743-756.e17 (2019).
  30. Esk, C., et al. A human tissue screen identifies a regulator of ER secretion as a brain-size determinant. Science. 370 (6519), 935-941 (2020).
  31. Fleck, J. S., et al. Resolving organoid brain region identities by mapping single-cell genomic data to reference atlases. Cell Stem Cell. 28 (6), 1177-1180 (2021).
  32. Li, C., et al. Single-cell brain organoid screening identifies developmental defects in autism. Nature. 621 (7978), 373-380 (2023).
  33. Janson, C. G., Mcphee, S. W., Leone, P., Freese, A., During, M. J. Viral-based gene transfer to the mammalian CNS for functional genomic studies. Trends Neurosci. 24 (12), 706-712 (2001).
  34. Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Dev Growth Differ. 50 (6), 507-511 (2008).
  35. Li, S., Li, Y., Li, H., Yang, C., Lin, J. Use of in vitro electroporation and slice culture for gene function analysis in the mouse embryonic spinal cord. Mech Dev. 158, 103558(2019).
  36. Kalebic, N., et al. CRISPR/cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO Rep. 17 (3), 338-348 (2016).
  37. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  38. Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of e16 rat embryos. J Vis Exp. 6, e236(2007).
  39. Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70 (4-5), 155-162 (2002).
  40. Kalebic, N., Langen, B., Helppi, J., Kawasaki, H., Huttner, W. B. In vivo targeting of neural progenitor cells in ferret neocortex by in utero electroporation. J Vis Exp. (159), e61171(2020).
  41. Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Mol Brain. 5, 24(2012).
  42. Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Biol Open. 2 (1), 95-100 (2013).
  43. Reillo, I., De Juan Romero, C., Garcia-Cabezas, M. A., Borrell, V. A role for intermediate radial glia in the tangential expansion of the mammalian cerebral cortex. Cereb Cortex. 21 (7), 1674-1694 (2011).
  44. Kalebic, N., et al. Human-specific ARHGAP11B induces hallmarks of neocortical expansion in developing ferret neocortex. Elife. 7, e41241(2018).
  45. Johnson, M. B., et al. Aspm knockout ferret reveals an evolutionary mechanism governing cerebral cortical size. Nature. 556 (7701), 370-375 (2018).
  46. Fischer, J., Heide, M., Huttner, W. B. Genetic modification of brain organoids. Front Cell Neurosci. 13, 558(2019).
  47. Giandomenico, S. L., et al. Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output. Nat Neurosci. 22 (4), 669-679 (2019).
  48. O'neill, A. C., et al. A primate-specific isoform of plekhg6 regulates neurogenesis and neuronal migration. Cell Rep. 25 (10), 2729-2741.e26 (2018).
  49. Buchsbaum, I. Y., et al. Ece2 regulates neurogenesis and neuronal migration during human cortical development. EMBO Rep. 21 (5), e48204(2020).
  50. Fischer, J., et al. Human-specific arhgap11b ensures human-like basal progenitor levels in hominid cerebral organoids. EMBO Rep. 23 (11), e54728(2022).
  51. Tynianskaia, L., Esiyok, N., Huttner, W. B., Heide, M. Targeted microinjection and electroporation of primate cerebral organoids for genetic modification. J Vis Exp. 193, e65176(2023).
  52. Denoth-Lippuner, A., Royall, L. N., Gonzalez-Bohorquez, D., Machado, D., Jessberger, S. Injection and electroporation of plasmid DNA into human cortical organoids. STAR Protoc. 3 (1), 101129(2022).
  53. Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nat Protoc. 13 (3), 565-580 (2018).
  54. Qian, X., et al. Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling zikv exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  55. Noack, F., et al. Joint epigenome profiling reveals cell-type-specific gene regulatory programmes in human cortical organoids. Nat Cell Biol. 25 (12), 1873-1883 (2023).
  56. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with crispr-cas9. Science. 346 (6213), 1258096(2014).
  57. Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgrnas for crispr-cas9-mediated gene inactivation. Nat Biotechnol. 32 (12), 1262-1267 (2014).
  58. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of crispr-cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  59. Völkner, M., et al. Hbegf-tnf induce a complex outer retinal pathology with photoreceptor cell extrusion in human organoids. Nat Commun. 13 (1), 6183(2022).
  60. Schütze, T. M., Bölicke, N., Sameith, K., Albert, M. Brain Organoid Research. , Springer US. New York, NY. (2022).
  61. ALT-R CRISPR-cas9 system-in vitro. cleavage of target DNA with RNP complex. , At https://eu.idtdna.com/pages/products/crispr-genome-editing/alt-r-crispr-cas9-system#resources (2022).
  62. Albert, M., et al. Epigenome profiling and editing of neocortical progenitor cells during development. EMBO J. 36 (17), 2642-2658 (2017).
  63. Platt, R. J., et al. CRISPR-cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  64. Florio, M., et al. Human-specific gene ARHGAP11B promotes basal progenitor amplification and neocortex expansion. Science. 347 (6229), 1465-1470 (2015).
  65. Schmidt, U., Weigert, M., Broaddus, C., Myers, G. Cell Detection with Star-Convex Polygons. , Springer International Pubs. Cham. (2018).
  66. Wang, J. Y., Doudna, J. A. CRISPR technology: A decade of genome editing is only the beginning. Science. 379 (6629), eadd8643(2023).
  67. Hoffmann, J., et al. Canonical and non-canonical PRC1 differentially contribute to the regulation of neural stem cell fate. bioRxiv. , 2024(2024).
  68. Celotti, M., et al. Protocol to create isogenic disease models from adult stem cell-derived organoids using next-generation crispr tools. STAR Protoc. 5 (3), 103189(2024).
  69. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: Toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 465-502 (2014).
  70. Arai, Y., et al. Neural stem and progenitor cells shorten s-phase on commitment to neuron production. Nat Commun. 2, 154(2011).
  71. Bedbrook, C. N., Deverman, B. E., Gradinaru, V. Viral strategies for targeting the central and peripheral nervous systems. Annu Rev Neurosci. 41, 323-348 (2018).
  72. Coquand, L., et al. A cell fate decision map reveals abundant direct neurogenesis bypassing intermediate progenitors in the human developing neocortex. Nat Cell Biol. 26 (5), 698-709 (2024).
  73. Fleck, J. S., et al. Inferring and perturbing cell fate regulomes in human brain organoids. Nature. 621 (7978), 365-372 (2023).
  74. Andersen, J., et al. Generation of functional human 3D cortico-motor assembloids. Cell. 183 (7), 1913-1929.e26 (2020).
  75. Nwokoye, P. N., Abilez, O. J. Bioengineering methods for vascularizing organoids. Cell Rep Methods. 4 (6), 100779(2024).
  76. Cakir, B., Park, I. H. Getting the right cells. Elife. 11, e80373(2022).
  77. Revah, O., et al. Maturation and circuit integration of transplanted human cortical organoids. Nature. 610 (7931), 319-326 (2022).

Перепечатки и разрешения

Теги

CRISPR Cas9
Электропорация срезанных кортикальных органоидов человека для изучения функции генов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.