Эта процедура направлена на идентификацию метаболитов, передаваемых из сперматозоидов в ооциты во время оплодотворения, с помощью мечения стабильных изотопов 2H, 2O или U13C глюкозой с последующим метаболомным анализом. Быков-производителей с дейтерием спаривают с немечеными матерями. Собранные преимплантационные эмбрионы анализируются с помощью масс-спектрометрии для сортировки отцовских (дейтерированных) и материнских (недейтерированных) метаболитов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Мечение стабильными изотопами in vivo для масс-спектрометрической идентификации отцовских метаболитов, передаваемых из сперматозоидов в ооциты во время оплодотворения
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Отцовский вклад в генетику эмбрионов до сих пор был ограничен аллельными последовательностями в течение десятилетий. Десятилетние результаты показывают, что эпигенетические факторы — метилирование ДНК, модификации гистонов, организация хромосом и регуляторные РНК — играют решающую роль в отцовском наследовании и влияют на эмбриональное развитие и экспрессию генов зиготы. Вместе с нуклеиновыми кислотами метаболом сперматозоидов (липиды, углеводы, свободные аминокислоты) может действовать как эпигенетический сигнал. Этот протокол направлен на идентификацию метаболитов, передаваемых из сперматозоидов в яйцеклетки, с помощью масс-спектрометрии. Процедура включает в себя мечение стабильными изотопами сперматозоидов с 2H2O или U13C глюкозой для отслеживания с помощью метаболомики отцовских метаболитов, перенесенных в ооцит во время оплодотворения. Общая цель протокола состоит в том, чтобы выявить роль отцовского метаболома сперматозоидов в восприимчивости потомства к дисметаболизму, и он может быть адаптирован для получения информации о том, как условия окружающей среды, такие как диета и воздействие загрязняющих веществ, изменяют отцовские метаболические сообщения, потенциально влияя на здоровье потомства и предрасположенность к диабету, ожирению и сердечно-сосудистым заболеваниям.
Введение
Отцовский эпигеном влияет на восприимчивость потомства к дисметаболу
В отличие от множества ролей до и после зачатия, которые используются матерями во время развития эмбриона, вклад сперматозоидов на протяжении десятилетий считался исключительно генетическим. Согласно теории генетического наследования, отцовский вклад в фенотипическую изменчивость индивидуума (включая его восприимчивость к болезням) должен быть приписан исключительно генетической последовательности отцовских аллельных вариантов и их взаимодействию с унаследованными по материнской линии. В настоящее время ясно, что аллели не ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Неаполитанском университете имени Федерико II, Италия. Реагенты и оборудование, использованные в данном исследовании, перечислены в Таблице материалов.
1. Выбор и группировка кобелей C57BL/6J
- Выберите кобелей C57BL/6J в возрасте около 12 недель.
- Разделите самцов на две группы и назовите их МЕЧЕНЫМИ (подвергающиеся мечению стабильными изотопами) или НЕМЕЧЕНЫЕ (используемые в качестве контроля и для измерения эффективности мечения изотопов в сперматозоидах и м....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Для мониторинга переноса метаболитов от сперматозоидов к ооцитам с помощью масс-спектрометрии собирают и анализируют морулы, выделенные от самок C57 BL/6J, спаренных с быками-производителями из групп LABELED и UNLABELED. Метаболиты экстрагировали, как описано на этапах 6-7, и дериватизировали с помощью ТМС, как описано на этапе 8. Проводили метаболомное и липидомное профилирование МЕЧЕНЫХ морул, НЕМЕЧЕНЫХ морул, НЕМЕЧЕНЫХ ооцитов, МЕЧЕНЫХ и НЕМЕЧЕНЫХ сперматозоидов. Полученные профили были статистически проанализированы,.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Описанный протокол позволяет идентифицировать метаболиты, переносящиеся из сперматозоидов в ооциты во время оплодотворения, с помощью мечения стабильными изотопами самцов мышей с 2H, 2O илиU13C глюкозой с последующим метаболомным анализом. Изотопно меченые метаболиты, обнаруженные в морулах, имеют отцовское происхождение.
Хотя водород и дейтерий являются изотопами, они не совсем идентичны с точки зрения химического поведения. Т.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 2H2O фильтрованный, 99,8 % атомов 2H | Сигма Олдрич | 756822 | |
| Ацетон | Сигма Олдрич | 179124 | |
| Agilent СИЛ-8 | Agilent (Санта-Клара, Калифорния, США) | ||
| С16-Керамид-13С3-15Н | Стандарт LGC | ТРК-C342770-25МГ | |
| дихлорметан | Сигма Олдрич | 34856 | |
| Диэтиловый эфир | Сигма Олдрич | 673811 | |
| этанол | Сигма Олдрич | 1,11,727 | |
| ХГЧ (хорионический гонадотропин человека, | Сигма Олдрич | КГ5-1ВЛ | |
| L-лизин--эпсилон;-15N гидрохлорид | Сигма Олдрич | 608971 | |
| Самцы и самки Мыши C57BL/6JOlaHsd | Инотив | C57BL/6JOlaHsd | |
| метил-трет-бутиловый эфир (МТБЭ) | Сигма Олдрич | 306975 | |
| МетОХ | Сигма Олдрич | 1,06,035 | |
| N,O-бис(триметилсилил(TMS) трифторацетамид (BSTFA) | Supelco | 15238 | |
| ПБС | Апплименем | А0965-9010 | |
| PMSG (Супоросная кобыла' s serum) | Ли Биосолюшнс | 493-10 | |
| пиридин | Сигма Олдрич | 360570 | |
| Shimadzu GCMS 2010plus | Симадзу | ||
| Сиостанол-5,6,22,23-д4 | Сигма Олдрич | 680028 | |
| трифторацетат натрия | Сигма Олдрич | 1615138 | |
| SolariX XR 7T | Bruker Daltonics | ||
| TimsTOF Pro Q-TOF | Bruker Daltonics | ||
| U13C глюкоза | Сигма Олдрич | 389374 | |
| Ultimate RS3000 UHPLC | Thermo Fisher Scientific | ||
| VanGuard CSHTM предколонный (5,0 × 2,1 мм; 1,7 μ м, 130 &Аринг;) | Воды |
Ссылки
- Wang, Y., Liu, H., Sun, Z. Lamarck rises from his grave: Parental environment-induced epigenetic inheritance in model organisms and humans. Biol Rev. 92 (4), 2084-2111 (2017).
- Champroux, A., Cocquet, J., Henry-Berger, J., Drevet, J. R., Kocer, A.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
