Этот протокол описывает эффективный, нехирургический метод ортотопической имплантации ксенотрансплантатов, полученных от пациентов с раком молочной железы, у мышей. Метод включает в себя ферментативную диссоциацию опухоли с последующей прямой инъекцией в жировые пакеты молочной железы, что обеспечивает высокопроизводительную имплантацию. Всесторонняя валидация обеспечивает точность модели, облегчая тщательные исследования различных подтипов рака молочной железы.
Методическая статья
Высокопроизводительная диссоциация и ортотопическая имплантация ксенотрансплантатов от пациентов с раком молочной железы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Ксенотрансплантаты, полученные от пациента (PDX), представляют собой клинически значимый метод рекомитуляции типов клеток, пораженных опухолью, и микроокружения опухоли, что имеет важное значение для расширения знаний о раке молочной железы (РМЖ). Кроме того, PDX-модели позволяют изучать системные эффекты РМЖ, что невозможно при использовании моделей in vitro. Традиционные методы имплантации ксенотрансплантатов РМЖ обычно включают анестезию и стерильные хирургические процедуры, которые являются трудоемкими, инвазивными и ограничивают масштабируемость PDX-моделей в исследованиях РМЖ. Этот протокол описывает простой и масштабируемый метод ортотопической имплантации BC PDX у мышей. Для приживления PDX использовали иммунодефицитный штамм мышей NOD.Cg-PrkdcscidIl2rg tm1Wjl/SzJ (NSG). Образцы РМЖ человека, полученные от пациентов, получивших согласие IRB, были механически и ферментативно диссоциированы, а затем ресуспендированы в растворе экстракта базальной мембраны (BME) и RPMI 1640. Животных удерживали с помощью загривки, а также наносили крем для депиляции для удаления шерсти с жировых пакетов на четвертом паховом соске с последующей инъекцией. Около 2 миллионов клеток в суспензии объемом 100 мкл были двусторонне введены ортотопически в жировые пакеты молочной железы с помощью иглы 26 G. Примечательно, что анестезия не требовалась, а общее время процедуры составляло менее 5 минут, от подготовки клеток до инъекции. После периода роста в несколько месяцев опухоли были иссечены и обработаны для аутентификации. Валидация включала оценку статуса рецептора с помощью иммуногистохимии со специфическими антителами к традиционным рецепторам РМЖ (т.е. ER, PR, HER2). Морфология опухоли была подтверждена с помощью окрашивания гематоксилином и эозином (H&E), которое интерпретировалось патологоанатомом. Генетическое сходство с образцом пациента было проверено с помощью объемного секвенирования РНК и анализа коротких тандемных повторов (STR). Такой подход к приживлению и валидации PDX способствует тщательной разработке моделей и высокопроизводительной имплантации опухолей, что позволяет проводить эффективные исследования различных подтипов РМЖ.
Введение
Рак молочной железы (РМЖ) ежегодно диагностируется у более чем 2 миллионов женщин во всем мире1. Для того, чтобы углубить базовое биологическое понимание РМЖ и успешно внедрить новые методы лечения в одобренные методы лечения, необходимы доклинические модели на животных, которые сохраняют определяющие черты опухолей пациентов. Было продемонстрировано, что ксенотрансплантаты, полученные от пациента (PDX), с высокой точностью воспроизводят гетерогенность опухоли при ортотопической имплантации, включая гистопатологию, экспрессию рецепторов и генетические аберрации 2,3,4. Важно отметить, что они также сохраняют стромальные клетки, которые вносят свой вклад в микроокружение опухоли, такие как сосудистая сеть, иммунные клетки и фибробласты, ассоциированные с раком. Тем не менее, они постепенно замещаются стромальными клетками мышиного хозяина спассированием 5. PDX также позволяют изучать системные осложнения, возникающие в результате роста опухоли, такие как усталость 6,7, что в настоящее время невозможно при использовании моделей in vitro.
Однако для успешного приживления BC PDX требуется иммунодефицитная линия мышей, наиболее часто используемым штаммом которой является NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ). Мыши NSG лишены адаптивного иммунитета и демонстрируют крайне дефектный врожденный иммунитет8. Приживление BC PDX было достигнуто у других иммунодефицитных штаммов, таких как SCID/Beige (CB17.Cg-PrkdcscidLystbg-J/Crl), с аналогичными показателями приживления4.
Традиционные методы имплантации BC PDX предполагают хирургическую имплантацию фрагмента опухоли в жировую подушку9 молочной железы, и такой подход приводит к успешному приживлению с благоприятными темпами. Тем не менее, необходимость стерильных хирургических процедур и использования анестетиков делает их трудоемкими, что ограничивает количество мышей, которые могут быть имплантированы в определенное временное окно. Учитывая потенциальные прогностические преимущества PDX в отношении реакции на лекарства в опухолях и их использование в точной медицине10, наличие простого и воспроизводимого рабочего процесса для однородной имплантации PDX мышам имеет жизненно важное значение. В данной статье демонстрируется диссоциация опухолей молочной железы человека в одноклеточную суспензию и последующее ортотопическое введение в жировые пакеты молочных желез мышей с иммунодефицитом.
Протокол
Этот протокол соответствует руководящим принципам, установленным Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию Университета Западной Вирджинии (WVU). Для инъекций опухолевых клеток использовали самок мышей NOD.Cg-PrkdcscidIl2rg tm1Wjl/SzJ (NSG) в возрасте 8 недель и старше и массой около 25 г. Опухолевая ткань рака молочной железы была закуплена в Институте рака Университета Западной Вирджинии (Моргантаун, Западная Вирджиния) и Сетью кооперативных тканей человека NCI в соответствии с утвержденным протоколом Институционального наблюдательного совета WVU и Комитетом по пересмотру и мониторингу протокола Института рака WVU. От пациентов было получено информированное письменное согласие. Все процедуры проводились в асептических условиях в шкафу биологической безопасности класса II с соблюдением соответствующих протоколов использования средств индивидуальной защиты (СИЗ). Подробная информация о животных, реактивах и оборудовании, использованных в этом исследовании, представлена в Таблице материалов.
1. Высокопроизводительная ферментативная диссоциация опухолевой ткани
- Разморозьте и соедините ферменты H, R и A из набора для диссоциации опухоли человека в стерильной С-образной пробирке. Добавьте 200 мкл фермента H, 100 мкл фермента R и 25 мкл фермента A. Доведите конечный объем до ~5 мл, добавив в С-пробирку 4,7 мл стерильной среды RPMI 1640.
ПРИМЕЧАНИЕ: Модифицированная среда Dulbecco Eagle Medium (DMEM) может использоваться вместо RPMI 1640. - Фрагменты опухоли могут быть разрезаны и заморожены, как описано в существующих протоколах9. Переложите размороженные фрагменты опухоли и сопутствующую замораживающую среду на одну половину стерильной 100-миллиметровой чашки для культивирования. С помощью стерильных щипцов перенесите фрагменты опухоли в стерильную микротрубку объемом 5 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы щипцам можно использовать стерильную иглу для подкожных инъекций. Вместо микротрубки объемом 5 мл можно использовать чашку диаметром 35 мм. - Промойте фрагменты опухоли 1-3 мл стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS, 1x). Манипулируйте фрагментами в растворе с помощью щипцов, чтобы обеспечить тщательное удаление остатков замораживающей среды.
- Перенесите отмытые фрагменты в микротрубку объемом 2 мл с помощью щипцов. Нанесите на фрагменты опухоли 1 мл раствора тройного антибиотика (ТАБ) и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: При желании этот шаг можно пропустить. 10x TAB может быть получен путем растворения 1% гентамицина, 1% клиндамицина и 0,5% сульфата полимиксина B в стерильном 1x PBS. Развести до 1х раствор ТАБ в стерильном 1х PBS. - С помощью стерильных щипцов перенесите обеззараженные фрагменты в новую микротрубку объемом 5 мл. Проведите повторное промывание 1-3 мл стерильного PBS. Переложите промытые фрагменты в сухую половину 100 мм чашки для культуры с шага 1.2.
- С помощью двух стерильных лезвий скальпеля No 10 тщательно измельчите опухолевую ткань. Перенесите измельченные фрагменты опухоли на одну лопасть и поместите их в С-образную трубку, содержащую приготовленный раствор фермента. Надежно застегните крышку пробирки до тех пор, пока не почувствуется последний щелчок.
- Переверните С-образную трубку несколько раз, чтобы обеспечить равномерное распределение фрагментов опухоли в растворе фермента.
- Поместите С-образную трубку в механический диссоциатор. Переверните трубку и убедитесь, что все содержимое погружено в среду. Трубка будет находиться в автомате в перевернутом положении.
- Закрепите трубку в пазе так, чтобы вдавленная часть была обращена к оператору. Если применимо, поместите нагреватель вокруг трубки.
- Выберите программу 37C_h_TDK_3 в интерфейсе сенсорного экрана. Эта программа работает в течение 60 минут при температуре 37 °C. Для более мягких опухолей можно использовать 37C_h_TDK_1 или 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наибольшей эффективности рекомендуется подготовить мышей к инъекции в этот период диссоциации, нанеся крем для депиляции на места инъекций. - По завершении программы диссоциации осмотрите содержимое пробирки. Никаких видимых фрагментов опухоли не должно остаться.
ПРИМЕЧАНИЕ: При наличии фрагментов может потребоваться дополнительное время диссоциации. В таких случаях запустите программу еще на 20-30 минут. - Как только будет достигнута достаточная диссоциация, центрифугируйте С-образную трубку при 200 x g в течение 5-8 мин при 4 °C для гранулирования диссоциированных клеток. Осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью вакуумной аспирации или пипетки.
- Ресуспендируйте клеточную гранулу в 5-10 мл свежей среды RPMI. Перенесите клеточную суспензию в коническую трубку объемом 15 мл для облегчения манипуляций. Центрифугируйте клеточную суспензию при 200 x g в течение 5-8 мин при 4 °C. Осторожно отсасывайте надосадочную жидкость.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап можно пропустить, если гранула клетки мала. В таких случаях клетки ресуспендируются непосредственно в нужном объеме среды, а затем соединяются с экстрактом базальной мембраны (Матригель) для минимизации потери клеток. - Ресуспендируйте клеточную гранулу в объеме RPMI 1640, что эквивалентно половине желаемого конечного объема впрыска. RPMI 1640 и Matrigel будут объединены в соотношении 1:1 об/в, с конечным объемом впрыска 100 мкл на место инъекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для двусторонней инъекции 4 мышам общий необходимый объем составляет 800 мкл. Поэтому повторно суспендируйте элементы в не менее 400 мкл RPMI 1640. Чтобы учесть потенциальную потерю объема, рекомендуется добавить дополнительные 20% к конечному объему, сохранив соотношение 1:1 v/v. В качестве альтернативы вместо RPMI 1640 можно использовать DMEM или 1x PBS. - Подсчитайте ресуспензированные клетки с помощью гемоцитометра или автоматизированного метода. Разбавляйте по мере необходимости, чтобы достичь желаемой концентрации для инъекций. Предполагается, что исходной точкой является примерно 1-2 миллиона клеток на место инъекции.
- В микроцентрифужной пробирке объемом 2 мл с круглым дном смешайте желаемое количество разбавленной клеточной суспензии в RPMI с равным объемом Matrigel. Аккуратно перемешайте суспензию путем повторного пипетирования для обеспечения однородности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следуя предыдущему шагу, добавьте 400 мкл разбавленной клеточной суспензии в 400 мкл Matrigel. Учитывайте количество используемых инъекционных игл и связанные с этим потери объема. Держите Матригель на льду все время. Не размораживайте его до тех пор, пока клетки не будут восстановлены, так как он быстро затвердеет. Рекомендуется поддерживать небольшие аликвоты (например, 120 мкл) для быстрого размораживания и комбинирования в пробирке объемом 2 мл. - Поддерживайте клеточную суспензию на льду до тех пор, пока она не будет готова к инъекции.
2. Ортотопическое введение пахового жирового пакета из диссоциированного PDX
- Определите массу каждой мыши с помощью откалиброванного веса. Нанесите тонкий слой крема для депиляции на целевое место (места) инъекции. С помощью стерильного ватного тампона массирующими движениями массирующими движениями попеременно по часовой стрелке и против часовой стрелки, чтобы способствовать быстрому удалению шерсти.
- Удалите излишки шерсти и крем для депиляции с помощью стерильной марлевой губки, пропитанной солевым раствором. Обеспечьте полное удаление волос в области инъекций.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте 60 с воздействия крема для депиляции, чтобы предотвратить раздражение кожи. Мышей можно побрить перед нанесением крема для депиляции, чтобы еще больше минимизировать время воздействия. Этот шаг может быть выполнен во время диссоциации опухоли для оптимизации эффективности времени и минимизации продолжительности хранения клеточной суспензии на льду.
- Удалите излишки шерсти и крем для депиляции с помощью стерильной марлевой губки, пропитанной солевым раствором. Обеспечьте полное удаление волос в области инъекций.
- Проведите тщательный визуальный осмотр каждой мыши, чтобы оценить пригодность для инъекций. Оцените наличие любых признаков боли, дистресса, болезни или других противопоказаний.
- С помощью шприца объемом 1 мл без прикрепленной иглы аккуратно аспирируйте клеточную суспензию вверх и вниз, чтобы обеспечить однородность. Прикрепите иглу 26 G к шприцу объемом 1 мл и извлеките желаемый объем инъекции. Удалите пузырьки воздуха из шприца легкими постукиваниями или щелчками.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется не превышать 600 мкл на шприц для облегчения инъекции одной рукой. - Подготовленный шприц расположите горизонтально на верхней части емкости со льдом, при этом игла должна быть направлена в сторону от оператора. Расположите контейнер со льдом и иглу на той же стороне, что и доминирующая рука оператора или предпочитаемая рука для инъекции. Извлеките мышь из корпуса и продезинфицируйте место инъекции с помощью спиртовой салфетки для очищения.
- Надежно зафиксируйте мышь, крепко взявшись за спинную кожу на затылке и спине. Обеспечьте достаточную иммобилизацию, чтобы четко обнажить жировые пакеты молочных желез. Паховый жировой пакет молочной железы охватывает от соска до верхней части бедра. Он может наблюдаться в виде мягкой, розоватой ткани в описываемой области под кожей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Помощник оператора может использовать плоские щипцы для сжатия и поднятия кожи, содержащей жировую подушку. Этот метод помогает гарантировать, что оператор, выполняющий инъекцию, успешно нацелится на жировой пакет. - Поместите мышь в положение лежа на спине. Введите иглу (скос вверх) под углом 45 градусов, направив к бедру примерно на 0,5-1 см каудально к жировой подушке, регулируя длину иглы.
- Введите иглу в жировую подушку. Контролируемым образом вводите желаемый объем клеточной суспензии. Эффективная скорость впрыска поможет свести к минимуму беспокойство животных при длительном удержании.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму страдания животных, максимальная продолжительность непрерывного ручного удержания не должна превышать 30 с. Если продолжительность удерживания превышает 30 с, животное следует выпустить в клетку для восстановления перед второй попыткой.
- Введите иглу в жировую подушку. Контролируемым образом вводите желаемый объем клеточной суспензии. Эффективная скорость впрыска поможет свести к минимуму беспокойство животных при длительном удержании.
- После инъекции поверните иглу на 180 градусов (скос вниз). Сохраняйте положение иглы на короткое время перед медленным выводом, чтобы свести к минимуму потерю клеток в месте инъекции. При возникновении кровотечения при необходимости наложите стандартную марлю или кровоостанавливающую марлю.
- Повторите шаги 2.6 и 2.7 для контралатерального жирового пакета, если требуются двусторонние инъекции. Для нескольких животных при необходимости повторяйте шаги 2.2-2.7.
3. Последующие процедуры
- Утилизируйте все острые предметы в специальные контейнеры для острых предметов. Утилизируйте все остальное содержимое в соответствующие контейнеры для отходов.
- Если во время инъекции возникает кровотечение, наблюдайте за мышами в течение как минимум 1 часа после инъекции, чтобы убедиться в гемостазе.
- Контролируйте массу тела на еженедельной основе. Оцените объем опухоли после того, как рост станет ощутимым.
Результаты
В этом исследовании представлен эффективный и нехирургический подход к ортотопической имплантации ксенотрансплантатов рака молочной железы у мышей. Опухолевую ткань молочной железы диссоциировали с помощью специфичных для человека ферментов и механического перемешивания, ресуспендировали в соотношении 1:1 об/в Матригеля: RPMI 1640 и вводили ортотопически в паховые жировые пакеты молочных желез мышей NSG (рис. 1 и рис. 2). Чтобы обеспечить достоверность PDX-моделей, соответствие исходного образца опухоли пациента с пассажированными опухолями было проверено с помощью установленных гистопатологических и геномных методов. Экспрессию рецепторов профилировали с помощью иммуногистохимического окрашивания (ИГХ) стандартных рецепторов рака молочной железы, включая рецептор эстрогена (ER), рецептор прогестерона (PR) и рецептор эпидермального фактора роста человека 2 (HER2) (рис. 3). Клеточную морфологию оценивали с помощью гематоксилина и эозина (H&E) окрашивания срезов опухоли и экспертной интерпретации окрашенных срезов патологоанатомами. Сохранение генетического ландшафта и удержание клеток человека было подтверждено с помощью объемного секвенирования РНК и аутентификации с короткими тандемными повторами (STR) (Рисунок 4 и Таблица 1). Кроме того, тестирование патогенов не выявило загрязнения пациента или пройденных образцов опухоли, что является важным этапом проверки, учитывая использование иммунодефицитных мышей.
Рисунок 1: Обзор протокола. Визуализация процесса диссоциации опухоли и инъекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Мышей NSG готовили к инъекции с помощью крема для депиляции, наносимого чередующимися движениями по часовой стрелке и против часовой стрелки для тщательного удаления шерсти из области пахового жирового пакета молочной железы (рис. 2А). Излишки крема для депиляции вытирали с открытой кожи живота с помощью стерильной марли, а область дезинфицировали спиртовой салфеткой (рис. 2В). Стерильную иглу, загруженную диссоциированными опухолевыми клетками, располагали под углом примерно 45 градусов 0,5-1 мм каудально к жировым пакетам четвертого пахового соска (рис. 2C). Опухолевые клетки вводили контролируемым образом в жировые пакеты четвертого пахового соска (рис. 2D). Рост опухоли первоначально обнаруживался при пальцевой пальпации жировых пакетов. В дальнейшем количественно отслеживали прогрессию объема опухоли с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ) (рис. 2E). Как масса тела (Рисунок 2F), так и объем опухоли (Рисунок 2G) измерялись еженедельно для мониторинга колебаний веса и прогрессирования объема опухоли. Опухоли были визуально осмотрены для выявления ран, таких как изъязвления, которые потребовали бы преждевременного прерывания. Успешное двустороннее приживление PDX в паховых жировых пакетах молочной железы показано на рисунке 2H, а жировые пакеты после иссечения опухолей показаны на рисунке 2I.
Рисунок 2: Подготовка мышей, инъекция PDX и мониторинг прогрессирования опухоли. (A) Жировые пакеты молочной железы были тщательно депилированы. (B) Представление места инъекции с четкой видимостью целевых зон инъекции. (C) Положение шприца на жировой подушке, обычно 0,5-1 мм каудально к жировой подушке в зависимости от длины иглы. Белая стрелка указывает на целевую область для иглы при введении. (D) Изображение инъекции диссоциированных клеток в жировой мешок молочной железы левого четвертого пахового соска. Иглу следует держать под углом примерно 45 градусов, как показано для инъекции. (E) Репрезентативное МРТ-изображение двусторонне привитых опухолей в месте инъекции. Опухоли выделены зеленым цветом. (F) Репрезентативная прогрессия массы тела в граммах после введения опухолевых клеток (n = 5). Темно-синяя линия представляет собой простую линейную регрессию, которая значительно отлична от нуля (p < 0,0001); Мыши получали в среднем 22 мг.день-1. Темно-синее затенение — это 95% доверительный интервал, светло-голубое затенение — 95% интервал прогнозирования, а оранжевые линии — продольные измерения массы тела. (G) Репрезентативная прогрессия отдельных объемов опухоли вмм3 после введения опухолевой клетки (n = 10). Темно-синяя линия представляет экспоненциальную регрессию; Время удвоения объема опухоли составило 19,08 дня. Темно-синее затенение — это 95% доверительный интервал, светло-голубое затенение — 95% интервал прогнозирования, а оранжевые линии — продольные объемы опухоли. (H) Успешное двустороннее приживление PDX-клеток в паховые жировые пакеты молочной железы. Обратите внимание, что васкуляризация может наблюдаться при снабжении каждой опухоли. Белыми стрелками обозначены опухоли. (I) Область пахового жирового пакета молочной железы после иссечения опухолей. (Х,И) Единицы измерения на линейке указаны в см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Репрезентативный PDX (PEN_056) был получен от 31-летней женщины европеоидной расы с инвазивной карциномой молочной железы стадии 3А. Первичная опухоль, собранная из правой молочной железы, имела рецепторный статус ER и PR-отрицательный, HER2-положительный (ER-PR-HER2+). Окрашивание ИГХ рецепторов ER, PR и HER2 показало соответствие между пациентом и опухолями PDX (рис. 3). Тем не менее, PDX демонстрирует большую экспрессию HER2, что может быть связано с избирательным ростом клеток HER2+. Патологоанатомическая оценка окрашенных срезов H&E подтвердила наличие низкодифференцированной карциномы с последовательной морфологией и цитологией как у пациента, так и у PDX (рис. 3).
Рисунок 3: Окрашивание рецепторов ИГХ и H&E. (Левая колонка) Окрашивание ИГХ рецепторов ER, PR и HER2 и окрашивание H&E в опухоли пациента. Пятна ER и PR не показывают явного положительного окрашивания, как и ожидалось. Пятна HER2 демонстрируют положительный результат на HER2 (коричневый). (Правая колонка) ИГХ-окрашивание рецепторов ER, PR и HER2 и окрашивание H&E в пассажированном образце PDX. Окрашивание рецепторов очень похоже на то, которое наблюдается в образце пациента, хотя HER2 демонстрирует большую экспрессию после пассирования. Масштабная линейка: 50 μм; увеличение: 20x. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Генотипирование с короткими тандемными повторами (STR) подтвердило сходство >80% между 13 аутосомными локусами, определенными в соответствии с консенсусными рекомендациями ASN-0002-2022 Американской коллекции клеточных культур типов (ATCC) плюс 3 дополнительных локуса (Таблица 1). Объемное секвенирование РНК (РНК-секвенирование) образца опухоли пациента и PDX подтвердило эквивалентные уровни выравнивания с последним референсным геномом человека (T2T CHM13v2.0), при этом 82,3% и 79,1% прочтений совпадали, соответственно. Кроме того, опухоль пациента и PDX показали сильную положительную корреляцию со значением Пирсона r 0,9559 (рис. 4A). Анализ обогащения набора генов, сравнивающий PDX и опухоль пациента, показал, что 10 наиболее значимых обогащенных путей биологических процессов онтологии генов были преимущественно иммунологическими наборами генов, что позволяет предположить, что большая часть транскрипционной вариативности между PDX и опухолью пациента происходит от недостатка иммунных клеток в образце PDX (рис. 4B).
| Д5С818 | D13S317 | Д7С820 | VWA | ТХ01 | ЕСМЬ | ТПОКС | КСФ1ПО | D3S1358 | Д21С11 | Д18С51 | Penta_E | Penta_D | D8S1179 | ФГА | |
| Опухоль пациента | 12 13 | 8 8 | 8 9 | 17 17 | 9 9.3 | X X | 8 10 | 15 16 | 29 31.2 | 16 19 | 12 13 | 14 14 | 10 14 | 21 25 | |
| Опухоль PDX | 13 14 | 8 8 | 8 9 | 17 17 | 9 9.3 | X X | 10 10 | 15 15 | 29 29 | 16 19 | 12 13 | 14 14 | 10 14 | 21 25 |
Таблица 1: Аутентификация с коротким тандемным повтором (STR).
Рисунок 4: Корреляция секвенирования РНК и обогащение набора генов. (A) Точечная диаграмма, визуализирующая нормализованное количество log2 на миллион (CPM) для всех генов опухоли пациента (ось x) и PDX (ось y). Была обнаружена сильная положительная корреляция со значением Пирсона r 0,9559. (B) Ридж-графики для 10 наиболее обогащенных наборов генов онтологии биологических процессов при сравнении PDX и PDX. опухоль пациента. Кривые отображают распределение баллов обогащения для каждого набора генов; color представляет q-значение FDR для каждого набора генов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Обсуждение
В данной статье представлен эффективный, высокопроизводительный метод ортотопической имплантации PDX BC в жировые пакеты паховой молочной железы мышей с иммунодефицитом. Этот оптимизированный рабочий процесс позволяет одному исследователю имплантировать PDX десяткам мышей в день, поддерживая крупномасштабные и достаточно мощные исследования. Способность к одновременной диссоциации и имплантации нескольких уникальных PDX также позволяет использовать прецизионные онкологические подходы. Помимо экономии времени, диссоциация опухолей создает однородную суспензию типов клеток, которая равномерно распределяется между мышами. По нашему опыту, такая гомогенность способствует постоянному приживлению и темпам роста опухоли.
Несмотря на то, что этот протокол в целом эффективен, в некоторых сценариях может потребоваться его изменение. Например, стандартное время работы механического диссоциатора в 1 час иногда оказывается недостаточным для полной диссоциации опухолевой ткани. Крепко сжимая С-образную трубку, несколько раз поверните ее вниз, чтобы на дне скопилась любая случайная ткань. Если видимые фрагменты ткани остались, продолжайте диссоциацию и повторно осматривайте с интервалом в 15 минут. Важно отметить, что некоторые ткани, особенно волокнистые или жировые, могут сопротивляться диссоциации и требовать ручного удаления, чтобы предотвратить засорение иглой во время инъекции.
Мы рекомендуем использовать самую маленькую измерительную иглу (27 G или 26 G), чтобы свести к минимуму стресс животного и снизить риск обратного тока клеток из места инъекции, который может повлиять на успех приживления и скорость роста опухоли. Однако, если остаются недиссоциированные ткани или жировые фрагменты, может потребоваться игла большего калибра (16 G или 18 G), хотя и с повышенным риском кровотечения или потери клеток. Независимо от выбранного калибра иглы, мастерство обращения с животными является наиболее важным компонентом для эффективного выполнения инъекций. В этом протоколе не используется анестезия, и хотя это экономит время, это также позволяет животному иметь определенную подвижность при выполнении инъекций. Если при загривке не достигнута достаточная фиксация, резкие движения конечностей могут привести к проколу сосудов, созданию выходной раны, препятствующей удержанию клеток, или проколам брюшной стенки. Настоятельно рекомендуется попрактиковаться в инъекциях перед введением ценных клеток.
Описанная техника диссоциации обладает высокой переносимостью и может быть использована при имплантации многих других типов опухолей как для ортотопических, так и для подкожных моделей. Однако, по крайней мере, в контексте РМЖ, следует избегать подкожной имплантации. Ортотопическая инъекция BC PDX приводит к превосходной васкуляризации приживленной опухоли хозяина по сравнению с подкожной, а имплантация пахового жирового пакета приводит к более высокой скорости приживления, чем грудной жировой пакет11. Кроме того, ортотопически имплантированные PDX имеют более короткое время приживления и более быструю скорость роста по сравнению сподкожными инъекциями. Следует также отметить, что, хотя диссоциация способствует быстрой инъекции опухолевых клеток, она по своей сути приводит к потере межклеточного контекста; Таким образом, это может быть подходящим подходом не во всех случаях. В случаях, требующих аутентичного клеточного взаимодействия (например, пространственная транскриптомика опухолей), может быть предпочтительным введение измельченных фрагментов опухоли или имплантация фрагментов.
Несмотря на важность исследований PDX, использование иммунодефицитных мышей накладывает определенные ограничения. С точки зрения логистики требуется полностью стерильная среда, включая жилье, пищу и воду. Это также обуславливает необходимость создания специальных жилых помещений для животных с иммунодефицитом, чтобы снизить риск заражения, что потенциально увеличивает затраты на содержание. Эта повышенная восприимчивость к инфекциям является причиной того, что перед диссоциацией рекомендуется инкубация фрагментов опухоли антибиотиками. Тем не менее, некоторые исследования показали, что использование антибиотиков в клеточных культурах приводит к изменениям в профилях экспрессии генов. Учитывая это, исследователи должны оценивать использование антибиотиков для каждого исследования. В то время как эффективное отсутствие иммунной системы позволяет PDX приживаться, оно также исключает изучение многочисленных эффектов иммунной системы на прогрессирование РМЖ14.
Этот метод демонстрирует высокую точность обработки образцов опухоли пациента. Гистопатологическая аутентификация подтвердила соответствие пассаженного PDX относительно образца опухоли пациента, как и ожидалось. Высокая степень выравнивания прочтений с геномом человека убедительно свидетельствует о том, что PDX поддерживает высокий процент клеток человека после пассажа. Это также подтверждается сходством профилей STR в >80% и сильной положительной корреляцией в данных РНК-секвенирования между опухолью пациента и PDX. Молекулярные адаптации в периферических тканях мышей PDX после роста опухоли молочной железы также согласуются с молекулярными адаптациями у пациентов с РМЖ у человека. Объемный анализ РНК-секвенирования и протеомный анализ скелетных мышц у мышей с РМЖ PDX поразительно согласуются с молекулярными изменениями в биопсии мышц, полученных у пациентов с диагнозом ранней стадии РМК 6,7. В совокупности сходство профилирования STR и РНК-секвенирования в сочетании с последовательной адаптацией в периферических тканях обеспечивает убедительные данные для использования мышей BC PDX в доклинических испытаниях.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет никаких конфликтов интересов, которые они могли бы раскрыть.
Благодарности
Мы хотели бы выразить признательность за щедрый вклад пациентов, предоставивших образцы опухолей для разработки PDX. Emidio Pistilli признает значительный вклад Ханны Уилсон, доктора медицинских наук. Это исследование было поддержано следующими организациями: Национальные институты артрита, скелетно-мышечных и кожных заболеваний (NIAMS) под премией No R01AR079445 (Pistilli); Основной центр геномики WVU (U54GM104942); Центр моделирования и визуализации животных WVU (P20GM121322, U54GM104942, P20GM144230, P30GM103488); Национальный институт общих медицинских наук под номером P20GM121322 (Локман). Рисунок 1 был создан с помощью BioRender.com.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1 мл туберкулинового шприца | BD | 305945 | стерильный |
| 1x фосфатный буферный раствор, pH 7,4 | Gibco | 10010023 | стерильный |
| 2,0 мл круглодонная микроцентрифужная пробирка | Eppendorf | 0030123620 | стерильная |
| игла 26 G, ½ in. | BD | 305111 | стерильная |
| микропробирка 5,0 мл | Eppendorf | 0030119401 | стерильная |
| 8+ неделя NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) мыши | The Jackson Laboratory | #005557 | |
| Спиртовые прокладки | Fisher Scientific | 22-363-750 | стерильный |
| экстракт базальной мембраны (Matrigel) | Cultrex | 3632-005-02 | |
| Аппликаторы с ватными наконечниками, 6 дюймов. | Fisher Scientific | 22-029-553 | стерильные |
| изогнутые щипцы со средними незазубренными наконечниками, 152 мм | Электронная микроскопия Sciences | 50-365-845 | стерильный |
| крем для депиляции | Nair | ||
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Octo диссоциатор с нагревателями | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| No 10 лезвия скальпеля | Fisher Scientific | 12-000-162 | стерильные |
| нетканые марлевые губки, 4x4 дюйма | Fisher Scientific | 22-028-558 | стерильные |
| RPMI 1640 1x + L-глутамин | Gibco | 11875093 | стерильный |
| набор для диссоциации опухоли, человек | Miltenyi Biotec | 130-095-929 |
Ссылки
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 3 (3), 209-249 (2021).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nat Med. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Cancer Res. 73 (15), 4885-4897 (2013).
- Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. J Hematol Oncol. 13 (1), 1-16 (2020).
- Wilson, H. E., et al. Human breast cancer xenograft model implicates peroxisome proliferator-activated receptor signaling as driver of cancer-induced muscle fatigue. Clin Cancer Res. 25 (7), 2336-2347 (2019).
- Wilson, H. E., et al. Skeletal muscle reprogramming by breast cancer regardless of treatment history or tumor molecular subtype. NPJ Breast Cancer. 6 (1), 18(2020).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2Rγnull mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J Immunol. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- DeRose, Y. S., et al. Patient-derived models of human breast cancer: Protocols for in vitro and in vivo applications in tumor biology and translational medicine. Curr Protoc Pharmacol. 14, Unit14.23(2013).
- Whittle, J. R., Lewis, M. T., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. Patient-derived xenograft models of breast cancer and their predictive power. Breast Cancer Res. 17 (1), 17(2015).
- Fleming, J. M., Miller, T. C., Meyer, M. J., Ginsburg, E., Vonderhaar, B. K. Local regulation of human breast xenograft models. J Cell Physiol. 224 (3), 795-806 (2010).
- Okano, M., et al. Orthotopic implantation achieves better engraftment and faster growth than subcutaneous implantation in breast cancer patient-derived xenografts. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 25 (1), 27-36 (2020).
- Ryu, A. H., Eckalbar, W. L., Kreimer, A., Yosef, N., Ahituv, N. Use antibiotics in cell culture with caution: Genome-wide identification of antibiotic-induced changes in gene expression and regulation. Sci Rep. 1 (1), 7533(2017).
- Amens, J. N., Bahçecioglu, G., Zorlutuna, P. Immune system effects on breast cancer. Cell Mol Bioeng. 14 (4), 279-292 (2021).
Перепечатки и разрешения
