Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Мечение стабильными изотопами in vivo для масс-спектрометрической идентификации отцовских метаболитов, передаваемых из сперматозоидов в ооциты во время оплодотворения

1.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67765

⸱

17 июня 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1Biogem Scarl, Institute of Molecular Biology and Genetics Research, 2Department of Experimental Medicine, University della Campania Luigi Vanvitelli, 3Department of Biology, University of Naples "Federico II ", 4Department of Pharmacy, School of Pharmacy, University of Salerno, 5Department of Pharmacy, University of Naples "Federico II "

В этой статье

Краткое содержание

Эта процедура направлена на идентификацию метаболитов, передаваемых из сперматозоидов в ооциты во время оплодотворения, с помощью мечения стабильных изотопов 2H, 2O или U13C глюкозой с последующим метаболомным анализом. Быков-производителей с дейтерием спаривают с немечеными матерями. Собранные преимплантационные эмбрионы анализируются с помощью масс-спектрометрии для сортировки отцовских (дейтерированных) и материнских (недейтерированных) метаболитов.

Аннотация

Отцовский вклад в генетику эмбрионов до сих пор был ограничен аллельными последовательностями в течение десятилетий. Десятилетние результаты показывают, что эпигенетические факторы — метилирование ДНК, модификации гистонов, организация хромосом и регуляторные РНК — играют решающую роль в отцовском наследовании и влияют на эмбриональное развитие и экспрессию генов зиготы. Вместе с нуклеиновыми кислотами метаболом сперматозоидов (липиды, углеводы, свободные аминокислоты) может действовать как эпигенетический сигнал. Этот протокол направлен на идентификацию метаболитов, передаваемых из сперматозоидов в яйцеклетки, с помощью масс-спектрометрии. Процедура включает в себя мечение стабильными изотопами сперматозоидов с 2H2O или U13C глюкозой для отслеживания с помощью метаболомики отцовских метаболитов, перенесенных в ооцит во время оплодотворения. Общая цель протокола состоит в том, чтобы выявить роль отцовского метаболома сперматозоидов в восприимчивости потомства к дисметаболизму, и он может быть адаптирован для получения информации о том, как условия окружающей среды, такие как диета и воздействие загрязняющих веществ, изменяют отцовские метаболические сообщения, потенциально влияя на здоровье потомства и предрасположенность к диабету, ожирению и сердечно-сосудистым заболеваниям.

Введение

Отцовский эпигеном влияет на восприимчивость потомства к дисметаболу
В отличие от множества ролей до и после зачатия, которые используются матерями во время развития эмбриона, вклад сперматозоидов на протяжении десятилетий считался исключительно генетическим. Согласно теории генетического наследования, отцовский вклад в фенотипическую изменчивость индивидуума (включая его восприимчивость к болезням) должен быть приписан исключительно генетической последовательности отцовских аллельных вариантов и их взаимодействию с унаследованными по материнской линии. В настоящее время ясно, что аллели не являются единственными генетическими сообщениями, передаваемыми отцом своему потомству во время оплодотворения, и что вместо этого множество эпигенетических сигналов способствуют отцовскому наследованию. К настоящему времени были идентифицированы следующие эпигенетические сигналы: (1) метильные группы, ковалентно добавленные к цитозинам родительского генома 5,6,7, (2) посттрансляционные модификации (ацетилирование, метилирование) гистонов, ассоциированных с хромосомами сперматозоидов и доставляемых в ооциты8, (3) трехмерная организация отцовских хромосом, приводящая к внутрихромосомному взаимодействию (также известному как топологически ассоциативные домены, ТАД), сохраняющемуся в зиготе9,10 и (4) молекулы регуляторных РНК (микроРНК, фрагменты, полученные из тРНК, и РНК, взаимодействующие с пиви)11,12, а также рРНК13 и тРНК14, высвобождаемые из сперматозоидов в ооцит во время оплодотворения.

Отцовский эпигеном является важным носителем информации для потомства. Отцовская информация влияет на зиготу, эмбрион во время его развития, а после рождения — на склонность потомства к дисметаболическим веществам и заболеваниям. Это неменделевское наследование (называемое межпоколенческим или трансгенерационным в зависимости от того, влияет ли оно на одно или несколько последовательных поколений) многие авторы считают одним из скрытых факторов, ответственных за резкий рост дисметаболических заболеваний, происходящих вразвитых западных странах. Действительно, согласно теориям PoHaD (отцовское происхождение здоровья и болезней) и DoHaD (Developmental Origin of Health and Disease), родительский эпигенетический вклад является одним из факторов, предрасполагающих потомство к развитию диабета, ожирения и сердечно-сосудистых заболеваний во взрослом возрасте. Интересно, что родительский эпигеном исключительно восприимчив к раздражителям окружающей среды и может подвергаться влиянию метаболических условий (таких как употребление наркотиков, пищевые привычки и метаболическая приспособленность)18, а также строго параметров окружающей среды (таких как воздействие загрязняющих веществ, социальные отношения, психический стресс и стресс в отношениях)5,11. Таким образом, каждый из вышеупомянутых стимулов может изменять эпигеномы зародышевых клеток (сперматозоидов и ооцитов) и влиять на будущие поколения.

Диета с высоким содержанием жиров (HFD) представляет собой один из наиболее широко изученных стимулов окружающей среды, способных изменять отцовский эпигеном и приводить к вредным сообщениям, передаваемым потомству19. Этот стимул влияет на фенотип потомства (до третьего поколения), которое часто проявляет большую склонность к развитию дисметабола, независимо от калорийности рациона. У потомства от отца, употребляющего HFD, наблюдается задержка роста, непереносимость глюкозы и резистентность к инсулину как у мышей, так и у крыс20,21. У людей эпигенетическое наследование в основном изучалось в поколениях, родившихся во время и сразу после периодов голодаили перекармливания. В когорте Överkalix доступность пищи у бабушек и дедушек по отцовской линии в период их медленного роста коррелировала с общим риском смертности, сердечно-сосудистыми заболеваниями, ИМТ, окружностью талии и жировой массойих внуков. В последнее время данные об отцовской передаче от поколения к поколению были подтверждены и в других когортах24.

Отцовские метаболиты, участвующие в межпоколенческом наследовании
Несмотря на клинические и эпидемиологические данные, молекулярные детали отцовского межпоколенческого наследования остаются неясными. Во-первых, идентификация всех молекулярных преобразователей эпигенетической информации еще не завершена. Научные данные свидетельствуют о том, что нуклеиновый компонент сперматозоидов сам по себе не может объяснить сложность межпоколенческого наследования. Вариации метилирования ДНК действительно были измерены в сперматозоидах мышей и крыс, получавших HFD, но в таком низком проценте популяции сперматозоидов, что это не может объяснить высокую пенетрантность дисметаболического фенотипа, наблюдаемую у потомства. С другой стороны, пул сигнальных РНК, переносимых из сперматозоидов в ооциты, имеет очень короткий период полураспада и, хотя и способен влиять на экспрессию зиготических генов, вряд ли будет поддерживаться в эффективных концентрациях после оплодотворения в зиготе эмбрионов на 2-й, 3-й день, в морулах и в бластоцистах. Таким образом, кажется очевидным, что новые молекулярные детерминанты должны быть вовлечены в механизм межпоколенческого наследования.

Наряду с нуклеиновыми кислотами, сперматозоиды также вносят в зиготу метаболомные компоненты, такие как липиды, углеводы и аминокислоты 26,27,28,29. Эти метаболиты, особенно те, которые наделены модулирующей активностью, могут влиять на экспрессию зиготических генов и эмбриональное развитие и, таким образом, могут действовать как эпигенетическиесигналы. Кроме того, как и в случае с нуклеиновыми кислотами, концентрация и относительное содержание этих метаболитов в сперме могут зависеть от условий окружающей среды, испытываемых отцом, и, таким образом, представлять собой носители информации для потомства 28,30,31,32,33,34 . Действительно, было показано, что метаболом сперматозоидов зрелых сперматозоидов зависит от состояния здоровья отца и подвержен влиянию факторов окружающей среды, таких как диета, физические упражнения, токсичные вещества и эндокринные разрушители.

Понимание роли метаболитов сперматозоидов в эмбриональном развитии осложняется несколькими техническими ограничениями: (1) разницей в размерах между сперматозоидом и ооцитом, что приводит к минимальному вкладу сперматозоида в метаболическую массу зиготы, и (2) несколькими метаболомными вариациями, которым подвергается сперматозоид на этапах его производства (сперматогенез), созревания придатка яичка, эякуляция и слияние с ооцитом.

Колебания метаболома сперматозоидов во время созревания сперматозоидов
У млекопитающих сперматозоиды образуются в яичках в результате сперматогенеза, процесса, зависящего от сперматогониальных стволовых клеток, в результате которого сперматогонии развиваются в первичные сперматоциты, которые входят в мейоз и производят круглые гаплоидные сперматиды. Морфогенез этих клеток в сперматозоиды происходит посредством спермиогенеза, массивного морфофункционального ремоделирования сперматид, от круглых клеток к удлиненным/конденсированным/высокоспециализированным клеткам, соответствующим последней фазе сперматогенеза. Однако полученные сперматозоиды неподвижны и еще не способны к оплодотворению. После сперматозоидов, по мере того как сперматозоиды высвобождаются из rete testis в придаток яичка, сперматозоиды взаимодействуют с эпителиальными клетками придатка яичка и взаимодействуют с белками и экзосомальными везикулами, секретируемыми этими клетками (придаточными яичками, богатыми сфингомиелином и арахидоновой кислотой). Прохождение через придаток яичка позволяет сперматозоидам достичь полной зрелости, и, даже если они поддерживаются в предварительно емком состоянии, они приобретают способность к подвижности. Во время транзита придатка яичка сперматозоидная оболочка становится более отрицательно заряженной и обогащенной сфингомиелином. Сперматозоидная оболочка также становится более жидкой из-за прогрессирующего снижения уровня холестерина и сопутствующего увеличения полиненасыщенных жирных кислот (в основном арахидоновой, докозапентаеновой и докозагексаеновой кислот). После эякуляции в женских половых путях белки семенной жидкости и альбумин способствуют емкости сперматозоидов, способствуя гиперполяризации и притоку кальция для активации подвижности сперматозоидов. Плазматическая мембрана емкостных сперматозоидов отличается повышенной текучестью, низким соотношением холестерина и фосфолипидов, а также сниженным содержанием сиаловой кислоты, ганглиозида GM1 и триглицеридов31,37.

Перед встречей с ооцитом сперматозоид подвергается акросомной реакции, слиянию акросомы (мембранозной органеллы, полученной по методу Гольджи, которая покрывает переднюю часть ядра сперматозоида и образуется в процессе спермомета) с плазматической мембраной сперматозоида, что способствует реорганизации плазматической мембраны сперматозоида и способности проникать в zona pellucida (ZP), матрицу гликопротеинов, окружающих ооцит35, 38. В качестве заключительного этапа, гемифузия между сперматозоидом и мембраной ооцита, стимулируемая сперматозоидными белками IZUMO1, SPACA6 и TMEM9539, приводит к включению липидов сперматозоидов в мембраны ооцитов и переносу нуклеинового и метаболического содержимого в ооцит.

Обоснование процедуры
Целью этой процедуры является идентификация метаболитов, транспортируемых сперматозоидами и переносимых в ооцит при оплодотворении (Рисунок 1). Чтобы различать метаболиты, полученные из сперматозоидов и ооцитов в зиготе, сперматозоиды помечают дейтерием (2H, изотоп водорода) или 13C (изотоп углерода) с помощью метаболического мечения in vivo оксидом дейтерия, 2H2O40 или равномерно меченым U13C Glucose41. Меченые изотопами самцы мышей затем скрещиваются с немечеными самками, чтобы в конечном итоге собрать зиготы, морулы и бластоцисты. Эмбрионы на ранних стадиях обрабатываются для извлечения (1) полярных, (2) неполярных метаболитов и (3) стеринов. Затем метаболомы анализируются с помощью методов масс-спектрометрии. Изотопно меченые (отцовские) метаболиты будут идентифицированы и отделены от немеченых (материнских), однозначно демонстрируя их отцовское происхождение.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Неаполитанском университете имени Федерико II, Италия. Реагенты и оборудование, использованные в данном исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Выбор и группировка кобелей C57BL/6J

  1. Выберите кобелей C57BL/6J в возрасте около 12 недель.
  2. Разделите самцов на две группы и назовите их МЕЧЕНЫМИ (подвергающиеся мечению стабильными изотопами) или НЕМЕЧЕНЫЕ (используемые в качестве контроля и для измерения эффективности мечения изотопов в сперматозоидах и морулах).
  3. Чтобы очистить придаток яичка от непомеченных сперматозоидов, позвольте самцам спариваться с парными самками.

2. Мечение стабильными изотопами самцов C57BL/6J

  1. При использовании 2H2O для маркировки in vivo приготовьте 10% v/v 2H2O -обогащенную воду для использования в качестве питьевой воды, смешав 100 мл 2H2O с 900 мл водопроводной воды. При использовании U13C-Glucose для маркировки in vivo приготовьте воду с содержанием 5%-15% U13C-Glucose для использования в качестве питьевой воды, растворив 50-150 г U13C-Glucose в 1 л водопроводной воды;
    ВНИМАНИЕ: Длительное потребление 2Н2О токсично для мышей. Установите для каждого конкретного штамма мышей максимальное количество 2Н2О для добавления в питьевую воду для достижения максимальной эффективности мечения и минимальных побочных эффектов. Длительное употребление глюкозы вызывает гипергликемию и диабет у мышей. Установите максимальное количествоU13C-глюкозы для добавления в питьевую воду для достижения максимальной эффективности маркировки и минимальных побочных эффектов.
  2. Замените бутылки с водой на те, которые содержат питьевую воду, меченную изотопами, и дайте мышам пить ее в течение 2,5-5 недель (покрывая не менее половины сперматогенеза), обновляя жидкость два раза в неделю.
  3. В конце периода лечения позвольте меченым самцам спариваться с суперовулированными самками.

3. Суперовуляция у самок C57BL/6J

  1. Отбирают самок возрастом около 4 недель с весом от 12,5 до 14 г, в препубертатном возрасте.
  2. Индуцирование созревания фолликулов путем внутрибрюшинного введения 5 МЕ/50 μл/мышь PMSG (сыворотки беременной кобылы).
  3. Через 47 ч внутрибрюшинно ввести лютеинизирующий гормон ХГЧ (хорионический гонадотропин человека, 5 МЕ/50 мкл/мышь) для ускорения завершения созревания фолликула и индуцирования овуляции и формирования желтого тела.
  4. После инъекции ХГЧ дайте самкам возможность спариваться с мышами с меченой и немеченой мышью в соответствии с шагом 1 рисунка 1.
  5. После случки проводят контроль вагинальной пробки42. Отделите позитивных самок и посадите их в клетку.

4. Предимплантационный забор эмбрионов методом промывки

  1. Жертвуйте вагинальными самками с положительным результатом в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами (через 2,5 дня после коитума для сбора морул).
  2. Положите животных на стол в положении лежа на спине; Смочите брюшную полость с 70% этанолом, и проведите широкую лапаротомию.
  3. Удалите матку с одной стороны, зажав шейку матки и надрезав на каудальном конце шейки матки; с другой стороны, путем разрезания на конце маточного рога (инфундибулярной части).
  4. Поместите матки в чашку Петри с PBS, чтобы промыть их, а затем переложите в другую чистую чашку Петри, чтобы избежать присутствия остатков.
  5. Чтобы промыть матку, загрузите питательную среду в шприц объемом 2,5 мл и приложите его к игле Гамильтона с тупым наконечником 33 G.
  6. Введите иглу в подготовленный выше инфундибулум яйцевода и промойте всю матку.
  7. Соберите морулы в каплю питательной среды, чтобы промыть их от остатков слизистой и крови.
  8. Собранные образцы переложите в новые пробирки для сбора и сгруппируйте их в МЕЧЕНЫЕ МОРУЛЫ и НЕМЕЧЕНЫЕ МОРУЛЫ, в зависимости от того, получены ли они от брачных событий с участием МЕЧЕНЫХ или НЕМЕЧЕННЫХ быков-производителей. Заморозьте образцы в жидком азоте.
  9. Принесите в жертву группу неспаренных суперовулированных самок (в соответствии с утвержденными институциональными протоколами) для сбора неоплодотворенных яйцеклеток. Перенесите собранные образцы в новые пробирки для сбора и пометьте их как НЕМЕЧЕННЫЕ ООЦИТЫ. Заморозьте образцы в жидком азоте.

5. Забор сперматозоидов из хвоста придатка яичка

  1. Приносите в жертву МЕЧЕНЫХ или НЕМАРКИРОВАННЫХ быков.
  2. Положите животных на стол в положении лежа на спине, смочите брюшную полость 70% этанолом и проведите широкую лапаротомию.
  3. Удалите придатки яичек и немедленно погрузите их в 3 мл PBS (pH 7,6) и неплотно разрежьте их, чтобы вывести сперму из протоков.
  4. Процедите образцы спермы через марлю.
  5. Центрифугируйте сперматозоиды при давлении 800 х г в течение 10 минут (при комнатной температуре).
  6. Суспендируйте гранулу в 1 мл холодной деионизированной воды. Только сперматозоиды будут сопротивляться гипотоническому раствору, в то время как несперматозоиды лопнут.
  7. Центрифугируйте сперматозоиды при давлении 800 х г в течение 10 минут при комнатной температуре.
  8. Пометьте пробирки и сгруппируйте их как МЕЧЕНЫЕ СПЕРМАТОЗОИДЫ и НЕМЕЧЕННЫЕ СПЕРМАТОЗОИДЫ, в зависимости от того, были ли они собраны от МЕЧЕНЫХ или НЕМЕЧЕННЫХ быков-производителей.
  9. Заморозьте образцы в жидком азоте и храните образцы при температуре -80 °C.

6. Экстракция липидов и полярных метаболитов

  1. Уравновесьте образец на этапах 1-5 при 4°С на льду.
  2. Добавьте в образцы 225 μл ледяного метанола (MeOH) и инкубируйте при температуре -30 °C в течение 1 минуты, а затем поместите их в звуковую ванну на 10 минут.
    1. Дополнительно: при определении экспериментального условия добавьте 0,1-2 ppm как C16-Ceramide-13, C3-15 N, так и L-Lysine-ε-15N гидрохлорида в качестве внутренних стандартов для измерения эффективности экстракции неполярных и полярных метаболитов соответственно.
  3. Добавьте 750 мкл ледяного метил-трет-бутилового эфира (МТБЭ) в термомиксер на 1 ч при 4 °C (550 об/мин).
  4. Добавьте 188 мкл H2O в образцы после центрифугирования. Отделите верхние фазы (липиды) от нижней фазы (полярные метаболиты) и высушите их.
    ВНИМАНИЕ: MeOH вызывает слепоту и повреждение печени, почек и сердца при проглатывании. Чрезмерное воздействие оказывает накопительное действие на центральную нервную систему. МТБЭ может вызывать раздражение кожи, глаз и дыхательных путей. Работа под вытяжным шкафом.
  5. Высушите образец с помощью вакуумного концентратора. Хранить высушенные образцы при температуре -80 °C до масс/спектрометрического анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Высушенные образцы могут храниться при температуре -80 °C до 6 месяцев в ожидании масс/спектрометрического анализа. Для идентификации метаболитов, менее представленных в преимплантационных эмбрионах, может потребоваться объединение образцов, полученных от одной и той же брачной пары и события спаривания.

7. Экстракция стеринов

ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте использования пластиковых трубок и наконечников [они будут растворены неполярным органическим растворителем]; вместо этого используйте стеклянные пробирки и стеклянные пастеровские пипетки для дозирования жидкостей.

  1. Уравновесьте образец на этапах 1-5 при 4 °C на льду. Повторно суспендируйте собранные образцы в 500 мкл раствора метанола/Н20 70% v/v и перенесите суспензию в стеклянную пробирку.
    1. Гомогенизация путем вортексирования в течение 30 с. Оставьте гомогенат на 16 часов при температуре 4 °C.
    2. Дополнительно: при постановке экспериментального условия добавьте 0,1-2 ppm растительного стерола Sitostanol-5,6,22,23-d4 в качестве внутренних нормативов для измерения эффективности экстракции для стеринов.
      ВНИМАНИЕ: MeOH вызывает слепоту и повреждение печени, почек и сердца при проглатывании. Чрезмерное воздействие оказывает накопительное действие на центральную нервную систему.
  2. Центрифугируйте образец при давлении 3,220 x g в течение 15 мин при комнатной температуре. Перенесите надосадочную жидкость в чистую стеклянную пробирку и добавьте в нее 500 μL PBS.
  3. Добавьте 7 мл ледяного диэтилового эфира и вортекс на 1 минуту. Дайте образцу постоять 1-2 мин. и дождитесь разделения фаз. Заморозьте, погрузив трубку в ванну с сухим льдом и ацетоном. Перенесите незамерзшую фазу диэтилового эфира в только что помеченную стеклянную пробирку.
    ВНИМАНИЕ: Диэтиловый эфир является чрезвычайно легковоспламеняющейся жидкостью и паром и разлагается на взрывоопасные перекиси на воздухе и свете. Не работайте в тесном контакте с пламенем. Диэтиловый эфир опасен при проглатывании и вреден для кожи.
  4. Разморозьте водную фазу при 37 °C и повторите шаг 4.3. Соедините фазы диэтилового эфира, собранные на шагах 4.3-4.4, в одной стеклянной пробирке.
  5. Высушите образец с помощью вакуумного концентратора. Хранить высушенные образцы при температуре -80°C до масс/спектрометрического анализа.

8. Дериватизация образца

ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы выиграют от дериватизации ТМС для анализа конкретных метаболитов (холестерина, жирных кислот, аминокислот).

  1. Уравновесьте образцы при комнатной температуре
    ВНИМАНИЕ: Неполное равновесие может привести к конденсации атмосферной воды на стенках труб и образцах. Вода сильно конкурирует за дериватизацию ТМС.
  2. Растворите образцы в 50 мкл пиридина и дериватизируйте их путем добавления 25 мкл N,O-Bis(триметилсилил(TMS)трифторацетамида (BSTFA). Инкубируйте образцы в течение 90 минут при 60 °C. Открутите образцы и немедленно приступайте к анализу ГХ-МС.
    ВНИМАНИЕ: Пиридин легковоспламеняющийся, раздражающий и токсичный. BSTFA является легковоспламеняющимся, коррозионным и раздражающим. Работайте под вытяжным шкафом и используйте защитные перчатки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для мониторинга переноса метаболитов от сперматозоидов к ооцитам с помощью масс-спектрометрии собирают и анализируют морулы, выделенные от самок C57 BL/6J, спаренных с быками-производителями из групп LABELED и UNLABELED. Метаболиты экстрагировали, как описано на этапах 6-7, и дериватизировали с помощью ТМС, как описано на этапе 8. Проводили метаболомное и липидомное профилирование МЕЧЕНЫХ морул, НЕМЕЧЕНЫХ морул, НЕМЕЧЕНЫХ ооцитов, МЕЧЕНЫХ и НЕМЕЧЕНЫХ сперматозоидов. Полученные профили были статистически проанализированы,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Описанный протокол позволяет идентифицировать метаболиты, переносящиеся из сперматозоидов в ооциты во время оплодотворения, с помощью мечения стабильными изотопами самцов мышей с 2H, 2O илиU13C глюкозой с последующим метаболомным анализом. Изотопно меченые метаболиты, обнаруженные в морулах, имеют отцовское происхождение.

Хотя водород и дейтерий являются изотопами, они не совсем идентичны с точки зрения химического поведения. Т...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2H2O фильтрованный, 99,8 % атомов 2HСигма Олдрич756822
АцетонСигма Олдрич179124
Agilent  СИЛ-8Agilent (Санта-Клара, Калифорния, США)
С16-Керамид-13С3-15НСтандарт LGCТРК-C342770-25МГ
дихлорметанСигма Олдрич34856
Диэтиловый эфир Сигма Олдрич673811
этанолСигма Олдрич1,11,727
ХГЧ (хорионический гонадотропин человека,Сигма ОлдричКГ5-1ВЛ
L-лизин--эпсилон;-15N гидрохлоридСигма Олдрич608971
Самцы и самки  Мыши C57BL/6JOlaHsdИнотив C57BL/6JOlaHsd
метил-трет-бутиловый эфир (МТБЭ)Сигма Олдрич306975
МетОХСигма Олдрич1,06,035
N,O-бис(триметилсилил(TMS)
трифторацетамид (BSTFA)		Supelco15238
ПБСАпплименемА0965-9010
PMSG (Супоросная кобыла' s serum)Ли Биосолюшнс493-10
пиридинСигма Олдрич360570
Shimadzu GCMS 2010plus Симадзу
Сиостанол-5,6,22,23-д4Сигма Олдрич680028
трифторацетат натрияСигма Олдрич1615138
SolariX XR 7T Bruker Daltonics
TimsTOF Pro Q-TOF Bruker Daltonics
U13C глюкоза Сигма Олдрич389374
Ultimate RS3000 UHPLC Thermo Fisher Scientific
VanGuard CSHTM предколонный (5,0 × 2,1 мм; 1,7 μ м, 130 &Аринг;)Воды

Ссылки

  1. Wang, Y., Liu, H., Sun, Z. Lamarck rises from his grave: Parental environment-induced epigenetic inheritance in model organisms and humans. Biol Rev. 92 (4), 2084-2111 (2017).
  2. Champroux, A., Cocquet, J., Henry-Berger, J., Drevet, J. R., Kocer, A. A decade of exploring the mammalian sperm epigenome: Paternal epigenetic and transgenerational inheritance. Front Cell Dev Biol. 6, 50(2018).
  3. Horsthemke, B. A critical view on transgenerational epigenetic inheritance in humans. Nat Commun. 9 (1), 2973(2018).
  4. Schagdarsurengin, U., Steger, K. Epigenetics in male reproduction: Effect of paternal diet on sperm quality and offspring health. Nat Rev Urol. 13 (10), 584-595 (2016).
  5. Skinner, R. C., Gigliotti, J. C., Ku, K. -M., Tou, J. C. A comprehensive analysis of the composition, health benefits, and safety of apple pomace. Nutr Rev. 76 (12), 896-909 (2018).
  6. King, S. E., Skinner, M. K. Epigenetic transgenerational inheritance of obesity susceptibility. Trends Endocrinol Metab. 31 (7), 478-494 (2020).
  7. Martínez Duncker Rebolledo, E., et al. Sperm DNA methylation defects in a new mouse model of the 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase 677C>T variant and correction with moderate dose folic acid supplementation. Mol Hum Reprod. 30 (4), gaae008(2024).
  8. Lismer, A., et al. Histone H3 lysine 4 trimethylation in sperm is transmitted to the embryo and associated with diet-induced phenotypes in the offspring. Dev Cell. 56 (5), 671-686.e6 (2021).
  9. Kimmins, S., Sassone-Corsi, P. Chromatin remodeling and epigenetic features of germ cells. Nature. 434 (7033), 583-589 (2005).
  10. Diaz-Castillo, C., Chamorro-Garcia, R., Shioda, T., Blumberg, B. Transgenerational self-reconstruction of disrupted chromatin organization after exposure to an environmental stressor in mice. Sci Rep. 9 (1), 13057(2019).
  11. Gapp, K., et al. Implication of sperm RNAs in transgenerational inheritance of the effects of early trauma in mice. Nat Neurosci. 17 (5), 667-669 (2014).
  12. Chen, Q., et al. Sperm tsRNAs contribute to intergenerational inheritance of an acquired metabolic disorder. Science. 351 (6271), 397-400 (2016).
  13. Liberman, N., et al. 18S rRNA methyltransferases DIMT1 and BUD23 drive intergenerational hormesis. Mol Cell. 83 (18), 3268-3282.e7 (2023).
  14. Tomar, A., et al. Epigenetic inheritance of diet-induced and sperm-borne mitochondrial RNAs. Nature. 630 (8017), 720-727 (2024).
  15. Pinhas-Hamiel, O., Zeitler, P. The global spread of type 2 diabetes mellitus in children and adolescents. J Pediatr. 146 (5), 693-700 (2005).
  16. Galan, C., Krykbaeva, M., Rando, O. J. Early life lessons: The lasting effects of germline epigenetic information on organismal development. Mol Metab. 38, 100924(2020).
  17. Rando, O. J., Simmons, R. A. I'm eating for two: Parental dietary effects on offspring metabolism. Cell. 161 (1), 93-105 (2015).
  18. Perez, M. F., Lehner, B. Intergenerational and transgenerational epigenetic inheritance in animals. Nat Cell Biol. 21 (2), 143-151 (2019).
  19. Carone, B. R., et al. Paternally induced transgenerational environmental reprogramming of metabolic gene expression in mammals. Cell. 143 (7), 1084-1096 (2010).
  20. Pastore, A., et al. Pre-conceptional paternal diet impacts on offspring testosterone homoeostasis via epigenetic modulation of cyp19a1/aromatase activity. NPJ Metab Health Dis. 2 (1), 8(2024).
  21. Fullston, T., et al. Paternal obesity initiates metabolic disturbances in two generations of mice with incomplete penetrance to the F2 generation and alters the transcriptional profile of testis and sperm microRNA content. FASEB J. 27 (10), 4226-4243 (2013).
  22. Lumey, L., et al. Cohort profile: The Dutch Hunger Winter Families Study. Int J Epidemiol. 36 (6), 1196-1204 (2007).
  23. Pembrey, M. E., et al. Sex-specific, male-line transgenerational responses in humans. Eur J Hum Genet. 14 (2), 159-166 (2006).
  24. Comas-Armangue, G., Makharadze, L., Gomez-Velazquez, M., Teperino, R. The legacy of parental obesity: Mechanisms of non-genetic transmission and reversibility. Biomedicines. 10 (10), 2461(2022).
  25. Shea, J. M., et al. Genetic and epigenetic variation, but not diet, shape the sperm methylome. Dev Cell. 35 (6), 750-758 (2015).
  26. Dupont, J., Bertoldo, M. J., Rak, A. Energy sensors in female and male reproduction and fertility. Int J Endocrinol. 2018, 8285793(2018).
  27. Guiton, R., Henry-Berger, J., Drevet, J. R. The immunobiology of the mammalian epididymis: The black box is now open. Basic Clin Androl. 23 (1), 8(2013).
  28. Jarvis, S., et al. High fat diet causes distinct aberrations in the testicular proteome. Int J Obes. 44 (9), 1958-1969 (2020).
  29. Liu, L. -L., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma signaling in human sperm physiology. Asian J Androl. 17 (6), 942(2015).
  30. Masaki, H., et al. Long-chain fatty acid triglyceride metabolism disorder impairs male fertility: A study using adipose triglyceride lipase deficient mice. Mol Hum Reprod. 23 (7), 452-460 (2017).
  31. Cheng, X., et al. Lipidomics profiles of human spermatozoa: Insights into capacitation and acrosome reaction using UPLC-MS-based approach. Front Endocrinol (Lausanne). 14, 1273878(2023).
  32. Collodel, G., Castellini, C., Lee, J. C. -Y., Signorini, C. Relevance of fatty acids to sperm maturation and quality. Oxid Med Cell Longev. 2020, 7038124(2020).
  33. Watkins, A. J., et al. Paternal diet programs offspring health through sperm- and seminal plasma-specific pathways in mice. Proc Natl Acad Sci USA. 115 (40), 10064-10069 (2018).
  34. Darbandi, M., et al. Oxidative stress-induced alterations in seminal plasma antioxidants: Is there any association with keap1 gene methylation in human spermatozoa. Andrologia. 51 (1), e13159(2019).
  35. Deneke, V. E., Pauli, A. The fertilization enigma: How sperm and egg fuse. Annu Rev Cell Dev Biol. 37 (1), 391-414 (2021).
  36. Cobellis, G., et al. A gradient of 2-arachidonoylglycerol regulates mouse epididymal sperm cell start-up. Biol Reprod. 82 (2), 451-458 (2010).
  37. Kawano, N., Yoshida, K., Miyado, K., Yoshida, M. Lipid rafts: Keys to sperm maturation, fertilization, and early embryogenesis. J Lipids. 2011, 264706(2011).
  38. Rubinstein, E., Ziyyat, A., Wolf, J., Lenaour, F., Boucheix, C. The molecular players of sperm-egg fusion in mammals. Semin Cell Dev Biol. 17 (2), 254-263 (2006).
  39. Satouh, Y., Inoue, N., Ikawa, M., Okabe, M. Visualization of the moment of mouse sperm-egg fusion and dynamic localization of IZUMO1. J Cell Sci. 125 (pt 3), 498-506 (2012).
  40. Kim, J., Seo, S., Kim, T. -Y. Metabolic deuterium oxide (D2O) labeling in quantitative omics studies: A tutorial review. Anal Chim Acta. 1242, 340722(2023).
  41. Li, X., et al. Sustained high glucose intake accelerates type 1 diabetes in NOD mice. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 1037822(2022).
  42. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS One. 7 (4), e35538(2012).
  43. Katz, J. J. Chemical and biological studies with deuterium. , Sigma Xi, The Scientific Research Honor Society. (2024).
  44. Oakberg, E. F., Hughes, A. M. Deuterium oxide effect on spermatogenesis in the mouse. Exp Cell Res. 50 (2), 306-314 (1968).
  45. Sumiyoshi, M., Sakanaka, M., Kimura, Y. Chronic intake of high-fat and high-sucrose diets differentially affects glucose intolerance in mice. J Nutr. 136 (3), 582-587 (2006).
  46. Aragno, M., Mastrocola, R. Dietary sugars and endogenous formation of advanced glycation endproducts: Emerging mechanisms of disease. Nutrients. 9 (4), 385(2017).
  47. Wilkinson, D. J., Brook, M. S., Smith, K. Principles of stable isotope research-with special reference to protein metabolism. Clin Nutr Open Sci. 36, 111-125 (2021).
  48. Wilkinson, D. J., et al. A validation of the application of D2O stable isotope tracer techniques for monitoring day-to-day changes in muscle protein subfraction synthesis in humans. Am J Physiol Endocrinol Metab. 306 (5), E571-E579 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Мечение стабильными изотопами in vivo для масс-спектрометрической идентификации отцовских метаболитов, передаваемых из сперматозоидов в ооциты во время оплодотворения
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.