Методическая статья

Перепрограммирование модели макрофагов, полученных из моноцитов человека, для анализов in vitro

DOI:

10.3791/67651

⸱

18 апреля 2025 г.

 , 
1Instituto de Medicina Experimental (IMEX), Academia Nacional de Medicina-CONICET, 2Instituto de Farmacología, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Моноциты и макрофаги являются очень пластичными и перепрограммируемыми иммунными клетками, имеющими решающее значение для здоровья и болезней. Они ощущают и реагируют на широкий спектр стимулов, применяя определенные программы дифференцировки и фенотипы. Мы стандартизировали модель in vitro для изучения поляризации и перепрограммирования макрофагов, что является ценным инструментом для исследований.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клетки моноцитарно-макрофагальной линии многофункциональны и встречаются почти во всех тканях организма. Они координируют фазы инициации и разрешения врожденного и адаптивного иммунитета, существенно влияя на защитный иммунитет и иммуноопосредованное патологическое повреждение. В то время как тканевые резидентные макрофаги играют ключевую роль в поддержании гомеостаза в стабильном состоянии, большое количество моноцитов рекрутируется из периферической крови в ткани после повреждения или воспалительных повреждений. Моноцитарные макрофаги (М-СД) могут дифференцироваться во множество динамических подтипов, а их фенотипы и функции зависят от местной тканевой среды.

Чтобы сравнить различные стимулы или условия окружающей среды во время дифференцировки и поляризации M-DM, мы стандартизировали in vitro модель неполяризованного M-DM человека M0 и некоторых макрофагов с кардинальной цитокин-поляризацией, M1, полученного из IFNγ/LPS, M2a из IL-4 и M2c, полученного из IL-10 или дексаметазона, чтобы проанализировать перепрограммирование M-DM с помощью проточной цитометрии и ПЦР в реальном времени. Мы обнаружили, что CD64, CD206, CD163, CD14 и MERTK могут четко различать неполяризованный M0 и поляризованный M1, M2a и M2c с помощью проточной цитометрии. Кроме того, мы определили IRF1 и CXCL10 как специфические гены для классических M1-, IRF4-, CCL22- и TGM-специфичных транскриптов на основе IFNγ/LPS для M2a, полученных из IL-4, и ген MERTK для M2c, полученного из дексаметазона. Подводя итог, можно сказать, что наш стандартизированный протокол M-DM может дать кардинальную карту in vitro для анализа дифференцировки и поляризации M-DM человека при различных стимулах.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Макрофаги, впервые идентифицированные Мечниковым за их фагоцитарную способность, являются древними клетками, фундаментальными для жизни многоклеточных. Обнаруженные повсеместно у взрослых млекопитающих, они демонстрируют замечательное анатомическое и функциональное разнообразие. Являясь частью мононуклеарной фагоцитарной системы, наряду с дендритными клетками и моноцитами, макрофаги играют решающую роль в различных биологических процессах, от развития и гомеостаза до иммунных реакций против патогеновsup class="xref">2. Резидентные макрофаги, специализирующиеся на микроокружении тканей, действуют как стражи, контролируя здоровье тканей и реагируя на физиологические изменения и внешние угрозы. Считается, что их ограниченная пластичность является эволюционной адаптацией для поддержания тканевого гомеостаза. Напротив, рекрутированные моноциты более гибки и могут дифференцироваться в различные фенотипы макрофагов во время воспаления. Это двойное влияние воспаления и тканевой ниши формирует функциональное разнообразие макрофагов3. Таким образом, в зависимости от местной тканевой среды, моноцитарные макрофаги (M-DM) могут дифференцироваться во множество подтипов. Локальные метаболиты, факторы роста, цитокины и межклеточное взаимодействие4,5,6 описывают свои фенотипы и функции. Кроме того, макрофаги являются ключевыми производителями факторов, которые ослабляют воспаление и стимулируют реваскуляризацию и восстановление тканей7,8.

Учитывая, что по крайней мере три основных полюса контролируют (внешние, внутренние и тканевые условия среды), поляризацию макрофагов следует рассматривать как многомерную2. Основными препятствиями и подводными камнями в описании дифференцировки и поляризации макрофагов являются неоднородные экспериментальные условия в литературе и отсутствие консенсуса по определению терминов макрофагов в экспериментах in vitro и in vivo9. Тем не менее, началась некоторая унификация экспериментальных стандартов для различных экспериментальных сценариев.

Чтобы лучше понять поле макрофагов человека, нам нужны стандартизированные и четко определенные модели M-DM in vitro для связывания, дифференцировки, поляризации, фенотипа и перепрограммирования, а также конкретных функций. Наша цель состояла в том, чтобы создать стандартизированную модель in vitro неполяризованных M-DM M0 человека и цитокин-поляризованных макрофагов для изучения перепрограммирования M-DM с помощью проточной цитометрии и ПЦР в реальном времени. Несмотря на то, что поляризация макрофагов является динамическим процессом из-за их высокой пластичности и способности интегрировать множественные сигналы из окружающей среды, мы охарактеризовали здесь неполяризованные M-DM (M0) и некоторые поляризационные состояния in vitro как классические провоспалительные, обычно известные также как M1, индуцированные IFNγ и LPS. Аналогичным образом, репарация тканей и регуляторные макрофаги M2 могут быть определены как M2a при индуцировании IL-4 и M2c при стимуляции дексаметазоном или IL-10. Эти поляризационные состояния дают снимок широкого спектра среды M-DM во времени и пространстве, но дают нам некоторые кардинальные точки для установки аналитической карты, на которой следует разместить условия тестирования.

Несмотря на сложную и динамичную комбинацию поверхностных маркеров и транскрипционных программ, при анализе in vitro M-DM мы установили, что CD64, CD206, CD163, CD14 и MERTK могут отделить неполяризованное состояние M0 от индуцированного IFNγ/LPS M1, IL-4-индуцированного M2a и IL-10 или дексаметазон-индуцированного проточной цитометрией. Кроме того, экспрессия генов IRF1 и CXCL10 была определена как специфичная для IFNγ/LPS-индуцированного M1; IRF4-, CCL22- и TGM2-специфичные транскрипты для M2a, полученного из IL-4; и ген MERTK для M2c, полученного из дексаметазона, устанавливая дополнительные кардинальные точки для сравнения искаженного перепрограммирования M-DM под воздействием различных стимулов или даже при совместном культивировании с другими типами клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все здоровые добровольные доноры крови предоставили письменное информированное согласие, и исследование было одобрено Комитетом по институциональной этике Национальной академии медицины (IMEX-CONICET-ANM) Аргентина. Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех материалах и реагентах, используемых в этом протоколе.

1. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC)

ПРИМЕЧАНИЕ: PBMC выделяют из 40 мл антикоагулянтной периферической крови с цитратом натрия в концентрации 3,8% и с использованием центрифугирования с градиентом плотности Ficoll-Hypaque (1077). Этот протокол выполняется в стерильных условиях в шкафу биобезопасности BSL2.

  1. Переложите полученный образец антикоагулянтной периферической крови в соответствующие пробирки объемом 15 мл или 50 мл для центрифугирования.
  2. Центрифугируют образцы крови при концентрации 200 × г в течение 15 мин (ускорение: 4, замедление: 2, при максимальном – 5) при комнатной температуре, чтобы получить обогащенную тромбоцитами плазму (PRP) сверху и клеточную фракцию, включая эритроциты и лейкоциты ниже. Смотрите Рисунок 1.
  3. Переведите верхнюю фракцию (PRP) в пробирки объемом 15 мл (если плазма будет храниться) и центрифугируйте при 600 × g в течение 10 мин (максимальное ускорение и замедление) для получения конечной плазменной фракции без тромбоцитов. Хранить плазму при температуре -20 °C.
  4. Разбавьте клеточную фракцию, полученную в результате первого центрифугирования, от 2x (минимум) до 3x (максимум) с использованием стерильного 1x фосфатно-солевого буфера (1x PBS), предварительно подогретого при комнатной температуре. Аккуратно гомогенизируйте его и используйте эту разбавленную фракцию для центрифугирования по градиенту плотности Фиколла-Гипака.
  5. Перенесите 15 мл Ficoll-Hypaque в стерильную пробирку объемом 50 мл. Затем осторожно и медленно добавьте 30 мл разбавленной крови поверх Фиколла, избегая смешивания фаз. При работе с 10 мл или менее разбавленной крови перелейте 4 мл Ficoll-Hypaque в пробирку объемом 15 мл><, а затем добавьте 10 мл разбавленной крови. ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение для получения мононуклеарной фракции.
  6. Центрифугируйте пробирку, содержащую разбавленную кровь Ficoll plus, в дозе 600 × г в течение 25 мин (ускорение: 1; Замедление: 0) при комнатной температуре.
  7. Удалите часть желтого верхнего слоя с помощью стерильной пипетки Пастера объемом 3 мл. Затем тщательно соберите на границе раздела (мононуклеарную «кольцевую» фракцию), образовавшуюся между желтым верхним слоем и слоем Фиколла, с помощью стерильной пастеровской пипетки. Это «кольцо» содержит интересующие нас мононуклеарные ячейки (ПМК).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Часть оставшейся фазы плазмы может быть собрана, но обязательно избегайте фазы Фиколла, так как она может быть токсичной для PBMC.
  8. Переложите собранные PBMC в новую пробирку объемом 15 мл, содержащую не менее 3 мл стерильного PBS 1x. Затем дольте соответствующий объем стерильного 1x PBS до 12-15 мл. Центрифугируйте PBMC при 600 × g (максимальное ускорение и замедление) в течение 10 минут.
  9. Выбросьте надосадочную жидкость и снова промойте ПМЦ. Ресуспендируйте клеточную гранулу, добавив 1 мл стерильного 1x PBS, затем долейте до 12-14 мл дополнительно стерильного 1x PBS. Центрифугируйте пробирки при 600 × g (максимальное ускорение и замедление) в течение 10 минут.
  10. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу PBMC в стерильном 1x PBS, содержащем 2% инактивированной фетальной бычьей сыворотки (1x PBS-2% FBS) и доведите объем до 10 мл. Используйте автоматический счетчик клеток или подсчитайте клетки, приготовив клеточную суспензию 1:5, разведенную в стерильном холоде 1x PBS, а затем (1:2) в Трипановом синем, чтобы получить окончательное разведение 1:10. Для подсчета используйте световой микроскоп.
  11. Уменьшите суспензию PBMC при 300 × г в течение 5 мин при 8-10 °C. Повторно суспендируйте клетки в желаемом объеме стерильной, холодной 1x PBS-2% FBS до получения конечной концентрации 10-8 клеток/мл. Оставьте эти ячейки при температуре 4 °C до следующего этапа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если собранные PBMC не будут использоваться в тот же день, рекомендуется заморозить в криогенном флаконе при концентрации10-8 клеток/мл в соответствующей среде для замораживания (90% FBS, содержащее 10% диметилсульфоксида, ДМСО). Хранить при температуре -80 °C в контейнере с полиэтиленгликолем в течение ночи, чтобы клетки могли медленно замерзнуть, тем самым сводя к минимуму повреждение клеток. На следующий день переложите ячейки в ящик для хранения и оставьте их при температуре -80 °C на пару дней или переложите в резервуар с жидким азотом на длительный срок хранения.

2. Сортировка моноцитов CD14+ с помощью магнитных шариков

ПРИМЕЧАНИЕ: Количество моноцитов CD14, обнаруженных в PBMC здоровых доноров, варьируется в зависимости от возраста и пола. Если это возможно, используйте счетчик клеток, чтобы получить % моноцитов в каждом образце, а затем рассчитайте количество PBMC, необходимое для сортировки необходимых моноцитов CD14. Если счетчик клеток недоступен, 10% моноцитов на образец PBMC можно считать широким подходом4,6,7,10,11,12,13.

CD14+ моноциты выделены с помощью набора для положительного отбора CD14 человека5. Мы стандартизировали протокол выделения с использованием от 1 до 2 × 107 PBMCs в 100 мкл реакции; Используйте это соотношение для больших чисел. Минимальный рекомендуемый объем реакции составляет 100 мкл, даже при меньшем числе ячеек, чем 1 × 107 PBMC.

  1. Приготовьте клеточную суспензию PBMC в концентрации 1-2 ×10 8 клеток/мл в 1x PBS-2% FBS, содержащем 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (1x PBS-2% FBS-1 mM EDTA) буфере и перенесите желаемое количество PBMCs в полистирольную пробирку с круглым дном объемом 5 мл.
  2. Добавьте 10 μL Positive Selection Cocktail на каждые 100 μL клеточной суспензии, хорошо перемешайте и инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 минут.
  3. Добавьте 10 мкл магнитных наночастиц на 100 мкл клеточной суспензии, энергично пипетируйте вверх и вниз более 5 раз, чтобы равномерно взвесить магнитные наночастицы, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 мин.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Вортексинг не рекомендуется.
  4. Добавьте 1x PBS-2% FBS-1 mM буфер ЭДТА, чтобы довести общий объем клеточной суспензии до 2,5 мл. Аккуратно пипетируйте клетки в пробирке вверх и вниз 2-3 раза. Вставьте пробирку в магнитный сортировщик и поставьте ее на 5 минут.
  5. Возьмите магнит и переверните его и трубку одним непрерывным движением, отбрасывая надосадочную фракцию. Магнитно помеченные клетки останутся внутри трубки. Оставьте магнит и трубку перевернутыми на 2-3 с, затем поверните их вертикально вверх.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте все свисающие капли изо рта трубки; Не встряхивайте и не промокайте их.
  6. Снимите пробирку с магнита и снова добавьте в пробирку 2,5 мл 1x PBS-2% FBS-1 mM EDTA. Аккуратно пипетируйте клеточную суспензию вверх и вниз 2-3 раза, чтобы перемешать ее. Вставьте трубку обратно в магнит и отложите ее в сторону на 5 минут.
  7. Одним непрерывным движением переверните и магнит, и трубку, отбросив надосадочную фракцию. Снимите трубку с магнита и снова суспендируйте элементы в подходящем количестве 1x PBS-2% FBS буфера (без ЭДТА). Теперь положительно отобранные клетки готовы к использованию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Всего требуется два 5-минутных разделения в магните.
  8. Отсортированные CD14 клетки промыть с использованием 1x PBS-2% FBS буфера, довести суспензию клеток до 12-14 мл для разбавления остатков ЭДТА, а затем центрифугировать при 600 × g (максимальное ускорение и замедление) в течение 10 минут.
  9. Выбросьте надосадочную жидкость и повторите промывку, сначала суспендируя клеточную гранулу 1x PBS-2% FBS буфера, а затем доливая объем до 12-14 мл. Центрифугируйте пробирки при 600 × g (максимальное ускорение и замедление) в течение 10 минут.
  10. Отбраковать надосадочную жидкость и ресуспендировать положительные отобранные моноциты CD14 в 2 мл 1x PBS-2% FBS буфера. Используйте автоматический счетчик клеток или подсчитайте клетки, разбавив клеточную суспензию (1:5) в стерильном холоде 1x PBS, а затем (1:2) в трипановом синем с помощью светового микроскопа. Оставьте клетки на льду до подготовки культуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чистоту клеток можно проверить с помощью проточной цитометрии, взяв 50 мкл клеточной суспензии и окрашивая ее на клетки CD14+ (клон HCD14). Рекомендуется чистота более 90%.
  11. Для культивирования клеточную суспензию уменьшите до 300 × г в течение 5 мин при 8-10 °C. Ресуспендируйте гранулу в концентрации 10-6 клеток/мл с использованием RPMI 1640 с добавлением 10% инактивированного FBS и 1% пенициллин-стрептомицина (RPMI-10% FBS-1% P/S).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно использовать высококачественный FBS с низким содержанием эндотоксинов, инактивированный при нагревании. Всегда держите на льду, чтобы избежать прилипания моноцитов к пластиковой стенке перед нанесением покрытия.

3. Дифференцировка и поляризация моноцитарных макрофагов (M-DM)

ПРИМЕЧАНИЕ: Культуру M-DM проводят путем осаждения 2,5 × 105 CD14+ моноцитов в 48-луночных планшетах, содержащих 500 μL RPMI-10% FBS-1% P/S, и культивируют в увлажненном инкубаторе при 37 °C с CO2 (5%) в течение 7 дней. Выбирайте обработанные пластины, чтобы улучшить адгезию моноцитов к пластине.

  1. Определите все условия для проведения эксперимента, включая лунки для базального M-DM (M0), воспалительного M1, M2a для восстановления тканей, регуляторного M2c и желаемые условия тестирования.
  2. Пипеткой 250 мкл клеточной суспензии, приготовленной на шаге 2.11, затравить 2,5 × 105 CD14+ моноцитов в каждую лунку.
  3. Добавьте 250 мкл RPMI-10% FBS-1% P/S плюс 50 нг/мл M-CSF в каждую лунку, чтобы получить 500 мкл общего объема.
  4. Инкубируйте планшет для культивирования клеток в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C с 5%CO2 в течение 4 дней><, чтобы обеспечить первый этап дифференцировки макрофагов. ПРИМЕЧАНИЕ: Периодически проверяйте дифференцировку клеточной культуры, чтобы увидеть, произошли ли морфологические изменения, как ожидалось, или существуют нежелательные неприкрепленные клетки.
  5. Замените половину питательной среды (250 мкл RPMI-10% FBS-1% P/S) на 4-й день культуры M-DM. Добавьте цитокины или реагенты для поляризационных условий и культивируйте их в течение 3 дней (конечная точка — 7-й день): ЛПС (1 нг/мл) плюс ИФНγ (50 нг/мл) для М1, ИЛ-4 (40 нг/мл) для М2а, ИЛ-10 (50 нг/мл) или дексаметазон (0,1 мкМ) для М2с.
  6. Соберите M-DM на 7-й день для проведения фенотипической характеристики, соберите их на экспрессию мРНК, как указано на следующих двух этапах, или выполните функциональный анализ.

4. Характеристика поверхностного фенотипа поляризованного M-DM методом проточной цитометрии

  1. Выбросьте общий объем питательной среды (500 мкл 48-луночного планшета) и добавьте 200 мкл 1x PBS-2% FBS-1 мМ буфера ЭДТА для сбора клеток. Инкубируйте в течение 20 минут на льду, а затем добавьте 200 мкл 1x PBS-2% FBS для разбавления буфера ЭДТА. Соберите M-DM путем пипетирования вверх и вниз в микропробирках объемом 1,5 мл. Промойте эти собранные клетки один раз 1x PBS-2% FBS и центрифугируйте при 800 × г в течение 3 минут.
  2. Повторно суспендируйте гранулы M-DM с 200 мкл 1x PBS-5% FBS и перенесите их в 96-луночный микропланшет с круглым дном для блокирования при комнатной температуре в течение 15 мин. Центрифугируйте клетки при 800 × г в течение 3 мин.
  3. Приготовьте соответствующую комбинацию непосредственно конъюгированных антител в 1x PBS-2% FBS. Каждую лунку или состояние (1x) окрасить 50 мкл панели антител и инкубировать при 4 °C в течение 30 минут в темно><те. ПРИМЕЧАНИЕ: В данном случае панель антител состояла из CD11b-APC/Cy7, CD64-APC, CD163-PerCP/Cy5.5, CD206-AlexaFluor 488, CD14-PECy7 и MERTK-биотина плюс стрептавидин-PE. Концентрация антител в титровании указана в таблице 1.
  4. Промойте испачканный M-DM, добавив 150 μL 1x PBS, и центрифугируйте при 800 × г в течение 3 минут.
  5. Чтобы измерить жизнеспособность клеток, добавьте 100 μL корректируемого красителя для определения жизнеспособности Zombie Violet (1:1000 в 1x PBS) и инкубируйте при 4 °C в течение 30 минут в темноте.
  6. Промойте окрашенные клетки, добавив 100 мкл 1x PBS, и центрифугируйте при 800 × г в течение 3 мин. Повторите процедуру промывания, используя 200 мкл 1x PBS.
  7. Зафиксируйте, повторно суспензируя гранулы M-DM со 100 μл фиксирующего реагента (из набора для фиксации/пермеабилизации) и инкубируя их в течение 20 минут на льду и в темноте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения соответствующей фиксации важно правильно гомогенизировать клеточную гранулу.
  8. Промойте M-DM, добавив 100 мкл 1x PBS-2% FBS и центрифугируйте при 800 × г в течение 3 мин. Повторите процедуру промывки, используя 200 мкл 1x PBS-2% FBS.
  9. Ресуспендируйте гранулу M-DM в 200 мкл 1x PBS и запустите окрашенные клетки в проточный цитометр.

5. Профиль программы гена для различения поляризации M-DM с помощью количественной ПЦР

ПРИМЕЧАНИЕ: На 7-й день культуры можно собрать 2,5 × 105 M-DM с использованием реагента для экстракции РНК для выделения высококачественной общей РНК. Выделение РНК также может быть выполнено с использованием альтернативных методов, таких как колоночная экстракция РНК и набор для элюирования.

  1. Выбросьте общий объем питательной среды и лизированный M-DM, добавив непосредственно 350 мкл экстракционного реагента. Гомогенизируйте и перенесите эту клеточную суспензию в микротрубку объемом 1,5 мл без РНКазы/ДНКазы и продолжайте выделение РНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если выделение РНК не будет выполнено в тот же день, образец из шага 5.1 может храниться при температуре 4 °C в течение ночи или при температуре -20 °C в течение года.
  2. Чтобы обеспечить полную диссоциацию комплекса нуклеопротеидов, инкубируйте гомогенизированные образцы из стадии 5.1 в течение 5 мин при 25 °C
  3. Добавьте 70 μL хлороформа в каждый образец. Надежно закройте каждую пробирку, чтобы предотвратить утечку, и тщательно перемешайте содержимое, встряхивая пробирку. Инкубируйте образцы в течение 2-3 минут, а затем центрифугируйте образцы при 12 000 × г в течение 15 минут при 4 °C. На этом этапе фазы будут полностью разделены на нижнюю фенол-хлороформную фазу, интерфазу и бесцветную верхнюю водную фазу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем хлороформа основан на соотношении 0,2 мл хлороформа на 1 мл экстракционного реагента, используемого на стадии лизиса.
  4. Перенос водной фазы, содержащей РНК, в новую микротрубку объемом 1,5 мл РНКазы-/ДНКазы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При приеме водной фазы оставляйте небольшой объем, чтобы избежать переноса каких-либо межфазных или органических слоев.
  5. Добавьте 175 мкл изопропанола в каждый образец, чтобы осаждать РНК. Выдерживать в течение 10 минут при 4 °C или в течение ночи при -20 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем изопропанола основан на соотношении 0,5 мл изопропанола на мл исходного экстракционного реагента.
  6. Центрифугируйте образцы при 12 000 × г в течение 10 минут при 4 °C. Белая гелеобразная гранула общей РНК будет осаждаться на дне пробирки. Осторожно извлеките и выбросьте надосадочную жидкость с помощью микропипетки.
  7. Промойте РНК, повторно суспендировав белую гелеобразную гранулу в 350 мкл 75% этанола (1 мл на 1 мл экстракционного реагента (v/v), используемого для лизиса).
    ПРИМЕЧАНИЕ: РНК может храниться в 75% этаноле до 1 года при -20 °C или до 1 недели при 4 °C.
    8. Кратковременно перебейте
  8. ресуспендированную гранулу и центрифугируйте при 7 500 × г в течение 5 минут при 4 °C. Удалите и выбросьте надосадочную жидкость с помощью микропипетки. Высушите на воздухе или вакуумируйте гранулу РНК в течение 5-10 мин.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Для солюбилизации РНК избегайте пересушивания гранул РНК.
  9. Ресуспендируйте гранулу в 20-30 мкл воды, не содержащей РНКазы, путем пипетирования вверх и вниз. Выдерживать на водяной бане или в термоблоке, установленном при температуре 55-60 °С, в течение 10-15 минут. Измерьте концентрацию РНК и храните РНК при температуре -70 °C.
  10. Проведите обратную транскрипцию (копию кДНК) с использованием 100-500 нг РНК (минимальное и максимальное соответственно) в 20 мкл реакционного объема с помощью набора для синтеза кДНК.
  11. Проведите реакции ПЦР в реальном времени с использованием 1 мкл кДНК (5-25 нг).
    1. Приготовьте реакционную смесь для каждой пробирки (1 шт.), используя 5 мкл зеленой смеси SYBR (2 раза), 0,2 мкл каждого праймера (прямого и обратного) и 3,6 мкл воды, не содержащей нуклеаз. Масштабируйте все компоненты в соответствии с номером образца. Тщательно перемешайте реакционную смесь и распределите по 9 мкл в каждую пробирку для количественной ПЦР и, наконец, 1 мкл кДНК, чтобы получить конечный общий объем в 10 мкл.
    2. Запрограммируйте протокол термоциклирования на приборе для ПЦР в реальном времени следующим образом: 2-3 мин при 98 °C (1x); 5-15 с при 98 °C плюс 15-30 с при 60 °C (35-40x); наконец, включите анализ кривой плавления (65-95 °C) с шагом 0,5 °C через 2-5 с/шаг или используйте настройку прибора по умолчанию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта реакция была стандартизирована с использованием универсальной смеси SYBR Green. Праймеры, рекомендуемые для поляризационного анализа M-DM, перечислены в таблице 2.
  12. Нормализовать результаты, используя в качестве референсного гена эукариотический фактор удлинения трансляции 1 альфа 1 (EEF1A1), и проверить специфичность амплифицированных продуктов путем анализа кривых диссоциации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ кривой диссоциации позволяет подтвердить наличие в реакции только одного продукта амплификации количественной ПЦР.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Основываясь на нашей работе по характеристике макрофагов в течение нескольких лет, мы установили точную комбинацию маркеров, которая четко различает различные подмножества M-DM in vitro. Маркеры фенотипа были выбраны на основе литературы и широкого предыдущего скрининга, который мы ранее проводили9,14,15,16,17. Кроме того, мы определили, что CD64, CD2...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дифференцировка, активация и поляризация макрофагов стали центральным направлением в иммунологии, тканевом гомеостазе, патогенезе заболевания и разрешении воспаления. Кроме того, складывающаяся картина того, что тканевые макрофаги могут быть получены из циркулирующих моноцитов в условиях нарушенного гомеостаза, подчеркивает необходимость точных моделей M-DM, характеризующихся определенными фенотипами, транскрипционными программами и путями активации.

Для его успешной реализации необходимо обсу...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Национальным агентством по продвижению науки и технологий (ANPCyT-FONCYT) через гранты PICT 2018-3070 и 2021-I-A-00807 для E.A.C.S. и PICT 2021-I-A-00716 для A.E.E, а также Национальным советом по научным и техническим исследованиям (CONICET) через грант PIP 2022-0763 и Университетом Буэнос-Айреса через Proyectos de Investigación y Desarrollo en Áreas Estratégicas con Impacto Social (PIDAE) с 2022 по A.E.E., E.A.C.S. и A.E.E. — профессиональные следователи в CONICET.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Alexa Fluor 488 мышь антигуманная  Клон антитела к CD206 15-2BioLegend, Сан-Диего, Калифорния, США.Кат# 321113; RRID:AB_571874
Клон антитела APC к CD64 против человека 10.1BioLegend, Сан-Диего, Калифорния, США.Кат# 305013; RRID:AB_1595539
Клон антител к мышам/человеку CD11b от APC/Cy7 M1/70BioLegend, Сан-Диего, Калифорния, США.Кат# 101226; RRID:AB_830642
BD Cytofix/CytopermBD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, СШАCat# 554714набор фиксаторов/пермеабилизации
Biotin anti-human MERTK антитела клон 590H11G1E3BioLegend, Сан-Диего, Калифорния, США.Кат# 367616; RRID:AB_2721500 
Оборудование CFX-Connect Bio-Rad, Геркулес, Калифорния, США
Набор для положительного отбора человеческого CD14 EasySep; Коктейль EasySep Positive Selection; магнитные наночастицы EasySep; Easy Sep MagnetSTEMCELL Technologies, Ванкувер, КанадаКат# 18058
FACS Canto цитометр Бектон Дикинсон, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США.
Фетальная бычья сыворотка, квалифицированная, Новая Зеландия Gibco™   Thermo Fisher Scientific
Уолтем, Массачусетс США 		Cat# 10091148
Ficoll-Paque PLUS CytivaGE Healthcare - Медико-биологические науки, СШАCat# 17144003
FlowJoLLC.RRID:SCR_008520
GraphPad Prism   ГрафПад Софтвер Инк.RRID:SCR_002798
набор для синтеза кДНК iScript, включает в себя 5-кратную смесь реакций обратной транскрипции, обратную транскриптазу iScript, безнуклеазную водуBio-Rad, Hercules, CA, СШАCat# 1708891
космическим цитометром Partec CyFlow;Sysmex Partec, Германия
PE StreptavidinBioLegend, Сан-Диего, Калифорния, США.Клон антител Cat# 405203
PE/Cy7 к человеческому антителу к CD14 HCD14BioLegend, Сан-Диего, Калифорния, США.Кат# 325618; RRID:AB_830691
Клон антитела к человеческому CD163 мыши PerCP/Cy5.5 GHI/61BioLegend, Сан-Диего, Калифорния, США.Кат# 333607; RRID:AB_1134006
RPMI 1640 СреднийGibco&торговля;   Thermo Fisher Scientific
Уолтем, Массачусетс США 		Cat# 11875119
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix, содержит антитело-опосредованный горячий старт Sso7d fusió • полимераза, dNTPs, MgCl2, краситель SYBR Green I, усилители, стабилизаторы и смесь пассивных референтных красителей (включая ROX и флуоресцеин).Bio-Rad, Геркулес, Калифорния, СШАCat# 1725271
реагент TriZolThermo Fisher Scientific
Life Sciences Solutions
Carlsbad, CA, США 		Cat#  15596026реагент для экстракции РНК
Zombie Violet Fixable Viability KitBioLegend, Сан-Диего, Калифорния, США.Кат# 423113

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
  2. Murray, P. J. Macrophage polarization. Annu Rev Physiol. 79, 541-566 (2017).
  3. Guilliams, M., Svedberg, F. R. Does tissue imprinting restrict macrophage plasticity. Nat Immunol. 22 (2), 118-127 (2021).
  4. Nowak, W., et al. Pro-inflammatory monocyte profile in patients with major depressive disorder and suicide behaviour and how ketamine induces anti-inflammatory m2 macrophages by nmdar and mtor. EBioMedicine. 50, 290-305 (2019).
  5. Carestia, A., et al. Platelets promote macrophage polarization toward pro-inflammatory phenotype and increase survival of septic mice. Cell Rep. 28 (4), 896-908.e5 (2019).
  6. Olexen, C. M., et al. Increased axl(high) myeloid cells as pathognomonic marker in Langerhans cell histiocytosis and langerin expression dependence of mtor inhibition. Clin Immunol. 263, 110203(2024).
  7. Ortiz Wilczynski, J. M., et al. The synthetic phospholipid C8-C1P determines pro-angiogenic and pro-reparative features in human macrophages restraining the proinflammatory M1-like phenotype. Front Immunol. 14, 1162671(2023).
  8. Das, A., et al. Monocyte and macrophage plasticity in tissue repair and regeneration. Am J Pathol. 185 (10), 2596-2606 (2015).
  9. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: Nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
  10. Carrera Silva, E. A., et al. CD207(+)CD1a(+) cells circulate in pediatric patients with active Langerhans cell histiocytosis. Blood. 130 (17), 1898-1902 (2017).
  11. Ferrer, M. F., et al. Junin virus triggers macrophage activation and modulates polarization according to viral strain pathogenicity. Front Immunol. 10, 2499(2019).
  12. Gattas, M. J., et al. A heterotypic tridimensional model to study the interaction of macrophages and glioblastoma in vitro. Int J Mol Sci. 22 (10), 5105(2021).
  13. Ortiz Wilczynski, J. M., et al. Gas6 signaling tempers Th17 development in patients with multiple sclerosis and helminth infection. PLoS Pathog. 16 (12), e1009176(2020).
  14. Ambarus, C. A., et al. Systematic validation of specific phenotypic markers for in vitro polarized human macrophages. J Immunol Methods. 375 (1-2), 196-206 (2012).
  15. Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: Time for reassessment. F1000Prime Rep. 6, 13(2014).
  16. Martinez, F. O., et al. Genetic programs expressed in resting and IL-4 alternatively activated mouse and human macrophages: Similarities and differences. Blood. 121 (9), e57-e69 (2013).
  17. Vogel, D. Y., et al. Human macrophage polarization in vitro: Maturation and activation methods compared. Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).
  18. Tiemessen, M. M., et al. CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells induce alternative activation of human monocytes/macrophages. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (49), 19446-19451 (2007).
  19. Bosurgi, L., et al. Macrophage function in tissue repair and remodeling requires IL-4 or IL-13 with apoptotic cells. Science. 356 (6342), 1072-1076 (2017).
  20. Sanin, D. E., et al. A common framework of monocyte-derived macrophage activation. Sci Immunol. 7 (70), eabl7482(2022).
  21. Rigamonti, E., Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. Regulation of macrophage functions by PPAR-alpha, PPAR-gamma, and LXRS in mice and men. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (6), 1050-1059 (2008).
  22. Zizzo, G., Hilliard, B. A., Monestier, M., Cohen, P. L. Efficient clearance of early apoptotic cells by human macrophages requires M2c polarization and MerTK induction. J Immunol. 189 (7), 3508-3520 (2012).
  23. Mccoll, A., et al. Glucocorticoids induce protein S-dependent phagocytosis of apoptotic neutrophils by human macrophages. J Immunol. 183 (3), 2167-2175 (2009).
  24. Xue, J., et al. Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation. Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).
  25. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: Nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
  26. Murray, P. J. Macrophage polarization. Annu Rev Physiol. 79, 541-566 (2017).
  27. Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat Rev Immunol. 3 (1), 23-35 (2003).
  28. Hawley, K. L., et al. IFNgamma enhances CD64-potentiated phagocytosis of Treponema pallidum opsonized with human syphilitic serum by human macrophages. Front Immunol. 8, 1227(2017).
  29. Akinrinmade, O. A., et al. CD64: An attractive immunotherapeutic target for M1-type macrophage mediated chronic inflammatory diseases. Biomedicines. 5 (3), 56(2017).
  30. Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: Time for reassessment. F1000Prime Rep. 6, 13(2014).
  31. Sudan, B., Wacker, M. A., Wilson, M. E., Graff, J. W. A systematic approach to identify markers of distinctly activated human macrophages. Front Immunol. 6, 253(2015).
  32. Martinez, F. O., et al. Genetic programs expressed in resting and IL-4 alternatively activated mouse and human macrophages: Similarities and differences. Blood. 121 (9), e57-e69 (2013).
  33. Platanitis, E., Decker, T. Regulatory networks involving STATs, IRFs, and NFkappab in inflammation. Front Immunol. 9, 2542(2018).
  34. Laplante, M., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth control and disease. Cell. 149 (2), 274-293 (2012).
  35. Covarrubias, A. J., Aksoylar, H. I., Horng, T. Control of macrophage metabolism and activation by mTOR and Akt signaling. Semin Immunol. 27 (4), 286-296 (2015).
  36. Shahbazian, D., Parsyan, A., Petroulakis, E., Hershey, J., Sonenberg, N. Eif4b controls survival and proliferation and is regulated by proto-oncogenic signaling pathways. Cell Cycle. 9 (20), 4106-4109 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Monocyte Derived MacrophagesMacrophage PolarizationIn Vitro ModelFlow CytometryReal Time PCRCytokine PolarizationPBMC IsolationCD14 MonocytesMacrophage DifferentiationPhenotypic Characterization

Похожие статьи