Высокопроизводительный рабочий процесс визуализации и анализа для оценки фенотипов клеток кожи и состояний пролиферации в образцах тканей

Summary

Комбинация итеративного отбеливания и расширенной мультиплексности (IBEX) и коммерческого анализа нуклеотидного мечения (Click-iT EdU) позволяет обнаруживать и категоризировать типы делящихся клеток в высокодинамичных процессах в фиксированных замороженных срезах мышиной ткани. Кроме того, новый конвейер обработки изображений с открытым исходным кодом обеспечивает высокую пропускную способность получения и анализа изображений.

Abstract

Повреждения кожи инициируют сложный регенеративный каскад, который задействует различные типы клеток. Среди них периферические глиальные клетки играют решающую роль в обеспечении успеха процесса восстановления. Однако наше понимание этих процессов остается неполным из-за ограничений в современных технологиях. Таким образом, для характеристики изменений клеточного состава кожи был использован метод итеративного отбеливания-расширения-мультиплексности (IBEX) с использованием антител, направленных против белков, экспрессируемых ключевыми типами клеток и структурами, участвующими в регенерации тканей. Важно отметить, что антитела, направленные против маркеров пролиферации клеток, часто недооценивают количество делящихся клеток в коже. Чтобы преодолеть это ограничение, химический метод Click-iT EdU был объединен с методом IBEX, что позволило детально охарактеризовать типы клеток, пролиферирующих. С помощью полностью автоматизированного конфокального микроскопа с вращающимся диском был разработан высокопроизводительный рабочий процесс для итеративной визуализации образцов, разделенных на 24-луночные планшеты. Помимо расширения метода IBEX для оценки состояний ячеек in situ с помощью Click-iT EdU, также был представлен новый конвейер обработки изображений с открытым исходным кодом для выполнения коррекции изображений, сшивания и регистрации, который может использоваться исследователями без большого опыта программирования. Кроме того, предоставляется подробная документация по обработке и визуализации данных изображений с высокой мультиплексированностью (с использованием традиционного программного обеспечения для анализа изображений, включая Fiji и QuPath). Таким образом, этот протокол подчеркивает универсальность протокола IBEX и демонстрирует его адаптацию к устоявшейся традиционной платформе визуализации. В частности, сочетание IBEX с мечением Click-iT EdU позволяет обнаруживать и категоризировать активно делящиеся типы клеток в интактных тканях и во время высокодинамичных процессов с пространственным разрешением.

Introduction

Кожа является самым крупным органом человеческого тела и первичным барьером для защиты организма от внешней среды¹. Следовательно, он подвержен множеству внешних вызовов, которые ставят под угрозу его барьерную функцию. Таким образом, кожа разработала сложные механизмы для восстановления целостности и функциональности тканей после повреждения. Заживление кожных ран происходит на трех перекрывающихся стадиях: воспаление, пролиферация и созревание/ремоделирование. Эти три стадии включают в себя несколько различных типов клеток, таких как дермальные фибробласты и иммунные клетки, которые действуют вместе, восстанавливая первоначальные биологические свойства поврежденной ткани кожи ^1,2,3.

Кожа является плотно иннервированным органом, и известно, что иннервация нервов имеет решающее значение для успешного процесса восстановления ^4,5,6. Помимо аксональной сигнализации ^4,7,8, периферическая глия, в норме покрывающая аксоны, участвует в успешной регенерации тканей ^9,10,11. Тем не менее, роль недостаточно представленных типов клеток, таких как периферические глиальные клетки, остается плохо изученной в динамических процессах, таких как регенерация тканей кожи. Чтобы лучше определить функцию этих клеток, крайне важно проанализировать клеточное микроокружение и соседние типы клеток, с которыми они могут взаимодействовать в процессе регенерации. Более того, поскольку пролиферация клеток является ключевым этапом регенерации тканей, важно точно обнаруживать и классифицировать пролиферирующие типы клеток на протяжении всего процесса восстановления.

Мультиплексные методы оптической визуализации с высоким содержанием, такие как IBEX¹², были разработаны для характеристики клеточного состава, визуализации и количественной оценки межклеточных взаимодействий, а также анализа микроэкологических структур в сложных тканях с пространственным разрешением. В то время как другие методы мультиплексирования требуют специализированных инструментов и запатентованных реагентов, особое преимущество IBEX заключается в том, что его можно создать с относительно низкими затратами с использованием коммерчески доступных антител, реагентов и микроскопов, доступных в стандартной исследовательской среде. В то время как антитела против Ki-67, часто используемые в панелях IBEX, надежно маркируют пролиферирующие типы клеток во многих тканях^13,14, было обнаружено, что количество Ki-67-положительных (Ki-67+) клеток было недооценено по сравнению с другими методологиями в фиксированных замороженных срезах тканей острых ран кожи мышей. Поэтому мы объединили химический состав Click-iT EdU с IBEX и обнаружили, что количество EdU⁺ клеток более точно представляет общее количество пролиферирующих клеток, полученных с помощью других методологий.

Кроме того, с помощью полностью автоматизированного конфокального микроскопа с вращающимся диском был создан высокопроизводительный рабочий процесс для итеративной визуализации участков ткани, помещенных в 24-луночный планшет. Полученные изображения затем обрабатываются путем объединения нескольких инструментов Python с открытым исходным кодом в новый конвейер обработки изображений, который корректирует изображения для неравномерного освещения, выполняет сшивку отдельных плиток и, в конечном итоге, регистрацию изображений. В частности, для коррекции освещенности использовалась библиотека¹⁵ BaSiCPy, для сшивания изображений — библиотека m2stitch, а для регистрации циклов — фазовая перекрестная корреляция. Зарегистрированные изображения сохраняются в формате OME-TIFF и затем могут быть загружены в обычное программное обеспечение для анализа изображений, такое как Fiji¹⁷ и QuPath¹⁸, где изображения затем обрабатываются и могут быть выполнены категоризация типов клеток и другие измерения, такие как расчет интенсивности и расстояния. В совокупности данный протокол позволил нам провести детальную, высокоэффективную характеристику основных типов клеток регенерирующей кожи, уделяя особое внимание клеточному микроокружению, окружающему популяцию периферических глиальных клеток.

Protocol

Все животные, выращивание, содержание и эксперименты проводились в соответствии с рекомендациями ветеринарной службы кантона Цюрих, Швейцария.

1. Раны на всей толщине кожи (день 0)

1. Индуцировать мышам в возрасте 8-10 недель 5% изофлурана в 70%_О2 и поддерживать его с помощью 2,5% изофлурана.
2. Сбрейте кожу тыльной стороны и тщательно очистите ее.
3. Перед операцией продезинфицируйте с помощью антибактериального мыла и 70% раствора EtOH.
4. Применяют предоперационную анальгезию с помощью подкожного введения бупренорфина (30 мкг^{∙мг∙кг−1}).
5. Сгенерируйте четыре круглые эксцизионные раны полной толщины диаметром 5 мм на коже нижней части спины каждого животного, по две с каждой стороны, на расстоянии 1 см от средней линии животного и примерно на расстоянии 2 см друг от друга^{на расстоянии 19} см.
6. Проведите послеоперационную анальгезию с 3-дневным лечением бупренорфином через питьевую воду (9 мкг/мл с 2% сахарозой).
7. Дайте ранам зажить без перевязки.
8. Соберите раны в определенные моменты времени для гистологического исследования и анализа проточной цитометрии.
9. Для протокола IBEX препарируйте и зафиксируйте ткани кожи 4% раствором параформальдегида (PFA) при температуре 4 °C на ночь. Используйте коммерчески доступную капсулу для биопсии, чтобы предотвратить скручивание образцов во время фиксации. Криопротекция 4% ПФА-фиксированных тканей в 30% сахарозе в PBS в течение ночи при 4 °C. Перенесите ткани в смесь 30% сахарозы с соединением O.C.T в соотношении 1:1 на 2 ч при RT и, наконец, внедрите в O.C.T перед мгновенной заморозкой в изопентан.

2. Подготовка образцов (День 1)

1. Нанесите на 24-луночный планшет 200 μL хромового квасцового желатина на 15 минут на коромысле. Затем полностью удалите желатин и просушите лунки с покрытием в течение 60 минут в духовке при температуре 40 °C. Покройте вдвое больше скважин, необходимых в качестве резерва. Добавьте 2 мл PBS на лунку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед укладкой салфетки убедитесь, что покрытие полностью высохло. Лунки также можно покрыть за день до этого и высушить в течение ночи при RT. После нанесения покрытия не храните лунки с покрытием в холодильнике или морозильной камере, а для достижения наилучших результатов используйте 24-луночную пластину с покрытием в течение 1-2 дней.
2. Разрежьте ткань, залитую O.C.T, до толщины 15-30 мкм в криостате и быстро перенесите ее в лунку с покрытием, содержащую 2 мл PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань может быть перенесена с помощью металлического шпателя или щипцов.
3. Осторожно извлеките PBS с помощью пипетки объемом 1 мл, стараясь сохранить участок ткани по центру лунки. Чтобы сделать это эффективно, медленно отсасывайте PBS от краев лунки, регулируя положение пипетки по мере необходимости, чтобы предотвратить смещение ткани.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Точное размещение ткани имеет важное значение для успеха протокола. После того, как ткань прилипнет к покрытой поверхности, ее нельзя будет перемещать.
4. Высушите срезы ткани в течение 1 часа в духовке при температуре 37 °C.

3. Блокирование тканей, реакция EdU Click-iT и иммуномечение антителами, цикл IBEX 1 (день 1)

1. Регидратируйте с 1 мл PBS в течение 5 минут.
2. Пермеабилизируйте ткань 500 мкл 0,5% тритона в PBS в течение 30 мин в режиме РТ.
3. Коротко промойте салфетку 2 раза PBS.
4. Выполните реакцию Click-iT в соответствии с инструкциями производителя в течение 30 минут при температуре RT.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Храните образцы в защищенном от света месте.
5. Коротко промойте салфетку 2 раза PBS.
6. Заблокируйте ткань на 1 ч при комнатной температуре (RT) с помощью блокирующего буфера.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь для этого эксперимента использовалась 10% сыворотка осла в PBS, но это можно скорректировать по мере необходимости; Подходит любой блокирующий буфер, совместимый со стандартными протоколами иммуномаркировки.
7. Применяют первичные антитела (разведенные в блокирующем буфере; см. Таблицу материалов) в 1-м цикле на ночь при температуре 4 °С.
   Блокирование и иммуномечение также могут быть выполнены в течение ~1 ч с использованием микроволновой печи без нагрева, как описано в Radtke et ^al.12. Однако для кожных ран наилучшее соотношение сигнал/шум достигается при инкубации первичных антител в течение ночи. Иммуномеченые срезы тканей могут храниться в PBS в течение нескольких дней до визуализации. Для получения оптимального качества сигнала рекомендуется выполнять визуализацию на следующий день.

4. Иммуномечение вторичными антителами и ядерное противодействие (день 2)

1. Промойте лунки 3 x 1 мл PBS.
2. Инкубируйте участок ткани с окрашиванием вторичными антителами против кролика (1:300) в блокирующем растворе вместе с ядерным противокрасителем Hoechst 1:1000 в течение 1 ч при ЛТ в темноте.
3. Умыться 3 x 5 мин с 1 мл PBS при RT.
4. Оставьте ~500 μL PBS в каждой лунке и поднесите планшет к микроскопу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть точкой паузы: образцы стабильны в течение нескольких дней при температуре 4 °C, но соотношение сигнал/шум является лучшим при визуализации в течение 24 часов после иммуномечения.

5. Настройка микроскопа и визуализация первого цикла IBEX (день 2)

1. Войдите в микроскоп и загрузите программное обеспечение, а затем войдите в профиль пользователя.
2. Войдите в настройку сбора данных (откройте через Screening | Acquisition Setup) для настройки протокола и получения изображений.
3. С помощью кнопки «Извлечь » загрузите пластину в микроскоп.
4. Очистите дно 24-луночного планшета 70% этанолом непосредственно перед тем, как поместить планшет в микроскоп. Нажмите кнопку «Загрузить пластину», чтобы загрузить пластину в микроскоп.
5. Выберите нужное увеличение и режим съемки в разделе «Объектив и камера». В качестве режима сбора данных выберите режим конфокальной щели 51 мкм .
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь для эксперимента был использован 20-кратный объектив для погружения в воду с числовой апертурой 0,95 и вращающийся диск с 50 мкм точечными отверстиями, расположенными на расстоянии 250 мкм.
6. На вкладке Пластина выберите используемую модель пластины.
7. Перейдите на вкладку Plate/Sites to Visit. В разделе Параметры сайта нажмите Фиксированное количество сайтов. Выберите количество столбцов и строк таким образом, чтобы была покрыта примерно вся лунка. Нажмите Перекрывать сайты на 10%.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эту кнопку необходимо активировать, чтобы обеспечить сшивание отдельных плиток.
8. Выберите только первую заполненную скважину для забора, щелкнув правой кнопкой мыши соответствующую скважину на карте скважины. Выбранные скважины выделены зеленым цветом, а невыбранные скважины — серым.
9. Переместите сцену в положение, где должна быть ткань, щелкнув левой кнопкой мыши по первой заполненной лунке на карте пластины и на участке рядом с центром на карте сайта. Ищите более темный цвет лунки и участка с указанием текущего положения.
10. Перейдите на вкладку Приобретение . Выберите опции Включить лазерную фокусировку и Получить серию Z.
11. Перейдите на вкладку Получение/Автофокусировка . Для автофокусировки «Скважина к скважине» выберите параметр «Фокус на пластине и дне скважины », а для параметра «Автофокусировка на площадке» выберите опцию « Все сайты ».
12. Перейдите на вкладку «Длины волн» и выберите количество красителей, которые будут отображаться в текущем цикле. Найдите соответствующее количество новых вкладок, которые открываются под вкладкой «Длины волн».
13. Перейдите на первую вкладку длины волны. В разделе Освещение выберите настройки фильтра, наиболее подходящие для интересующего флуорофора (например, выберите DAPI , если использовался метод Хёхста).
14. Выберите «Лазер» со смещением по оси Z для позиционирования по оси Z и нажмите кнопку «Рассчитать смещение», чтобы задать правильную высоту изображения. Серия изображений будет получена в разных z-положениях. Выбирайте тот, где образец лучше всего сфокусирован.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что положение рабочей области установлено в месте с тканью. Если в этом месте ткань не видна, выберите другой участок и повторите попытку (см. шаг 4.9).
15. Нажмите кнопку «Фокус» и подождите, пока не появится изображение ткани в фокусе.
16. Для Мощности освещения выберите 50%. Введите 2000 в поле Максимальная интенсивность цели и нажмите Auto Expose для автоматической регулировки времени экспозиции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для ускорения сбора данных мощность лазера может быть увеличена, что должно сократить время экспозиции. Однако это может привести к большему фотообесцвечиванию, что приведет к появлению артефактов изображения, где отдельные плитки накладываются друг на друга.
17. Для серии Z выберите Серия Z и Проекционное изображение 2D, а для Коррекции затенения выберите Только затенение FL.
18. Повторите шаги 5.13-5.17 для других длин волн, но вместо Лазер со смещением по оси Z выберите смещение по оси Z от W1 и выберите значение 0.
19. Перейдите на вкладку «Серия Z ». Введите желаемый размер шага (для цели 20x используйте размер шага 0,5 мкм).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость сбора данных может быть увеличена за счет использования шага в 2-3 раза больше рекомендуемого значения.
20. Нажмите кнопку «Фокус» и подождите, пока не появится стрелка с надписью о текущем положении .
21. Нажмите на кнопку «Начать трансляцию » и дождитесь появления нового окна с живыми изображениями. Перетаскивайте стрелку текущего положения до тех пор, пока не достигнете нижней части ткани, и нажмите кнопку «Установить B ». Перетаскивайте стрелку текущего положения до тех пор, пока не будет достигнута верхняя часть ткани, и нажмите кнопку Set T . Нажмите на F2: Стоп.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В разделе «Активная длина волны» можно выбрать длину волны, используемую для изображения в реальном времени.
22. Выберите участки для приобретения; Во-первых, убедитесь, что сцена находится на первом углублении, щелкнув по ней левой кнопкой мыши и снова нажмите Start Live . Переходите к различным позициям внутри скважины, щелкая левой кнопкой мыши по разным местам на карте участка. Найдите границу ткани и отметьте все участки, содержащие ткань, для извлечения , щелкнув правой кнопкой мыши. Выбранные сайты будут зелеными, а невыбранные сайты серыми.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент делайте это только для первой скважины и убедитесь, что для приобретения выбрана только первая скважина.
23. Перейдите на вкладку «Выполнить ». В качестве имени пластины назовите его "Cycle{i}_Well{w}_{description}"; Замените {i}, {w} и {description} соответствующими значениями/описанием.
24. Нажмите « Сохранить протокол » и сохраните его, снова добавив «Cycle{i}_Well{w}» в имя.
25. Настройте регионы сбора для всех остальных скважин. Для этого повторите шаги 5.22-5.24.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой скважины необходимо сохранить отдельный файл протокола. Убедитесь, что правильная скважина активирована, прежде чем рисовать новую окупаемость инвестиций. В результате должен быть получен один сохраненный протокол на каждую скважину. Это необходимо, так как ткани имеют разную форму от колодца к колодцу. В случае, если ROI и z-stack идентичны между скважинами, повторяющиеся шаги 5.22-5.24 могут быть пропущены, а также шаги 5.26-5.29. В этом случае просто выберите все скважины для получения изображения (см. шаг 5.22), перейдите на вкладку Run и нажмите Acquire Plate.
26. Нажмите «Управление» | Журнал | Начните запись и сразу же Управление | Журнал | Остановите запись. Сохраните созданный журнал и откройте его снова через Управление | Журнал | Редактировать журнал.
27. На левой панели найдите и дважды щелкните на Plate Acquisition - Load Protocol From File и на Plate Acquisition , чтобы добавить эти шаги в журнал; Ищите их на правой панели. Дважды щелкните мышью по добавленной опции Plate Acquisition - Load Protocol From File и выберите протокол, сохраненный для первой скважины (см. шаг 5.24).
28. Повторите шаг 5.27 для каждой скважины, которую необходимо получить, всегда загружая соответствующий протокол.
29. Нажмите Сохранить и, наконец, Запустить журнал , чтобы начать сбор данных (требуется примерно 3 часа для получения 180 плиток с z-стеком 15 μм).

6. Флуорофорное отбеливание (День 2)

1. Примерно за 30 минут до окончания журнала приготовьте отбеливающий реагент. Растворите 10 мг борогидрида лития в 10 мл ddH₂O и пропустите через фильтр 0,22 мкм. Оставить на 10 минут, дождавшись образования пузырьков. Для обеспечения эффективного отбеливания используйте отбеливающий реагент в течение 4 часов после приготовления.
   ВНИМАНИЕ: Работайте под химическим колпаком при работе с борогидридом лития, так как он может вступать в реакцию с воздухом и выделять газообразный водород, который легко воспламеняется.
2. Отбеливайте флуорофоры 1 мл 1 мг/мл борогидрида лития в течение 15 минут при воздействии стандартного окружающего освещения. Ищите мелкие пузырьки на ткани во время процедуры отбеливания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При работе под химическим колпаком следите за тем, чтобы освещение не выключалось автоматически во время процедуры отбеливания.
3. Повторите отбеливание еще 1 мл 1 мг/мл боргидрида лития (приготовленного из того же раствора) в течение 15 минут.
4. Промойте лунку в течение 3 х 5 минут 1 мл PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не сокращайте время промывки, так как неполное удаление отбеливающего реагента может повредить следующую панель антител.

7. Циклы IBEX (День 2)

1. Применяют первичные антитела для следующего цикла иммуномечения (шаг 3.7) и инкубируют при 4 °C в течение ночи. Повторите шаги 4.4-5.4.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 4.2-4.3 не повторяются, так как несвязанное антитело кролика используется только в первом цикле IBEX. Тем не менее, несвязанные антитела, выращенные у менее распространенных видов, таких как курица или морская свинка, также могут быть использованы в более поздних циклах, поскольку их вторичные антитела не будут вступать в перекрестную реакцию со связанными первичными антителами. Точную информацию об антителах, используемых в каждом цикле, можно найти в Таблице материалов.
2. На микроскопе загрузите настройки протокола из предыдущего цикла IBEX для соответствующей лунки, нажав на кнопку Загрузить протокол, сохраненный на локальном ПК как Cycle{i}_Well{w} (шаг 5.24). Настройки протокола будут содержать ROI (выбранные плитки для получения), увеличение, настройки автофокусировки и любые дополнительные настройки сбора, сохраненные из предыдущего цикла IBEX (шаги 5.5-5.25).
3. Выберите вкладки длины волны и отрегулируйте экспозицию и мощность освещения для новой панели антител (шаги 5.12-5.18). Обязательно отображайте один маркер (обычно DAPI или Hoechst) на протяжении всех циклов, чтобы выровнять циклы впоследствии.
   Примечание: Как сообщается в работе Radtke et ^al.18, широко используемые флуоресцентные белки, такие как GFP и tdTomato, не чувствительны к обесцвечиванию борогидридом лития. При работе с тканями, содержащими эндогенные флуоресцентные белки, такие как tdTomato, соответствующая длина волны может быть опущена из сбора данных после цикла 1, если она не нужна для регистрации изображения – это ускорит визуализацию. Длины волн можно удалить на вкладке «Общая длина волны », уменьшив количество каналов сбора данных. Более того, последовательного увеличения аутофлуоресценции тканей в течение циклов визуализации не наблюдалось; Однако это, вероятно, будет варьироваться в зависимости от типа ткани¹⁸.
4. Проверьте, являются ли настройки z-Stack все еще приемлемыми, и отрегулируйте их соответствующим образом (шаги 5.19-5.21).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что размер шага z-стека одинаков для всех циклов.
5. Обновите имя пластины на вкладке «Выполнить» и повторно сохраните протокол.
6. Повторите шаги 7.2-7.5 для всех скважин, которые необходимо приобрести.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется записать настройку Экспозиция для всех длин волн, используемых в первой скважине, и использовать ту же настройку во всех последующих скважинах.
7. Отредактируйте журнал, выберите новые файлы протоколов и сохраните журнал для этого цикла.
8. Запустите журнал.
9. Повторите шаги 6.1-6.4 для отбеливания флуорофоров.
10. Повторяйте шаги 7.1-7.9 до тех пор, пока не будет достигнут желаемый объем иммуномечения.

8. Обработка изображений (День 2)

1. После завершения получения изображений циклов IBEX, экспортируйте данные изображений:
   1. Выбрать скрининг | Утилиты для обработки данных на пластинах | Экспорт изображений.
   2. Нажмите кнопку Выбрать пластины и выберите все полученные пластины для каждого цикла и скважины.
   3. Выберите All Z Planes, выберите выходной каталог и нажмите OK для экспорта данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Данные будут экспортированы в виде отдельных файлов tiff для каждой плитки и плоскости. Чтобы объединить все тайлы и циклы, были выполнены следующие этапы обработки.
2. Расположите экспортируемые данные по папкам по следующей схеме: убедитесь, что каждый цикл представляет собой одну папку, каждая из которых содержит по одной папке для каждой скважины. Назовите так: "\cycle{i}\{well}\*_Plate_*", где {i} и {well} - соответствующий цикл и well, а * - любой символ. Например: "\cycle1\A01\some_name_Plate_8654"
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для последующих этапов обработки требуется правильное именование и структура папок.
3. Установите необходимые пакеты python: используйте Miniforge для управления средой Python. Инструкции по установке см. в https://github.com/conda-forge/miniforge.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Код для этапов обработки предоставляется в виде Jupyter Notebooks. Их можно найти на https://github.com/ZMB-UZH/zmb-ibex-jove или в виде дополнительных файлов (Supplemental File 1, Supplemental File 2, Supplemental File 3, Supplemental File 4 и Supplemental File 5).
4. При скачивании кода с Github скачайте все файлы, нажав Code | Скачайте ZIP-архив и следуйте инструкциям по установке в файле README.md.
5. Запустите Jupyter-Lab (Дополнительный файл 2):
   1. Активируйте установленную среду conda, войдя в conda activate zmb-ibex-jove в терминале.
   2. В терминале перейдите на загруженный каталог, введя, например, cd C:\path\to\zmb-ibex-jove.
   3. Запустите Jupyter-Lab, войдя в jupyter-lab в терминале. Откроется окно браузера с jupyter-lab.
6. Рассчитать поправку на освещенность:
   1. На левой вкладке перейдите к блокноту « examples/01_get_flatfield_BaSiC.ipynb» и откройте его, дважды щелкнув по нему. Этот блокнот будет рассчитывать изображения коррекции освещенности, используя библиотеку BaSiCPy (Дополнительный файл 3).
   2. Измените "base_dir" и "save_dir" на правильные пути, где находятся данные, и где должны быть сохранены изображения коррекции освещенности.
   3. Чтобы запустить код в записной книжке, выделите каждую ячейку и нажмите Shift+Enter для его выполнения. Проведите блокнот сверху вниз.
7. Выполните сшивание для каждого отдельного цикла (Дополнительный файл 4):
   1. На левой вкладке перейдите к следующей записной книжке и откройте ее: "02_stitching_MD.ipynb". В этой записной книжке для каждого цикла загружаются отдельные плитки, корректируется освещение и сшиваются друг с другом, в результате чего получается один файл изображения для каждой лунки и цикла. Используйте библиотеку m2stitch (https://github.com/yfukai/m2stitch) для сшивки.
   2. Измените входные данные в первой ячейке на правильные пути к файлам. Снова запустите блокнот сверху вниз.
8. Выполните регистрацию изображений между циклами (Дополнительный файл 5):
   1. На левой вкладке перейдите к следующей записной книжке и откройте ее: "03_registration_pcc.ipynb". В этой записной книжке отдельные циклы выравниваются друг относительно друга с помощью только трансляционных преобразований, которые вычисляются с помощью алгоритма фазовой перекрестной корреляции из библиотеки scikit-image (https://scikit-image.org/) с открытым доступом.
   2. Измените входные данные в первой ячейке на правильные пути к файлам. Выберите опорный цикл и используемый опорный канал (обычно DAPI). Снова запустите блокнот сверху вниз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо выполнить только одну из глав "Вариант 1: Загрузить и сохранить все каналы вместе" и "Вариант 2: Загрузить и сохранить каналы как отдельные файлы". В первой главе будет создан один большой файл, содержащий все каналы всех циклов. Во второй главе будет создан отдельный файл для каждого канала. Второй вариант потребует меньше памяти для обработки.

9. Анализ изображений (День 2)

1. Загрузите и откройте Fiji (https://imagej.net/software/fiji/downloads).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Результирующие изображения будут многоплоскостными и многоканальными изображениями, которые могут быть проанализированы как 3D-изображения. Здесь показан пример рабочего процесса анализа только для 2D-данных, для которых сначала вычисляется проекция максимальной интенсивности.
2. Откройте файл на Фиджи, перетащив его в окно Фиджи.
3. Рассчитайте проекцию максимальной интенсивности, выбрав Изображение | Стеки | Z Project..., выберите Максимальная интенсивность и нажмите OK. Пересохранить изображение с помощью File | Сохранить как | ОМЕ-ТИФФ».
4. Для анализа клеток используется программное обеспечение с открытым исходным кодом QuPath; Скачайте и установите его из https://qupath.github.io/.
5. Откройте QuPath и создайте новый проект, перетащив пустую папку в окно.
6. Импортируйте все файлы в проект, перетащив их в окно QuPath и нажав Импорт со стандартными настройками.
7. Дважды щелкните по изображению на левой панели, чтобы открыть его. Укажите его как Флуоресценция при появлении запроса.
8. Откройте окно Яркость/Контрастность, нажав Shift+C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь можно выбрать, какие каналы будут отображаться, а также отрегулировать яркость и контрастность. Также можно изменить названия и цвета каналов, дважды кликнув по названиям.
9. Выберите Инструменты | Polygon и аннотируйте область ткани. Найдите новую аннотацию на вкладке Аннотации. Установите для него определенный класс, выбрав аннотацию, выбрав класс (например, Other) и нажав Set class.
10. Обнаружение клеток: перейти к анализу | Обнаружение клеток | Обнаружение клеток.
    1. Выберите ядерный канал.
    2. Оставьте большинство настроек без изменений, но отрегулируйте порог , наведя курсор мыши на ядро и отметив интенсивность, отображаемую в правом нижнем углу. Наведите курсор на область фона и снова обратите внимание на интенсивность. Выберите значение, находящееся на полпути между фоном и передним планом, в качестве порога.
    3. Нажмите кнопку Выполнить.
11. Проверка ячеек и измерений:
12. Дважды кликнув по ячейке или выбрав ее на вкладке Иерархия, ознакомьтесь с ее измерениями в нижней левой панели. Следует добавить различные измерения формы и интенсивности для клетки, ядра и цитоплазмы.
13. Классифицируйте ячейки:
    1. Чтобы классифицировать обнаруженные ячейки по интенсивности в канале, перейдите в раздел Классифицировать | Классификация объектов | Создание единого классификатора измерений.
    2. Выберите нужный канал в разделе Фильтр каналов и соответствующее измерение в поле Измерение (например, Ячейка: Среднее значение канала).
    3. Отрегулируйте порог, снова наведя курсор мыши на положительную ячейку и на отрицательную ячейку и выбрав значение между ними.
    4. Выберите, например, положительное значение для значения выше порогового значения и отрицательное значение для значения ниже порогового значения. Проверьте результат, проверив предварительный просмотр в режиме реального времени.
    5. Нажмите кнопку Применить, чтобы классифицировать ячейки.
14. Измерьте расстояние до аннотированных объектов (например, нервных пучков):
    1. Выберите Инструменты | Инструмент «Кисть».
    2. Нарисуйте над областями интереса (например, нервными пучками).
    3. Перейдите на вкладку Аннотации . Выберите все новые аннотации, выберите соответствующий класс и нажмите кнопку Задать класс.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Можно создать новый класс, щелкнув правой кнопкой мыши в окне класса и выбрав Добавить/Удалить | Добавьте класс.
    4. Перейти к анализу пространственного анализа | Подписанное расстояние до аннотаций 2D и нажмите Yes при появлении запроса.
    5. Добавьте в каждую ячейку новое измерение, указывающее расстояние до ближайшей аннотации данного класса.
15. Экспорт измерений:
    1. Перейти к измерению | Отобразите измерения обнаружения и подождите, пока не появится список всех измерений всех обнаружений.
    2. Экспортируйте таблицу в виде .txt с помощью кнопки «Сохранить ».
    3. Импортируйте данные в выбранное программное обеспечение для обработки данных для дальнейшего анализа.

Results

Этот метод позволяет адекватно обнаруживать пролиферирующие типы клеток путем сочетания химии EdU Click-iT с IBEX в фиксированных замороженных срезах кожи мышей. Сравнение детекции пролиферирующих типов клеток проводилось с использованием различных методологий, в частности, мечения пролиферирующих типов клеток антителом Ki-67 и детекции пролиферации клеток с помощью химического подхода EdU Click-iT (рис. 1). Мы заметили, что мечение антителами Ki-67 недооцени...

Discussion

Пролиферация клеток является одним из четырех основных этапов восстановления кожи, и переход между воспалительной фазой и пролиферативной фазой имеет решающее значение для успешного процесса восстановления^. Хорошо регулируемый иммунный ответ имеет важное значение, так как длительное воспаление может привести к хроническим ранам, что является^{серьезной проблемой глобального здравоохранения.} Пролиферация явля...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Антитела и реагенты	ИСТОЧНИК	ИДЕНТИФИКАТОР	Комментарии
<сильные>антитела
CD31 Alexa Fluor 647 (Цикл 2)	BioLegend	Кот#102516	1:100
AB_2161029
CD45 Alexa Fluor 488 (Цикл 2)	BioLegend	Кот#103122	1:100
AB_493531
Ki-67 FITC (Цикл 1)	BioLegend	Кот#151212	1:50
AB_2814055
Курица Ki-67 (ck)	LSBio	Кот#LS-C772946	1:800
Крыса Ki-67 (rt)	BioLegend	Кот#652402	1:100
AB_11204254
Нейрофиламент H& M (NF-H/NF-M) Alexa Fluor 647 (цикл 3)	BioLegend	Cat#837710	1:300
AB_2734613
стр. 75NTR (Цикл 1)	Технология клеточной сигнализации	Cat#8238                                            AB_10839265	1:1500
Vimentin Alexa Fluor 488 (цикл 3)	BioLegend	Кот#699305	1:100
AB_2888889
Alexa Fluor 647 против осла	Jackson ImmunoResearch	Cat#711-605-152
<сильные>реагенты
Стеклянная нижняя пластина Cellvis 24 колодца	Cellvis	P24-1.5H-N
Хромовый алюмный желатин	Снабжение новичков	Cat#1033A
Click-iT EdU kit	Термо Фишер Сайентифик	C10637
Hoechst 33342	Сигма-Олдрич	Cat#14533; CAS# 23491-52-3
LiBH4, литий-борогидрид, 95%	Термо Фишер Сайентифик	Кот#10438443
Tissue-Tek O.C.T Compound Sakura	Biosystems Швейцария	Cat#7109-4583
PBS	Термо Фишер Сайентифик	Cat#10010-015
Слайды микроскопа Superfrost Plus Adhesion	Эпредия	Кот#J1800AMNZ
Triton X-100	Sigma-Aldrich	Cat#T8787
<Сильно>Снаряжение
Щётка для волос и bbsp;	Faust AG	Кошка#9172051 и 9172050
Клинки микротома	Biosystems Швейцария	Кот#207500011
Микроскоп	Молекулярные устройства, ImageXpress Конфокальный HT.ai
Oven	Термо Фишер Сайентифик	Кот#HBMCR4220
Рокер шейкер	Эдмунд Б&умл; hler GmbH	Кот#32310015