Профилирование перметилированных муцин О-гликанов с помощью матричной лазерной десорбции/ионизационной времяпролетной масс-спектрометрии

Краткое содержание

Здесь мы представляем подробный протокол высвобождения О-гликанов из муцинов и последующего обессоливания, перметилирования и анализа с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF.

Аннотация

Времяпролетная масс-спектрометрия с матричной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOF MS) является мощным инструментом для профилирования муцингликанов, который обеспечивает высокую чувствительность и пропускную способность. Здесь мы предоставляем подробный протокол анализа O-связанных гликанов из муцинов с использованием MALDI-TOF MS, охватывающий высвобождение гликанов, обессоливание, перметилирование, а также сбор и анализ данных. Данное исследование показывает, что обессоливание на основе ионообменной хроматографии приводит к улучшению восстановления более крупных гликанов и улучшению качества получаемых спектров по сравнению с твердофазной экстракцией с использованием пористого графитизированного углерода (ПГХ). Кроме того, эта работа предполагает, что более длительное время реакции перметилирования, чем используется в настоящее время, может потребоваться для эффективной модификации сиаиловых структур. Мы также демонстрируем важность и необходимость данных о фрагментации и предварительных знаниях о путях биосинтеза О-гликана для точной идентификации состава и структуры гликанов, а также обсуждаем неотъемлемые преимущества и ограничения, которые MALDI-TOF представляет при анализе муцина О-гликанов.

Введение

Муцины — это крупные гликопротеины, которые составляют большую часть структурных компонентов слизи. Они вырабатываются специализированными эпителиальными клетками, называемыми бокаловидными клетками, и подвергаются обширному O-гликозилированию, прежде чем выделяться на поверхность слизистой оболочки. Гликозилирование муцинов происходит в аппарате Гольджи, где семейство специализированных гликозилтрансфераз, полипептид-N-ацетилгалактозаминовых трансфераз (ppGalNAc-T), инициирует процесс путем присоединения остатка GalNAc к серину (Ser) или треонину (Thr)¹. Затем арсенал гликозилтрансфераз расширяет гликановые структуры, добавляя галактозу (Gal), N-ацетилглюкозамин (GlcNAc), GalNAc, N-ацетилнейраминовую кислоту (Neu5Ac) и остатки фукозы (Fuc), в то время как другие углеводомодифицирующие ферменты могут осуществлять такие реакции, как сульфатация гликанов¹. Гликаны, которые украшают основу белка муцина, в основном находятся в кластерах в белковых областях, богатых остатками Ser и Thr, поскольку гидроксильные группы на боковой цепи этих остатков служат сайтами O-гликозилирования. Это плотное гликозилирование придает муцинам вид «бутылочной щетки» и отвечает за их физические свойства, такие как способность удерживать большое количество воды, их гелеобразующая способность и высокая вязкоэластичность ^2,3. Благодаря этим свойствам муцины обеспечивают смазку, защищают эпителий от обезвоживания и физических травм, а также образуют физический барьер между эпителием и его микроокружением ^4,5. Муцингликаны также могут служить связующими сайтами и источником углерода для комменсальных или патогенных бактерий ^6,7,8. Организация и состав слизи играют важную роль в защите эпителия, удерживая микробы поблизости, но вдали от поверхности эпителия. Муцингликаны также участвуют в межклеточной коммуникации и адгезии⁹.

Муцингликаны играют ключевую роль в поддержании гомеостаза слизистой оболочки, а аберрантные профили гликозилирования муцина связаны с нарушением барьерной функции, изменением состава микробиоты, увеличением метастазирования опухоли, воспалительными заболеваниями кишечника (ВЗК) и другими заболеваниями 10,11,12. Таким образом, изучение гликозилирования муцина имеет важное значение для понимания роли слизи и муцинов в здоровье человека и может привести к новым подходам к управлению или лечению заболеваний.

Методы, основанные на масс-спектрометрии, являются одними из самых популярных вариантов изучения муцингликанов. MALDI-TOF MS — это метод мягкой ионизации, который позволяет анализировать большие нелетучие биомолекулы, такие как гликаны и гликопротеины¹³. Этот подход обеспечивает высокую чувствительность и широкий диапазон масс, что позволяет обнаруживать и идентифицировать малораспространенные и разнообразные смеси гликанов. Кроме того, фрагментационные паттерны, полученные в экспериментах с тандемной масс-спектрометрией (МС/МС), могут предоставить ценную структурную информацию о составе гликана и его^{последовательности13}.

Как правило, анализ O-связанных гликанов из муцинов с помощью MALDI-TOF MS включает в себя многоступенчатый рабочий процесс, в котором O-гликаны сначала химически высвобождаются из белковой основы с использованием таких методов, как восстановительное устранение β, затем обессоливаются для удаления солей из химического высвобождения и дериватизируются для усиления ионизации и обнаружения. Очищенные, дериватизированные гликаны затем сокристаллизуются с подходящей матрицей MALDI на планшете-мишени MALDI, и получают масс-спектры, которые предоставляют информацию о массах интактных ионов гликанов. После этого гликаны фрагментируются в экспериментах с МС/МС для получения информации о структуре гликанов¹⁴. Здесь мы предоставляем подробный протокол высвобождения, обессоливания и перметилирования гликанов и анализируем их с помощью MALDI-TOF MS.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Схематическое изображение рабочего процесса приведено на рисунке 1 .

Рисунок 1: Схематическое изображение экспериментального рабочего процесса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

1. Высвобождение гликана

1. Приготовление буфера для элиминации β
   ПРИМЕЧАНИЕ: Его необходимо готовить свежим перед каждым использованием.
   1. Взвесьте гранулу гидроксида натрия (NaOH) и растворите ее в подходящем количестве_H2Oв пробирке объемом 50 мл, чтобы получить 0,1 М раствор.
   2. В пробирке объемом 5 мл растворите 189 мг борогидрида натрия (NaBH₄) в 5 мл щелочного раствора, приготовленного выше на шаге 1.1.1.
      ВНИМАНИЕ: NaOH вызывает коррозию, а NaBH₄ является коррозионным, токсичным, легковоспламеняющимся и представляет опасность для здоровья. С обоими химическими веществами следует работать в вытяжном шкафу с использованием подходящих средств индивидуальной защиты. Не растворяйте NaBH₄ непосредственно в H₂O, так как он разлагается и выделяет водород, который может самовоспламениться.
2. Настройка реакции элиминации β
   1. В стеклянном флаконе объемом 4 мл растворите до 100 μг очищенных муцинов в 250 μл_H2O.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые муцины могут не растворяться полностью и вместо этого образовывать взвесь очень мелких частиц.
   2. Добавьте 250 мкл буфера для элиминации β и плотно закройте флакон крышкой, покрытой ПТФЭ. Инкубируйте реакцию при 45 ^°C в течение 16 ч.
3. Остановка реакции
   1. В стеклянный флакон объемом 100 мл добавьте 5 мл ледяной уксусной кислоты к 95 мл H₂O (концентрация 5% (v/v)).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Его можно хранить при комнатной температуре и использовать повторно.  ВНИМАНИЕ: Уксусная кислота является легковоспламеняющейся и коррозионной и должна использоваться в вытяжном шкафу с необходимыми средствами индивидуальной защиты.
   2. На льду добавьте 1 мл 5% раствора уксусной кислоты в каждую реакцию (шаг 1.2.3) по каплям. На этом этапе следует обратить внимание на шипение от высвобождения водорода из избытка NaBH₄. Если шипение не прекратилось после добавления 1 мл 5% уксусной кислоты, повторите этот шаг.
      Примечание: Если при добавлении 5% уксусной кислоты не происходит шипения, то реакция элиминации β может быть неполной или неудачной.
4. Обессоливание образцов
   1. В стеклянном флаконе объемом 100 мл приготовьте плотную суспензию катионитобменной смолы, формы Н⁺ , 200-400 меш в 5% (v/v) уксусной кислоте.
   2. Заткните стеклянную пипетку небольшим количеством стекловаты. Добавьте 1,5 мл смоляной суспензии в стеклянную пипетку сверху и дайте ей отстояться и стечь. Для этого будет произведена обессоливание колонны.
   3. Промойте смолу 2 мл 5% уксусной кислоты. Откажитесь от проточной части.
   4. Добавьте образец муцина в обессоливающую колонну. Соберите проточный ток в пробирку объемом 5 мл.
   5. Промойте флаконы с образцами 1 мл 5% уксусной кислоты и загрузите ее в обессоливающую колонну. Соберите проточный поток в ту же трубку.
   6. Промойте колонку 2 раза 1 мл 5% уксусной кислоты. Соберите проточный поток в ту же трубку.
   7. Используйте центробежный испаритель для удаления уксусной кислоты и концентрирования образцов (5 мбар, 30 ^°C, 2 ч).
   8. Заморозьте образцы при температуре -80 ^°C и высушите их в течение ночи в сублимационной сушилке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, центробежное испарение может продолжаться до сухости, но это затруднит повторное растворение образцов.
   9. В стеклянный флакон объемом 100 мл добавьте 5 мл уксусной кислоты к 95 мл метанола (концентрация 5% (v/v)).
      ВНИМАНИЕ: Метанол легковоспламеняющийся и токсичный. Его следует использовать в вытяжном шкафу с необходимыми средствами индивидуальной защиты.
   10. Растворите образцы в 0,5 мл метаноловой уксусной кислоты и высушите образцы под потоком азота. Повторите этот шаг 3-5 раз. Храните высушенные образцы при температуре 4 ^°C.
5. Перметилирование гликанов
   1. В стеклянном флаконе объемом 8 мл смешайте 50% раствор NaOH (0,2 мл) с 0,4 мл метанола и тщательно перемешайте. Образуется белый осадок, который снова быстро растворится.
   2. С помощью стеклянного шприца добавьте 4 мл безводного диметилсульфоксида (ДМСО) и тщательно перемешайте.
   3. Центрифугируйте раствор в течение 2 мин при концентрации 2 000 × г. В результате в нижней части тюбика образуется гель, в середине — жидкая фаза, а в верхней части накапливаются соли.
   4. Осторожно сцедите надосадочную жидкость и соли, не повреждая гель.
   5. Повторите шаги 1.5.2-1.5.4 5 раз, пока соли не перестанут образовываться. Если соли прилипли к стенкам пробирки, аккуратно покрутите пробирку, чтобы вывести соли во взвешенном состоянии, не потревожив гель на дне, или удалите их с помощью стеклянной пастеровской пипетки.
   6. После того, как соли перестанут образовываться, ресуспендируйте гель в 4 мл безводного ДМСО. Эта суспензия является перметилирующим основанием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этого количества перметилирования достаточно для ~25 образцов. Количество может быть скорректировано соответствующим образом.
   7. К высушенным образцам добавьте 100 мкл безводного ДМСО и 150 мкл перметилирующего основания. С помощью стеклянной пипетки как можно быстрее добавьте 80 мкл йодметана, чтобы избежать поглощения влаги из окружающей среды.
      ВНИМАНИЕ: Йодометан токсичен и представляет опасность для здоровья и окружающей среды. Его следует использовать в вытяжном шкафу с необходимыми средствами индивидуальной защиты.
   8. Инкубируйте реакции перметилирования в течение 30 мин при комнатной температуре с энергичным встряхиванием.
   9. Добавьте 0,5 мл H₂O, чтобы завершить реакцию. Образцы помутнеют.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если образцы не мутнеют, возможно, реакция перметилирования была незавершенной.
   10. Промойте образцы азотом до тех пор, пока они не станут прозрачными.
   11. Загрузите образцы на 96-луночную экстракционную пластину (60 мг) с гидрофильно-липофильной балансировкой (HLB) или картриджи HLB. Приложите положительное давление, чтобы протолкнуть образцы через твердую фазу со скоростью потока ~1 мл/мин. При использовании картриджей HLB используйте резиновую соску или вакуумный коллектор для подачи давления на образцы. Откажитесь от проточной части.
   12. Промойте лунки 2 x 1 мл H₂O. Приложите положительное давление и выбросьте проточный.
   13. Выведите гликаны из пластины HLB, используя 1 мл метанола. Прикладывать давление следует только до тех пор, пока метанол не начнет выходить из тарелки. Затем гравитационного потока достаточно, чтобы обеспечить необходимую скорость потока. Соберите проток.
   14. Повторите этап элюирования еще раз.
   15. Высушите образцы с помощью центробежного испарителя
   16. В стеклянном флаконе объемом 4 мл приготовьте буфер TA50, смешав 1 мл ацетонитрила, 998 мкл H₂O и 2 мкл трифторуксусной кислоты.
       ВНИМАНИЕ: Ацетонитрил легковоспламеняется, а трифторуксусная кислота вызывает коррозию. Оба следует использовать в вытяжном шкафу, используя подходящие средства индивидуальной защиты.
   17. В микроцентрифужной пробирке приготовьте матричный раствор, растворив 10 мг супер-DHB [9:1 (w/w) смеси 2,5-дигидроксибензойной кислоты и 2-гидрокси-5-метоксибензойной кислоты] в 1 мл TA50.
   18. Растворите высушенные образцы в 10 μл TA50.
   19. Смешайте 1 мкл образца с 1 мкл матричного раствора, нанесите его на стальную целевую пластину MALDI и дайте ему высохнуть.

2. Анализ образцов MALDI TOF

1. Настройка получения данных родительских ионов
   1. Сделайте 1 000 выстрелов из лазера с интенсивностью 50%.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Они могут варьироваться в зависимости от глобальных настроек прибора и могут быть отрегулированы по мере необходимости.
   2. На вкладке Laser carrier (Носитель лазера ) установите настройку случайного блуждания на complete sample.
   3. На вкладке Обнаружение установите диапазон масс на 500 - 3 000; Увеличивайте этот диапазон, если сильные пики наблюдаются на уровне 2500-3000 м/з. Установите усиление датчика на 20x.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициент усиления может варьироваться в зависимости от глобальных настроек прибора и может быть отрегулирован по мере необходимости.
   4. На вкладке «Спектрометр» установите полярность на положительную, а для параметра «Подавление матрицы» — значение «Отклонение», 300 Да.
   5. Нажмите на Пуск | После завершения сбора данных нажмите кнопку Сохранить как , чтобы сохранить данные в соответствующем каталоге.
2. Открытие родительских спектров для получения спектров фрагментации
   1. Щелкнув правой кнопкой мыши по спектрам, выберите «Найти список масс».
   2. Из сгенерированного списка выберите соответствующие ионы для фрагментации и нажмите на кнопку «Добавить в список MS/MS» после щелчка правой кнопкой мыши по выбранным пикам.
   3. Щелкните правой кнопкой мыши еще раз по массовому списку и выберите список MS/MS.
   4. Нажмите « Отправить в flexControl».
   5. В flexControl загрузите метод LIFT и перейдите на вкладку LIFT .
   6. Выберите каждый загруженный пик один за другим и регистрируйте как родительские, так и фрагментные ионы, переключаясь между режимами Parent и Fragments. При необходимости отрегулируйте интенсивность лазера и количество выстрелов . Нажмите кнопку Сохранить , чтобы сохранить данные после фрагментации каждого родительского иона.
   7. Экспортируйте спектры в формате '.ascII'.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Позже это может быть импортировано в Glycoworkbench для дальнейшего анализа.
3. Анализ данных с помощью Glycoworkbench
   1. В Glycoworkbench загрузите экспортированный файл масс-спектра .ascII и выполните коррекцию базовой линии и фильтрацию шума с помощью соответствующих кнопок в нижней части окна, прежде чем вычислять пиковые центроиды. Во всплывающем окне выберите подходящий диапазон масс, минимальное отношение сигнал/шум и минимальную пиковую интенсивность MS.
   2. После вычисления центроидов пиков используйте инструмент Glyco-Peakfinder для поиска структурных композиций, соответствующих списку пиков. Выберите perMe в качестве дериватизации, redEnd в качестве редукционного конца, а также минимальное и максимальное количество ожидаемых остатков.
      1. Для муцинов выберите гексозу, N-ацетил-гексозамин, дезоксигексозу и N-ацетил-нейраминовую кислоту. Для сульфатированных гликанов используйте другой вариант остатка с массой 87,9. Для данных MALDI-TOF установите Max # Na ионы, а Max # заряды установлены равными 1, а точность равна 0,5 Да.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Точность может потребоваться дополнительно увеличить, в зависимости от калибровки масс-спектрометра.
   3. Выберите все правильные аннотации, удерживая клавишу Control и нажимая на каждую аннотацию; затем щелкните правой кнопкой мыши аннотацию и нажмите « Добавить в список аннотированных пиков».
   4. Чтобы создать отчет, сравнивающий несколько аннотированных спектров, на вкладке "Инструменты " в разделе "Отчеты" выберите "Создать отчет, сравнивающий различные профили". Распечатайте отчет в формате PDF, чтобы сохранить его.
   5. После определения пиков гликанов рассчитайте относительную распространенность каждой отдельной структуры в процентах от общей площади под кривой всех пиков гликанов.
   6. Для анализа спектров фрагментации загрузите спектры в Glycoworkbench и сгенерируйте список пиков, как описано в шаге 2.3.1.
   7. Нарисуйте предполагаемые гликановые структуры, соответствующие аннотированным гликановым композициям. Создайте фрагменты для каждой нарисованной структуры, выбрав соответствующую опцию «Вычислить фрагменты» в инструменте «Фрагменты ». Затем выделите все фрагменты, щелкните по ним правой кнопкой мыши и нажмите « Скопировать фрагменты на холст».
   8. Для дальнейшей поддержки анализа фрагментации выберите интересующий пик, щелкнув по нему в окне просмотра спектра. Затем, щелкнув правой кнопкой мыши и выбрав «Найти все структуры, соответствующие пикам», запросите m/z выбранного пика в онлайн-базах данных на предмет предполагаемых гликановых структур.
   9. Выберите предполагаемые структуры, представляющие интерес, и скопируйте их в окно холста программы, щелкнув правой кнопкой мыши и выбрав соответствующий вариант.
   10. Чтобы вычислить возможные фрагменты, которые могут быть сгенерированы из каждой гликановой структуры, выберите интересующую структуру на холсте, а затем на вкладке Инструменты выберите Фрагменты и Вычислить фрагменты для текущей структуры.
   11. Если были вычислены фрагменты для более чем одной структуры гликанов, просмотрите сравнительную таблицу на вкладке « Сводка » в виде таблицы «Фрагменты ».
   12. Выберите фрагменты, соответствующие списку пиков для каждой потенциальной гликановой структуры, и выберите Копировать фрагменты на холст в раскрывающемся меню, вызываемом правой кнопкой мыши.
   13. На вкладке «Инструменты» в разделе «Профилировщик» выберите аннотацию пиков со всеми структурами, а затем нажмите «Инструменты» | Отчетность | Создайте отчет с аннотациями. Распечатайте отчет в формате PDF, чтобы сохранить его.

Результаты

В следующих результатах для оптимизации этапов обессоливания и перметилирования использовали муцин желудка свиней (МПГ). Для сравнения двух широко используемых подходов к обессоливанию после высвобождения гликанов образцы обессоливали либо путем катионного обмена (как описано в протоколе выше) и совместного выпаривания бората с метанолом, либо путем твердофазной экстракции с помощью картриджей с пористым графитированным углеродом (PGC). Для этого требуется предварительное кондиционирование картриджа 80% ацетонитрилом и 100%_H2O, стадия промывки 0,1% (v/v) трифторуксусной кислотой (TFA) и элюирование гликанов 2 мл 25% ацетонитрила в 0,1% TFA, 2 мл 50% ацетонитрила в 0,1% TFA и 2 мл 80% ацетонитрила в 0,1% TFA.

Полученные спектры после перметилирования анализировали в диапазоне от m/z 500 до m/z 2500. В образце, обессоленном ионным обменом и удалением боратов, было идентифицировано в общей сложности 33 гликановые структуры, в то время как в образце, обессоленном экстракцией PGC (рис. 2A), было идентифицировано 33 гликановые структуры. Одна структура гликана не была идентифицирована в обессоленном образце PGC (отмечена звездочкой на рисунке 2A). Этот сравнительный анализ показал, что восстановление более крупных гликанов после экстракции PGC было не столь эффективным по сравнению с ионным обменом. Об этом также свидетельствует относительное обилие более крупных гликанов, на долю которых приходится 21% от общего количества гликанов после экстракции PGC, в отличие от 31% для ионного обмена. Кроме того, обессоливание ионным обменом и удалением боратов привело к получению спектров с повышенным отношением сигнал/шум по сравнению с спектрами, полученными после обессоливания методом твердофазной экстракции с помощью PGC (рис. 2B).

Для оптимизации времени реакции перметилирования аликвоты одной и той же реакции перметилирования гасили добавлением H₂O в разные моменты времени (т.е. 5 мин, 30 мин или 90 мин). Результаты показали, что 33 пика гликана могут быть идентифицированы в диапазоне от m/z 500 до m/z 2500 в образцах, перметилированных в течение 30 или 90 мин, при этом результирующие спектры были сходными. Напротив, только 31 пик гликана был идентифицирован при проведении перметилирования в течение 5 мин (Рисунок 3). Интересно, что две структуры, которые не были идентифицированы в течение этого более короткого времени реакции (отмечены звездочкой на рисунке 3), представляют собой две сиалированные структуры, что позволяет предположить, что модификация сиаловых кислот не эффективна в течение 5 мин в тестируемых условиях.

Фрагментация использовалась для каждого пика гликана МПГ для подтверждения состава гликана и определения структуры гликанов. Здесь представлены два примера (рис. 4). На рисунке 4А представлен спектр фрагментации пика при давлении 983 м/з. Гликановая композиция обозначается как HexNAc₂, Hex₂. Существуют две потенциальные структуры для этого гликанового состава: либо Gal-(Gal-GlcNAc-Gal-)-GalNAc (гликан 1), либо Gal-GlcNAc-Gal-GalNAc (гликан 2). В результате фрагментации этого соединения образуется масс-спектр с пиками, которые могут быть отнесены к различным фрагментам гликанов. Пик на m/z 529 и пик на m/z 708 характерны для структур 1 и 2 соответственно, и мы можем заключить, что оба гликана 1 и 2 присутствуют в смеси гликанов МПГ.

На рисунке 4B представлен спектр фрагментации пика при m/z 2026. Glycoworkbench рассчитал две потенциальные гликановые композиции для этого пика: Hex₃HexNAc₁Neu5Ac₃ и Hex₃HexNAc₄dHex₂. Сиалированный состав имеет меньшую точность (~160 ppm и 178 ppm соответственно), что говорит о том, что первый должен быть правильным выбором. Однако профиль фрагментации указывает на присутствие Fuc, а не Neu5Ac; Поэтому второй состав является правильным. Здесь представлены четыре предполагаемые гликановые структуры, а спектр был аннотирован вычисленными фрагментами из каждой предполагаемой гликановой структуры. В аннотированном спектре мы видим, что пики, характерные только для гликанов 4 и 6, присутствуют, в то время как пиков, характерных для гликанов 3 и 5, не выявлено. Исходя из этих данных, можно сделать вывод о наличии гликанов 4 и 6.

Рисунок 2: Сравнение пиков гликана в соответствии с данными обессоливания и твердофазной экстракции. (A) Сравнение профиля гликана PGM после обессоливания с помощью катионообменной хроматографии и удаления боратов или с помощью твердофазной экстракции PGC. (B) Сравнение двух подходов к обессоливанию в результирующем соотношении сигнал/шум для каждого идентифицированного пика гликанов. Звездочкой обозначен гликан, который был идентифицирован только в образцах, обессоленных путем катионного обмена и удаления боратов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Сравнение профиля гликана МПГ после перметилирования в течение 5, 30 или 90 минут. Звездочками обозначены сиатилированные гликаны, которые были идентифицированы только через 30 или 90 минут перметилирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Примеры спектров фрагментации гликанов МПГ. (A) Фрагментация пика гликана при m/z 983. (Б) Фрагментация пика гликана на м/з 2026 г. Прямоугольниками обозначены потенциальные гликановые структуры. Цифры над фрагментами указывают на то, из какой гликановой структуры они могли быть получены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Для изучения гликанов исследователи используют различные методологии, начиная от использования лектинов для идентификации конкретных эпитопов и заканчивая более сложной жидкостной хроматографией-тандемной масс-спектрометрией (LC-MS) и ядерным магнитным резонансом (ЯМР) для получения подробной характеристики гликановых структур. Основными преимуществами MALDI-TOF MS по сравнению с альтернативными подходами являются чувствительность и высокая пропускная способность метода¹³. Однако, поскольку нет возможности разделять изобарические соединения, различные гликановые структуры с одинаковым значением m/z образуют смесь фрагментов под MS/MS, которую затем трудно деконволютировать¹³. Если требуется определение точной структуры муцингликанов, методом выбора следует выбрать ЖХ-МС.

Здесь мы представляем протокол анализа муцингликанов с помощью MALDI-TOF MS, который включает в себя все важнейшие этапы процесса, от высвобождения гликанов, обессоливания и перметилирования до сбора и анализа данных. Важно признать, что каждый из этих шагов может быть выполнен с использованием различных подходов, и все они имеют связанные с этим преимущества и ограничения.

В этом протоколе мы использовали восстановительную элиминацию β для высвобождения гликанов. Реакция протекает при основных условиях. Если образцы муцина уже находятся во взвешенном состоянии и не были предварительно очищены, pH необходимо проверить с помощью бумаги-индикатора pH; если кислый, его нужно повысить до pH ~8-9. Ограничением этого подхода является то, что основные условия, необходимые для высвобождения гликанов, также приводят к гидролизу и, следовательно, потере О-ацетильных групп, часто встречающихся на сиаловых кислотах, в реакции, известной как омыление.

В то время как в литературе описаны и другие методы высвобождения гликанов 15,16,17,18, некоторые из которых могут сохранять лабильные О-ацетильные группы, восстановительная элиминация β остается золотым стандартом в этой области. Такой подход требует высокой концентрации солей. Соли и другие загрязняющие вещества, подавляющие ионы, должны быть удалены до анализа MALDI-TOF¹⁹, так как они могут повлиять на эффективность ионизации и количественное определение гликанов. Здесь было показано, что катионообменная хроматография с последующим удалением бората путем испарения метанола является наиболее эффективным подходом к обессоливанию высвобождающихся гликанов из муцина. В этом случае гликаны не взаимодействуют со смолой, а вместо этого протекают через нее, в то время как ионы натрия задерживаются на смоле. Однако подготовка ионообменных колонок трудоемка и делает этот подход неэффективным для крупномасштабных экспериментов с большим количеством образцов. В таких случаях может быть предпочтительным обессоливание PGC, так как эта смола также доступна в формате 96-луночной пластины. Однако, как было показано выше, обессоливание с помощью экстракции PGC может привести к неэффективному элюированию, особенно более крупных гликанов, и это следует учитывать при интерпретации результатов.

Хотя нативные гликаны также могут быть проанализированы с помощью MALDI-TOF, обычно используется перметилирование, так как эта реакция значительно повышает чувствительность детектирования, поскольку нативные гликаны имеют низкую эффективность^{ионизации20}. Кроме того, перметилирование делает отрицательно заряженные гликаны, такие как сульфатированные или сиалированные гликаны, более детектируемыми в положительном режиме и сохраняет лабильные эпитопы гликанов, такие как сиаловые кислоты или фукоза²⁰. Чаще всего перметилирование продолжается в течение 5-10 мин^14,21, при этом в некоторых сообщениях реакция продолжается до 40 мин²². Здесь мы показали, что в тестируемых условиях сиалированные гликаны не были эффективно обнаружены после 5 минут перметилирования, и требовалась более длительная инкубация.

Помимо времени реакции, еще одним фактором, который может повлиять на эффективность перметилирования, является содержание воды в реакции. Присутствие воды может привести к недостаточному метилированию или частичному метилированию гликанов, при котором не все гидроксильные группы были преобразованы в метильные группы²³. Это можно легко определить, так как если бы произошло недометилирование, то в масс-спектрах можно наблюдать группы пиков, отличающиеся на 14 Да (разница масс между гидроксильными и метильными группами). Эту проблему можно решить, повторив реакцию перметилирования и повторно проанализировав данные.

Ограничивающим фактором в гликановом анализе является интерпретация спектров. Несмотря на последние достижения, этот процесс по-прежнему в значительной степени ручной и требует хороших знаний и понимания путей биосинтеза гликанов для точного аннотирования спектров. Такие инструменты, как Glycoworkbench²⁴, могут помочь, предоставляя возможные аннотации, структуры гликанов и композиции, но из-за присущей смесям гликанов гетерогенности исследователям все равно необходимо принять решение о том, какой выбор является правильным. В представленном выше примере с использованием PGM компания Glycoworkbench предложила две потенциальные гликановые композиции для пика на mz 2,025,7620, и на основании профиля фрагментации мы пришли к выводу, что присутствует фукозилированная структура, а не сиалированная. Однако, если спектр фрагментации недоступен (что часто имеет место при низком распространении гликанов), исследователи могут основывать аннотацию на знаниях о том, что гликаны с композицией Hex3HexNAc1Neu5Ac3 обнаруживаются в ганглиозидах, а не в муцинах, и поэтому этот вариант не следует рассматривать в контексте МПГ. Таким образом, идентифицированные структуры или композиции гликанов должны иметь перекрестные ссылки на предыдущие публикации и должны согласовываться с принципами биосинтеза О-гликанов. В целом, этот протокол служит ценным ресурсом, особенно для исследователей, которые являются новичками в области гликобиологии и проявляют интерес к изучению взаимодействий, происходящих на границе слизистой оболочки.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Стеклянные пипетки Pasteur диаметром 150 мм	Fisher Scientific	15202699	Расходные материалы Ссылка в тексте (если применимо): стеклянная пипетка
Трубки объёмом 5 мл	Эппендорф	30122305	Расходные материалы
96-колодцовая экстракционная пластина HLB	Fisher Scientific	16553290	Расходные материалы
уксусная кислота	Сигма-Олдрич	A6283	Реагент
Ацетонитрил	Fisher Scientific	15624520	Реагент
безводный ДМСО	Сигма-Олдрич	5.89569	Реагент
Безводный метанол	Сигма-Олдрич	5.89596	Реагент
Авторефлексный масс-спектрометр	Bruker		Оборудование
DOWEX 50w x8 смола, форма H+, сетка 200-400	Сигма-Олдрич	44519	Реагент Ссылка в тексте (если применимо): катионообменная смола
Нагреватель сухого блока	Грант	QBD2	Оборудование
Испаритель/концентратор для блочных обогревателей	Коул-Палмер	WZ-36610-99	Оборудование
flexAnalysis	Bruker		Программное обеспечение, проприетарное и nbsp;
flexControl	Bruker		Программное обеспечение, проприетарное и nbsp;
Genevac EZ-2	Биофарма	EZ-2	Оборудование Ссылка в тексте (если применимо): центробежный испаритель
стеклянные флаконы с подходящими крышками PTFE (4 мл)	Уитон	DWKW224582-144EA	Расходные материалы
стеклянные флаконы с подходящими крышками PTFE (8 мл)	Fisher Scientific	11587413	Расходные материалы
стеклянная вата	Supelco	1.04086	Расходные материалы
Гликоверстак	NA		Программное обеспечение; Можно скачать с https://glycoworkbench.software.informer.com/
Патроны HLB SPE	Supelco	57493-U	Расходный материал, как альтернатива 96-колодцевой экстракционной пластине HLB
йодометан	Сигма-Олдрич	289566	Реагент
Мишень-пластина MALDI	Bruker		Оборудование
Сублимационная сушилка ModulyoD	Термо Фишер	ModulyoD-230	Оборудование Ссылка в тексте (если применимо): морозильная сушилка
NaBH4	Сигма-Олдрич	452882	Реагент
NaOH пеллеты	Сигма-Олдрич	567530	Реагент
Раствор NaOH 50%	Сигма-Олдрич	415413	Реагент
Положительный процессор Pressure-96	Воды	186006961	Оборудование
super DHB	Сигма-Олдрич	50862	Реагент
Трифторуксусная кислота	Сигма-Олдрич	T6508	Реагент