Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Коллекция экзосом, высвобождаемых естественным путем из опухолевой ткани

599 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67739

⸱

10 июня 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Medicine and Engineering Interdisciplinary Research Laboratory of Nursing & Materials, West China Hospital, Sichuan University/West China School of Nursing, Sichuan University, 2Department of Occupational Diseases, The Second Affiliated Hospital of Chengdu Medical College Nuclear Industry 416 Hospital, 3Department of Plastic and Burn Surgery, West China School of Medicine, West China Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол демонстрирует новый метод извлечения экзосом из опухолевых тканей путем их естественного высвобождения и многократного сбора, чтобы обеспечить экспериментальную основу для изучения функции экзосом в развитии опухоли.

Аннотация

В виде везикул, секретируемых клетками, экзосомы заключают в себе и переносят различные нуклеиновые кислоты, белки и липиды, а также участвуют в коммуникации между различными клетками. Экзосомы в опухолевом микроокружении играют важную роль в биологических характеристиках опухолевых клеток и могут сильно влиять на состояния других клеток. Поэтому для дальнейшего изучения специфических функций экзосом в развитии опухолей, несомненно, необходимо извлекать и выделять экзосомы из тканей опухоли. Прямая экстракция экзосом из опухолевой ткани снижает потребность в культуре клеток in vitro , а экзосомы из опухолевой ткани могут быть более похожи на экзосомы в естественном состоянии. Поэтому поддержание естественного состояния экзосом в опухолевой ткани является ключом к процессу экстракции. Ферментативное расщепление часто сочетают с ультрацентрифугированием для извлечения экзосом из тканей опухоли. В этой статье мы предлагаем новый метод извлечения экзосом из опухолевой ткани. Мы использовали бессывороточную среду для инкубации небольших кусочков опухолевой ткани на встряхивающем столе, неоднократно собирали и извлекали экзосомы, естественно высвобождаемые из опухолевой ткани, и идентифицировали структуру, концентрацию и характеристики экстрагированных экзосом, предоставив новый метод для исследователей, изучающих функцию экзосом в развитии опухоли.

Введение

Экзосомы представляют собой подтип внеклеточных везикул, секретируемых клетками, обычно размером от 30 нм до 200 нм 1,2. Они участвуют в межклеточной коммуникации и доставляют различные сигнальные молекулы, включая нуклеиновые кислоты (например, дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), матричную РНК (мРНК), микрорибонуклеиновую кислоту (микроРНК), длинную некодирующую РНК (lncRNA), кольцевую РНК (circRNA)), белки и липиды 1,3,4,5, клеткам-реципиенуклеивам для влияния на их физиологические функции 6,7. Первоначально идентифицированные в ретикулоцитах овец8, экзосомы с тех пор были идентифицированы в различных жидкостях организма, включая кровь, слюну, мочу, спинномозговую жидкость, асцит, амниотическую жидкость и грудное молоко 9,10,11,12,13,14,15,16 . Более того, экзосомы могут секретироваться многими типами клеток, включая лимфоциты, макрофаги, тучные клетки, жировые клетки и опухолевыеклетки. Благодаря своему широкому распространению экзосомы играют решающую роль в различных патологических процессах, особенно в раке, и в различных физиологических процессах, включая эмбриональное развитие, восстановление и регенерацию тканей, а также иммунную регуляцию 18,19,20.

В последние годы было показано, что экзосомы способствуют возникновению опухолей, инвазии, метастазированию, резистентности к химиотерапии и противоопухолевому или проопухолевому иммунитету 20,21,22. Экзосомы, полученные из рака, могут активировать экспрессию генов в рецепторах или соседних раковых клетках, изменяя их биологические фенотипы, а раковые клетки могут взаимодействовать со стромальными клетками в микроокружении опухоли, способствуя пролиферации, инвазии и ангиогенезу раковых клеток 23,24,25. Экзосомы, высвобождаемые опухолевыми клетками, могут помогать им выводить токсичные лекарства, а экзосомы, полученные из стромальных клеток, могут способствовать образованию раковых клеток. Экзосомы ракового происхождения участвуют в различных стадиях метастазирования раковых клеток, включая инвазию в соседние ткани, перенос через кровеносную систему и распространение в отдаленные органы20. Наконец, экзосомы выполняют как иммуноактивационные, так и иммуносупрессивные функции при раке, в зависимости от лигандов, белков и микроРНК, которые они несут20. Благодаря важным функциям экзосом, полученных из опухолевой ткани, они демонстрируют потенциальную прикладную ценность для ранней диагностики, точного лечения и прогностического мониторинга опухолей21,22.

Учитывая важность экзосом, полученных из опухолевой ткани, многие исследователи пытались извлечь их для дальнейшего изучения их свойств и функций. Прямая экстракция экзосом из опухолевых тканей не только снижает потребность в культуре клеток in vitro, но и больше напоминает естественное состояние экзосом. Поэтому поддержание естественного состояния экзосом в опухолевой ткани является ключом к процессу экстракции. Физические свойства экзосом лежат в основе общих методов экстракции, и редко учитываются изменения в компонентах экзосом, вызванные стимуляцией в процессе экстракции. На самом деле, на качество экзосом сильно влияют различные процедуры экстракции экзосом26,27. В настоящее время опухолевые ткани расщепляются ферментами и подвергаются таким методам, как центрифугирование с градиентом плотности, ультрацентрифугирование, ультрафильтрация, эксклюзионная хроматография (SEC), осаждение полимеров, иммуноаффинная хроматография и микрофлюидные методы, перед разделением 2,21,28,29 . Здесь мы предлагаем метод извлечения экзосом из опухолевой ткани. Мы использовали бессывороточную среду для культивирования небольших блоков опухолевой ткани в шейкере, затем собрали и экстрагировали экзосомы, естественно высвобождаемые опухолевой тканью, и определили концентрацию и характеристики экстрагированных экзосом, предоставив исходные материалы и экспериментальные доказательства для изучения функции экзосом в развитии опухоли.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты, связанные с экзосомами опухолевой ткани, проводились в соответствии с соответствующими руководствами и правилами. Данное исследование было одобрено и проведено в соответствии с руководящими принципами Комитета по этике Западно-Китайской больницы Сычуаньского университета (20220301101). Через четыре недели после инокуляции клетками SGC-7901 одна голая мышь (BALB/c, самец, 8 недель, 26 г) была усыплена через вывих шейки матки.

1. Приобретение опухолевой ткани

  1. Замочить в 75% спирте на 5 минут.
  2. Переместитесь на стерильный операционный стол, с помощью стерильных хирургических ножниц вскройте наружную кожу эктопической опухоли.
  3. Снимите кожу с эктопической опухолевой ткани, затем разрежьте и взвесьте, чтобы получить две части одинакового веса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Один кусочек опухолевой ткани используется для экстракции экзосом в соответствии с этим протоколом, а другой кусочек опухолевой ткани равного веса используется для экстракции экзосом путем ферментного расщепления30.

2. Предварительная подготовка опухолевой ткани

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте эти действия на льду и в стерильной среде.

  1. Пипетка 10 мл предварительно охлажденного фосфатного буферного раствора (PBS) (0,01 М) для промывания опухолевой ткани для удаления поверхностной крови и жира.
  2. Разрежьте опухолевую ткань (~400мм3) на кусочки по 1-2 мм с помощью офтальмологических ножниц в 20 мл PBS с 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в 10-см стерильной чашке Петри. Переложите вышеуказанную смесь в коническую пробирку объемом 50 мл.

3. Высвобождение экзосом

  1. Центрифугируйте пробирку с шага 1.2 при 200 × г в течение 5 минут при 4 °C.
  2. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу 20 мл среды Minimum Essential Medium α (α-MEM). Инкубировать при 37 °C при 100 об/мин в течение 1 ч в шейкере постоянной температуры.
  3. Центрифугировать при 200 × г в течение 5 мин при 4 °C.
  4. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу 10 мл среды α-MEM. Инкубировать при 37 °C при 100 об/мин в течение 6 ч в шейкере постоянной температуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны во всех шагах. Достаточно короткой инкубации и одной промывки средой α-MEM для удаления внутриклеточных компонентов, вытекающих из-за разреза, в том числе внутриклеточных везикул и органелл.
  5. Центрифугируйте при 200 × г в течение 5 мин, 4 °C и соберите надосадочную жидкость в новую пробирку.
  6. Ресуспендируйте опухолевую ткань 10 мл среды α-MEM.
  7. Повторите инкубацию с шага 2.4, а затем с шага 2.5.
  8. Смешайте средние надосадочные жидкости, собранные на шагах 2.5 и 2.7.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны во всех шагах. Две 6-часовые инкубации индуцировали естественное высвобождение экзосом из кусочков опухолевой ткани.

4. Ультрацентрифугирование

  1. Отфильтруйте надосадочную жидкость через микропористый фильтр 0,45 мкм.
  2. Центрифугируйте надосадочную жидкость при давлении 12 000 × г в течение 30 мин при 4 °C для удаления крупных пузырьков.
  3. Перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку и центрифугируйте при давлении 120 000 × г в течение 90 мин при 4 °C для сбора экзосом.
  4. Промойте осадок экзосомы PBS (0,01 М) и снова центрифугируйте при 140 000 × г в течение 60 мин при 4 °C.
  5. Суспендировать осажденные экзосомы в PBS (0,01 M) для немедленного использования или хранения при -80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны во всех шагах. Выполняйте каждый шаг с минимально возможной центробежной силой и кратчайшим временем центробежного воздействия.

5. Представление результатов идентификации экзосом

  1. Определение морфологии экзосом из опухолевой ткани с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ)30.
  2. Определение размера и концентрации экзосом из опухолевой ткани с помощью анализа с отслеживанием наночастиц (NTA)30.
  3. Идентификация экзосомальных белковых маркеров CD9 и CD63 с помощью вестерн-блоттинга (WB)30.
    Примечание: Последние рекомендации по исследованию экзосом, включая использование CD63, CD9, в качестве критериев длямаркеров экзосом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

ТЭМ показала, что экзосомы, полученные из опухолевой ткани с помощью этого метода, имеют типичные чашеобразные структуры (рисунок 1A), и не было существенной разницы между формой экзосом, извлеченных этим методом, и путем ферментного расщепления (рисунок 1B). Результаты NTA показали, что средний диаметр экзосом составил 172,8 нм, что находилось в диапазоне 30-200 нм и соответствовало размеру экзосом; концентрация частиц составила 5,9 × 106/мл (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом методе экзосомы, полученные из опухолевой ткани, были извлечены из тканей эктопического рака желудка голых мышей, и ключевыми этапами были высвобождение, экссудация, разделение и очистка экзосом. Различные методы разделения экзосом были разработаны и проверены в соответствии с физическими свойствами и составом экзосом 2,21,28,29, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки, но ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

Эта работа была поддержана Программой поддержки науки и технологий провинции Сычуань (2024NSFSC0592, 2023YFS0064).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
α-MEMHyCloneSH30265.01B
Anti-CD63 антителоBiossbsm-43117M
Anti-CD9 антителоBiossbs-2489R
Центрифужная пробиркаThermo339650
Шейкер постоянной температурыThermoMAXQ4450
Одноразовая стерильная пипетка-10 млJET
EDTABiosharpBS107
Электрическая пипеткаThermo9501
Горизонтальная контролируемая температурная центрифугаThermoSorvall ST1R plus
Анализатор слежения за наночастицамиMalvinNanoSight Pro
Офтальмальные ножницыJinzhongY3D010
PBSHyCloneSH30256.01B
Фосфовольфрамовая кислота   Sigma455970-10G
Хирургические ножницыJinzhongJ21010
Вторичное антителоBiossBs-0295GGoat Anti-rabbit IgG H& L/FITC
Просвечивающий электронный микроскопNikonPlan Apo WF
Ультрацентробежная трубкаBeckman355618
GSP01001

Ссылки

  1. Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066(2015).
  2. Zhou, B., et al. Application of exosomes as liquid biopsy in clinical diagnosis. Signal Transduct Target Ther. 5, 144(2020).
  3. Rani, S., O'Brien, K., Kelleher, F., Corcoran, C., Germano, S., Radomski, M., et al. Isolation of exosomes for subsequent mRNA, MicroRNA, and protein profiling. Methods Mol Biol. 784, 181-195 (2011).
  4. Zhou, L., et al. The biology, function and clinical implications of exosomes in lung cancer. Cancer Lett. 407, 84-92 (2017).
  5. D'Agostino, E., et al. Exosomal microRNAs: Comprehensive methods from exosome isolation to miRNA extraction and purity Analysis. MicroRNA Profiling. 2595, 75-92 (2022).
  6. Whiteside, T. Tumor-derived exosomes and their role in cancer progression. Adv Clin Chem. 74, 103-141 (2016).
  7. Ludwig, N., Whiteside, T., Reichert, T. Challenges in exosome isolation and analysis in health and disease. Int J Mol Sci. 20 (19), 4684(2019).
  8. Johnstone, R., Adam, M., Hammond, J., Orr, L., Turbide, C. Vesicle formation during reticulocyte maturation. Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes). J Biol Chem. 262, 9412-9420 (1987).
  9. Li, B., Cao, Y., Sun, M., Feng, H. Expression, regulation, and of exosome-derived miRNAs in cancer progression and therapy. FASEB J. 35 (10), e21916(2021).
  10. Caby, M., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int Immunol. 17, 879-887 (2015).
  11. Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (36), 13368-13373 (2004).
  12. Street, J., et al. Identification and proteomic profiling of exosomes in human cerebrospinal fluid. J Transl Med. 10, 5(2012).
  13. Palanisamy, V., et al. Nanostructural and transcriptomic analyses of human saliva derived exosomes. PLoS ONE. 5, e8577(2010).
  14. Runz, S., et al. Malignant ascites-derived exosomes of ovarian carcinoma patients contain CD24 and EpCAM. Gynecol Oncol. 107, 563-571 (2007).
  15. Keller, S., et al. CD24 is a marker of exosomes secreted into urine and amniotic fluid. Kidney Int. 72, 1095-1102 (2007).
  16. Admyre, C., et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J Immunol. 179, 1969-1978 (2007).
  17. Simpson, R., Lim, J., Moritz, R., Mathivanan, S. Exosomes: proteomic insights and diagnostic potential. Expert Rev Proteomics. 6 (3), 267-283 (2009).
  18. Sung, B. H., Parent, C. A. Extracellular vesicles: Critical players during cell migration. Dev Cell. 56, 1861-1874 (2021).
  19. Xie, Q., et al. Exosome-mediated immunosuppression in tumor microenvironments. Cells. 11 (12), 1946(1946).
  20. Zhang, L., Yu, D. Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).
  21. Jiang, Z., Wang, H., Mou, Y., Li, L., Jin, W. Functions and clinical applications of exosomes in pancreatic cancer. Mol Biol Rep. 49 (11), 11037-11048 (2022).
  22. Pegtel, D. M., Gould, S. J. Exosomes. Annu Rev Biochem. 88 (1), 487-514 (2019).
  23. Al-Nedawi, K., et al. Intercellular transfer of the oncogenic receptor EGFR VIII by microvesicles derived from tumour cells. Nat Cell Biol. 10, 619-624 (2008).
  24. Nazarenko, I., et al. Cell surface tetraspanin Tspan8 contributes to molecular pathways of exosome-induced endothelial cell activation. Cancer Res. 70, 1668-1678 (2010).
  25. Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol. 10, 1470-1476 (2008).
  26. Macias, M., et al. Liquid biopsy: from basic research to clinical practice. Adv Clin Chem. 83, 73-119 (2018).
  27. Brennan, K., et al. A comparison of methods for the isolation and separation of extracellular vesicles from protein and lipid particles in human serum. Sci Rep. 10, 1039(2020).
  28. Hu, J., et al. Application exosomes as nanocarriers in cancer therapy. J Mater Chem B. 11 (44), 10595-10612 (2023).
  29. Wang, C., et al. A light-activated magnetic bead strategy utilized in spatio-temporal controllable exosomes isolation. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1006374(2022).
  30. Crescitelli, R., et al. Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation. J Extracell Vesicles. 9 (1), 1722433(2020).
  31. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  32. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 3 (Unit 3.22), (2006).
  33. Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. J Extracell Vesicles. 5, 32945(2016).
  34. Li, W., et al. Comparison of the yield and purity of plasma exosomes extracted by ultracentrifugation, precipitation, and membrane-based approaches. Open Chem. 20, 182-191 (2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Экзосомы опухолиизоляция экзосомэкстракция экзосоммикроокружение опухолиультрацентрифугированиеферментативное перевариваниемежклеточная коммуникацияхарактеристика экзосомбезсывороточная среда

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.