Методическая статья

Комплексный подход к микробной изоляции из туннелей гнойного гидраденита

DOI:

10.3791/67630

⸱

7 февраля 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Dr. Phillip Frost Department of Dermatology and Cutaneous Surgery, University of Miami Miller School of Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы демонстрируем метод успешной изоляции привередливых и анаэробных организмов из кожных синусовых ходов (туннелей) в тканях, иссеченных у пациентов с гнойным гидраденитом.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гнойный гидраденит (ГС) — это изнурительное состояние, характеризующееся болезненными узелками и абсцессами, прогрессирующими в синусовые тракты (туннели) в дермальных слоях кожи, вызывая значительный дискомфорт, неприятные выделения, обезображивание, контрактуры и рубцы, которые серьезно снижают качество жизни. СГ связан с изменениями в микробиоме кожи, влияя на иммунную регуляцию и защиту кожи от вредных бактерий. Несмотря на распространенность, вклад микробиома HS в патологию заболевания и ограниченный ответ на лечение остаются в значительной степени неизвестными. На сегодняшний день в ходе многочисленных исследований секвенирования 16S рРНК в тканях ГС была достигнута только зернистость на уровне рода, выявлено увеличение количества грамотрицательных анаэробов и уменьшение кожных комменсалов. Более глубокое понимание микробного дисбактериоза у людей с СГ имеет важное значение для оптимизации стратегий лечения. Это требует двустороннего подхода к оценке микробиома HS, включая выделение видов бактерий, которые часто недостаточно используются в трансляционных исследованиях, посвященных кожным заболеваниям. Выделение отдельных микроорганизмов из тканей ГС имеет решающее значение для выяснения роли бактерий в патогенезе ГС. В этой статье мы выделяем воспроизводимые методы успешной изоляции анаэробных патогенов из туннельной ткани ГС, обеспечивая первый и наиболее важный шаг в понимании роли бактерий в ГС. Этот метод прокладывает путь к целенаправленным исследованиям микробного вклада в СГ и к разработке более эффективных, персонализированных стратегий лечения, направленных на устранение сложного микробного бремени этого хронического заболевания.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гнойный гидраденит (ГС) является распространенным дерматологическим заболеванием, характеризующимся узелками и абсцессами, которые прогрессируют в синусовые тракты (туннели), образующиеся в дермальном и подкожном слоях кожи, вызывая значительную боль, вызывая гнойные выделения, обезображивание и изнурительные психосоциальные последствия 1,2. СГ непропорционально поражает женщин и лиц с цветной кожей, обычно возникающей в позднем подростковом или раннем взрослом возрасте2. Тяжелые физические симптомы этого состояния усугубляются его глубокими психосоциальными последствиями, включая депрессию, тревогу и социальную изоляцию, которые могут серьезно снизить качество жизни3. Туннели ГС, сформированные на поздней стадии заболевания, значительно снижают вероятность ответа пациентов на апробированную в настоящее время биологическую терапию, а хирургическое иссечение остается единственным подходом к лечению 4,5.

Многочисленные исследования охарактеризовали микробиом, связанный с туннелями HS, показав преобладание анаэробных патогенов и снижение численности кожных комменсалов 6,7,8, при этом недавние исследования выявили Porphyromonas spp. (тип I) и Prevotella spp. (IV) в туннелях, среди других родов9. В другом исследовании была обнаружена вариабельность микробиома HS в зависимости от глубины забора образца ткани, что подтверждает уникальность микробного состава в ткани туннеля10. Кроме того, было показано, что дисбиоз влияет на иммунный ответ при СГ, что еще больше указывает на роль микробов в патогенезе заболевания 11,12,13,14. Несмотря на то, что длительное системное лечение антибиотиками клиндамицином, рифампицином и тетрациклинами используется и показало снижение количества дренажных туннелей у пациентовс ГС, данные об устойчивых к антибиотикам анаэробных патогенах при ГС остаются неизвестными. До сих пор не сообщалось об изоляции штаммов бактерий из туннелей HS, что ограничивает исследования новых антимикробных методов лечения и углубленную оценку вклада патогенов в патогенез заболевания HS. Стандартизация методов выделения патогенов не только способствовала бы истинному пониманию роли бактерий в патогенезе СГ, но и позволила бы перейти к более целенаправленным и усовершенствованным вмешательствам.

В этой статье мы расскажем о методе успешной изоляции микроорганизмов из туннельной ткани HS. Выделение отдельных видов бактерий является решающим, начальным шагом в понимании их роли в патологии СГ. Этот метод прокладывает путь к целенаправленным исследованиям микробного вклада в СГ и к разработке более эффективных, персонализированных стратегий лечения, направленных на борьбу с бактериальными патогенами при этом хроническом состоянии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол был одобрен Институциональным наблюдательным советом (IRB) при Университете Майами (протокол #20200187). Информированное согласие получают от пациентов (n = 18, средний возраст ± стандартное отклонение = 30,9 ± 9,4, 12 женщин, 6 мужчин) с диагнозом HS-туннели и/или их законных опекунов до начала процедуры после предварительного обсуждения исследований, чтобы можно было решить любые опасения или вопросы.

1. Забор образцов у пациента

  1. Перед обработкой иссеченной ткани соблюдайте строгие стерильные меры предосторожности, чтобы свести к минимуму риск заражения. Человек, работающий с тканью, должен быть одет в лабораторный халат, маску для лица и хирургическую шапочку, а также использовать стерильные перчатки и стерильные инструменты для работы с тканью.
  2. Для контроля стерильности перед обработкой ткани погрузите предварительно автоклавированные щипцы в анаэробный транспортный флакон (Таблица материалов).
  3. Соберите кожную ткань, хирургически резецированную с помощью скальпеля или лазера CO2 , из пораженных участков пациентов с диагнозом HS-туннели и немедленно поместите ее в стерильную чашку Петри с помощью стерильных щипцов для дальнейшей обработки.
  4. Находясь в хирургическом центре или амбулаторном кабинете клиники, определите туннели в иссеченных тканях, прощупывая кожу предварительно автоклавированными щипцами, как показано на рисунке 1A.
  5. Сразу после иссечения тканей проведите 6-миллиметровую пункционную биопсию через полнотолщину кожи идентифицированного туннеля и погрузите в полутвердую буферную среду с восстановителями в анаэробной системе транспортных стеклянных флаконов для оптимизации выживаемости анаэробных видов бактерий для дальнейшего анализа.
  6. Транспортировка туннельной ткани в анаэробных флаконах в лабораторию на льду.
  7. Выполните разработку образца документации, как описано ниже.
    1. В день процедуры соберите информацию о пациенте, включая демографические данные, возраст, этническую принадлежность/расу и принимаемые лекарства, без каких-либо личных идентификаторов. Участки тела резецированной ткани сопровождают карту тела, поскольку туннели HS могут возникать на нескольких участках тела. Сделайте фотографии иссеченной ткани с обеих сторон образца до и после обработки ткани, документируя местоположение биопсии, полученной из туннеля. По прибытии в лабораторию занесите закодированные образцы тканей без каких-либо персональных идентификаторов в электронную защищенную базу данных.

2. Обработка кожи HS

  1. Настройка и нанесение покрытия
    1. Наденьте лабораторный халат и перчатки, а также завяжите волосы, чтобы избежать загрязнения. Предварительно подогреть кровяные агаровые тарелки, в том числе агар Laked Brucella с агаром Канамицин и Ванкомицин (LKV), Триптиказ Соевый агар (TSA II) 5% Овечья кровь (SB), Brain Heart Infusion (BHI) и Фенилэтиловый спиртовой агар (PEA) с 5% SB агаром до 37 °C в инкубаторе в течение 10 минут. Перед обработкой салфетки очистите шкаф биобезопасности с 70% этанолом.
    2. После того, как агаровые пластины нагреются, наклейте на основание или боковую сторону пластины закодированное название образца и дату. Поместите в шкаф биобезопасности автоклавные щипцы, скальпели, предварительно стерилизованные петли для инокуляции и агаровые пластины.
    3. Извлеките 6-миллиметровый пунш-биопсию из анаэробного транспортного флакона с помощью стерильных щипцов, погрузив щипцы в среду. Быстро измельчите ткань на небольшие кусочки, примерно по 1 мм2 каждая, с помощью стерильного скальпеля. Поместите ткань в стерильную микроцентрифужную пробирку, содержащую 500 μл армированной клостридиальной среды (RCM), и кратковременно сделайте вихрь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гомогенизация не использовалась, потому что образцы подвергались воздействию аэробной среды в течение длительного периода времени, что могло привести к дополнительной аэрации во время процесса и потенциальной потере анаэробных бактерий.
    4. Используя новую стерильную петлю, выполните повторное полосирование квадрантной суспензии, содержащей бактериальные организмы, на агаровые планшеты TSA II 5% SB, LKV, PEA с 5% SB и BHI.
    5. Используя оставшуюся измельченную тканевую суспензию, сделать запасы глицерина, добавив в криопробирку 20% v/v стерильного глицерина и 80% v/v тканевой суспензии. Запасы глицерина хранятся при температуре 80 °C. В случае ограниченной жизнеспособности выделенных бактерий для повторения выделения можно использовать запасы тканей.
    6. Поместите все планшеты в инкубатор при температуре 37 °C в анаэробную камеру, закрытую пакетом CO2 . Проверяйте пластины каждые 2-3 дня, ожидая роста анаэробов через 7-14 дней после нанесения покрытия. Документируйте морфологию колоний с помощью фотографирования пластин.
  2. Хранение тканей
    1. Используйте 8-миллиметровую пункционную биопсию для сбора дополнительных образцов кожи на всю толщину через туннель и от него для образца с фиксированным парафином формалина (FFPE) и гистологической оценки, так как больший образец ткани с большей вероятностью захватит весь туннель.
    2. Сохраните дополнительные биопсии с точностью до 6 мм для ДНК (мгновенной заморозки), РНК (в РНК позже) и выделения белков (мгновенной заморозке).
  3. Содержание колонии
    1. После того, как колонии будут замечены на оригинальных пластинах, сфотографируйте пластины и обратите внимание на четкую морфологию колоний17. В целом, можно предположить 10-15 различных морфологий колоний (см. рис. 1).
    2. Приготовьте предварительно подогретые пластины LKV, BHI, PEA с 5% SB и 5% SB агаровыми пластинами TSA II (Таблица материалов). Пометьте каждую табличку с указанием идентификатора образца, места проведения биопсии и даты.
    3. С помощью стерильного наконечника для пипетки возьмите одну колонию и проведите ею зигзагообразным движением по пластине того же типа, на которой она была обнаружена. Затем, используя один и тот же наконечник пипетки с колонией в качестве матрицы для ПЦР-амплификации 16s рДНК, выполните следующие действия.
    4. Повторите шаг 2.3.3, используя колонии, выбранные из всех типов агаровых планшетов, с новым стерильным наконечником пипетки и другой отдельной колонией, морфологией которой отличается от исходной пластины. Опять же, сразу после нанесения полос, используйте наконечник пипетки с оставшейся колонией, чтобы погрузить его в специальную лунку для ПЦР-планшета, так как это обеспечит шаблон для амплификации ПЦР.
    5. Повторяйте шаги 2.3.3-2.3.4 для каждой отдельной колонии до тех пор, пока все колонии со специфической морфологией во всех четырех типах агаровых пластин не будут проточены полосами и соответствующие лунки ПЦР не будут одновременно инокулированы.
    6. Храните только что покрытые агаровые пластины в инкубаторе при температуре 37 °C в анаэробной камере, закрытой пакетом CO2 . Как только колонии вырастут, обеспечьте чистоту изолированной колонии, прежде чем сохранять бактериальные запасы (см. ниже). Если пластинчатые колонии не имеют однородности, повторите шаг 2.3.3. Выполняйте процесс повторного покрытия каждые 4-5 дней, в зависимости от роста колонии, пока колонии не станут однородными по внешнему виду.
  4. Идентификация видов бактерий с помощью секвенирования колонии 16s рДНК с помощью ампликона
    1. Приготовьте ПЦР-планшет с мастер-смесью, состоящей из 2,5 мкл 10 мкМ 16S рДНК V1-V3 прямого (5' AGAGTTTGATTCCTGGCTCAG-3') и обратного праймеров (5' AGAGTTTGATTCCTGGCTCAG-3'; 10 μM), 12,5 мкл 2x полимеразы Master Mix и 10 мкл воды без микробной ДНК на лунку общим объемом 25 мкл на колонию.
    2. Рассчитать необходимый для амплификации объем мастер-смеси ПЦР из всех выбранных колоний, отрицательный контроль (без шаблона) и положительный контроль - можно использовать любой лабораторный штамм; мы обычно используем Staphylococcus aureus USA300.
    3. Поднесите ПЦР-планшет в шкаф биобезопасности, накрыв лунки во избежание загрязнения. Для нанесения покрытия используйте одну колонию из стерильного наконечника для дозатора. Немедленно восстановите суспендию колонии с помощью тщательного закручивания в предназначенную лунку с предварительно заполненной мастер-смесью. Используйте один и тот же наконечник для пипетки как для субкультивирования, так и для отбора проб для ПЦР.
    4. Повторите шаг 2.4.3 для всех единичных колоний HS и положительного контроля.
    5. Провести ПЦР по следующему протоколу: 95 °C в течение 5 мин для начальной денатурации, необходимой для лизирования выбранной колонии, затем 40 циклов 95 °C в течение 15 с, 54 °C в течение 1 мин, использование заключительного цикла 4 °C не является обязательным. Термоамплификатор также можно использовать с теми же настройками программы.
    6. Запустите гель-электрофорез с амплифицированными продуктами количественной ПЦР для проверки размера ампликона, который, как ожидается, составит 311.о. (Рисунок 2). Компания Purify успешно амплифицировала фрагмент 16s рДНК с помощью набора для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями производителя.
    7. Отправьте очищенный продукт ПЦР на секвенирование 16S рибосомальной РНК по Сэнгеру с использованием прямых и обратных праймеров 16S рДНК V1-V3.
  5. Бактериальные запасы
    ПРИМЕЧАНИЕ: Привередливые анаэробы известны своей ограниченной жизнеспособностью на агаровых пластинах.
    1. Чтобы обеспечить сохранность штамма до получения результатов секвенирования, которые подтвердят видовую идентичность, получить агаровые пластины из одной колонии и подтвердить чистоту для получения запасов. Создание заготовок непосредственно из агаровой пластины параллельно с оптимизацией условий роста в жидких средах.
    2. Чтобы приготовить подвой из планшета, созданного на шаге 2.3, используйте стерильную петлю для инокуляции диаметром 6 мм, чтобы собрать как можно больше однородных колоний. Затем энергично ресуспендируйте бактерии в 800 мкл RCM с 20% стерильным глицерином в криопробирках и храните их при температуре -80 °C для создания бактериального запаса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг обеспечивает своевременное сохранение привередливых патогенов до получения характеристик с помощью данных секвенирования.
    3. Проведите оптимизацию роста ликвидной культуры и генерирование подвоев из одной колонии после подтверждения классификации штамма.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании мы описываем протокол выделения и характеристики анаэробных бактерий из туннелей HS. Этот протокол является новым и примечательным тем, что создает потенциал для проверки функции и вирулентности этих бактерий с использованием моделей кожных инфекций in vitro, ex vivo и in vivo для улучшения нашего понимания микробного вклада в патогенез СГ. Во-первых, мы идентифицировали туннели из резецированной кожи, прощупав их стерильными щипцами (рис. 1A). ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании мы представляем новый метод выделения и поддержания бактерий, колонизирующих туннели HS. Этот воспроизводимый метод позволит не только глубоко охарактеризовать штаммы, присутствующие в этих патологических структурах, но и провести последующие функциональные исследования, изучающие роль специфических микробов в патогенезе ГС. Важнейшие этапы протокола включают сбор и транспортировку тканей в анаэробных средах, что способствует сохранению жизнеспособных привередливых ми...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не сообщают о конфликте интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана R01AR083385 (IP, MTC, HLT), P50MD017347 (TG, IP, HLT) и исследовательским грантом (TG) HS Foundation Danby. Эта работа была дополнительно поддержана грантом NIH 1S1OD023579-01 для сканера слайдов VS120 в Центре аналитической визуализации Медицинской школы Миллера Университета Майами.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Пробойник 6мм biospyINTEGRA33-36Другие поставщики могут быть использованы
8мм пуансон biospyINTEGRA33-37Другие поставщики могут быть использованы
Agarose Sigma AldrichA9539Другие поставщики могут использовать
Анаэробные камеры BD260672
Анаэробная транспортная средаАнаэробные системыAS-911
Инфузия мозга сердца АгарАнаэробные системыAS-6426
CO2 гаспакBD260678
Difco Усиленная клостридиальная средаBD218081
глицеринаSIGMAG5516-1LМожно использовать других поставщиков
Жесткая оболочка ПЦР планшетыBIO-RADHSP9601Других поставщиков могут быть использованы
Инкубатор VWRSymphonyМожно использовать любой каллибрированный инкубатор
Петли инокуляцииVWR76544-926Другие поставщики могут быть использованы
LKV агарHARDY DiagnosticsA60
Микробная ДНК-вода без ДНКQiagen338132
Nunc CryoTubeThermo scientific 377267Другие поставщики могут использовать
PCR (CFX Connect Real Time System)модуль оптики BIO-RADCFX Connect Можно использовать обычный темоциклер 
ГОРОХ агар HARDY DiagnosticsA93
Q5 High Fidelity 2X Master MixBioLabsM0492S
QIAquick PCR Purification KitQIAGEN28104
Усиленные клостридии средыBD218081
тонкие щипцыMillipore SigmaF4017Другие поставщики могут использовать
Триптиказ Соевый агар (TSA II) с 5% овечьей кровиТеплонаучные221261

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gonzalez-Lopez, M. A. Hidradenitis suppurativa. Med Clin. 162 (4), 182-189 (2024).
  2. Revankar, R., Murrell, D. F., Murase, J. E. Shedding light on the impact of hidradenitis suppurativa on women and their families: A focus of the international journal of women's dermatology. Int J Womens Dermatol. 7 (5Part B), 661-663 (2021).
  3. Gooderham, M., Papp, K. The psychosocial impact of hidradenitis suppurativa. J Am Acad Dermatol. 73 (5 Suppl 1), S19-S22 (2015).
  4. Frew, J. W., et al. Clinical response rates, placebo response rates, and significantly associated covariates are dependent on choice of outcome measure in hidradenitis suppurativa: A post hoc analysis of pioneer 1 and 2 individual patient data. J Am Acad Dermatol. 82 (5), 1150-1157 (2020).
  5. Bechara, F. G., et al. Efficacy and safety of adalimumab in conjunction with surgery in moderate to severe hidradenitis suppurativa: The sharps randomized clinical trial. JAMA Surg. 156 (11), 1001-1009 (2021).
  6. Williams, S. C., Frew, J. W., Krueger, J. G. A systematic review and critical appraisal of metagenomic and culture studies in hidradenitis suppurativa. Exp Dermatol. 30 (10), 1388-1397 (2021).
  7. Guet-Revillet, H., et al. The microbiological landscape of anaerobic infections in hidradenitis suppurativa: A prospective metagenomic study. Clin Infect Dis. 65 (2), 282-291 (2017).
  8. Riverain-Gillet, E., et al. The surface microbiome of clinically unaffected skinfolds in hidradenitis suppurativa: A cross-sectional culture-based and 16s rrna gene amplicon sequencing study in 60 patients. J Invest Dermatol. 140 (9), 1847-1855.e6 (2020).
  9. Ring, H. C., et al. The microbiome of tunnels in hidradenitis suppurativa patients. J Eur Acad Dermatol Venereol. 33 (9), 1775-1780 (2019).
  10. Pardo, L. M., et al. Bacterial microbiota composition in hidradenitis suppurativa differs per skin layer. J Invest Dermatol. 144 (2), 426-430.e5 (2024).
  11. Jiang, S. W., Whitley, M. J., Mariottoni, P., Jaleel, T., Macleod, A. S. Hidradenitis suppurativa: Host-microbe and immune pathogenesis underlie important future directions. JID Innov. 1 (1), 100001(2021).
  12. Navrazhina, K., et al. Epithelialized tunnels are a source of inflammation in hidradenitis suppurativa. J Allergy Clin Immunol. 147 (6), 2213-2224 (2021).
  13. Williams, S. C., et al. Gram-negative anaerobes elicit a robust keratinocytes immune response with potential insights into hs pathogenesis. Exp Dermatol. 33 (5), e15087(2024).
  14. Chopra, D., et al. Innate immunity and microbial dysbiosis in hidradenitis suppurativa - vicious cycle of chronic inflammation. Front Immunol. 13, 960488(2022).
  15. Van Straalen, K. R., et al. External validation of the ihs4-55 in a european antibiotic-treated hidradenitis suppurativa cohort. Dermatology. 239 (3), 362-367 (2023).
  16. Molinelli, E., et al. Systemic antibiotic therapy in hidradenitis suppurativa: A review on treatment landscape and current issues. Antibiotics. 12 (6), 978(2023).
  17. Andersson, T., Lood, R. 16S rRNA sequencing: A PCR-based technique to identify bacterial species. JoVE Sci Edu Database Microbiol. , e10510(2023).
  18. Nebo, I. D., Frew, J. W., Gudjonsson, J. E., Petukhova, L. Tissue comparability and bias in hidradenitis suppurativa transcriptomic studies. Proc Natl Acad Sci. 121 (23), e2404503121(2024).
  19. Naik, H. B., Piguet, V. Standardizing hidradenitis suppurativa skin microbiome research: The methods matter. J Invest Dermatol. 140 (9), 1688-1690 (2020).
  20. Ocker, L., Abu Rached, N., Seifert, C., Scheel, C., Bechara, F. C. Current medical and surgical treatment of hidradenitis suppurativa-a comprehensive review. J Clin Med. 11 (23), 7240(2022).
  21. Zouboulis, C. C., Hou, X., Von Waldthausen, H., Zouboulis, K. C., Hossini, A. M. Hs 3d-seboskin model enables the preclinical exploration of therapeutic candidates for hidradenitis suppurativa/acne inversa. Pharmaceutics. 15 (2), 619(2023).
  22. Koumaki, D., et al. Antimicrobial resistance trends in hidradenitis suppurativa lesions. J Clin Med. 13 (14), 4246(2024).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

16S
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи