$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
РАСопатии – это генетические синдромы, которые нарушают нормальное развитие и поражают различные органы и ткани. Эти состояния часто вызваны мутациями зародышевой линии в ключевых генах и участниках, участвующих в передаче сигналов RAS/MAK, что приводит к гиперактивации (повышенному фосфорилированию) внеклеточной сигнал-регулируемой киназы (ERK). ERK регулирует некоторые фундаментальные процессы, важные во время развития - рост тканей - путем перемещения в ядро 1,2. Соматические мутации в генах, участвующих в пути RAS-MAPK, являются наиболее распространенными событиями, приводящими к раку3. Таким образом, неудивительно, что предрасположенность к раку наблюдается и при РАСопатиях. Синдром Нунана (НС), характеризующийся задержкой развития, низким ростом, когнитивным дефицитом различной степени тяжести и кардиомиопатией, является наиболее распространенной формой РАСопатии2. В большинстве случаев заболевание вызвано мутациями GoF в PTPN11, первом гене RASopathy, который был обнаружен в начале 2000 года4 и кодирует протеин тирозинфосфатазу SHP2, который действует как положительный регулятор этого пути.
С тех пор, благодаря экспоненциальному использованию подходов к секвенированию экзома у недиагностированных пациентов, потенциально патогенные варианты, влияющие на факторы, участвующие в RAS-MAPK, и, вероятно, связанные с различными формами RASopathies, продолжают обнаруживаться и ожидают функциональной характеристики для эффективной стратификациипациентов. Для достижения этой цели необходимы экспериментальные протоколы, гарантирующие быструю и информативную функциональную валидацию на уровне организма. Использование классических и стандартизированных моделей млекопитающих для тестирования вариантов с неизвестным значением было бы дорогостоящим, чрезвычайно трудоемким и потребовало бы инвазивных методов на непрозрачных крупных животных. Такая стратегия явно несовместима с требованием о быстром тестировании, учитывая социальную нагрузку, которую представляют плохие или недиагностированные пациенты с RASopathy, в настоящее время не имеющие ведения или лечения. Протоколы количественной оценки ключевых фенотипических признаков и молекулярных коррелятов в целых организмах также послужат ускорению возможной клинической трансляции лекарств, которые могут быть доступны пациентам с RASopathy, путем перепрофилирования/перепозиционирования.
Рыбки данио являются идеальной моделью позвоночных для изучения заболеваний, влияющих на раннее развитие. Начнем с того, что рыбки данио имеют высокий уровень генетической гомологии с человеком. Высокая плодовитость взрослых рыб приводит к большому производству эмбрионов, которые малы и быстро развиваются. Эмбрионы прозрачны на ранних стадиях, так что основные процессы развития — эпиболия, гаструляция, оси и формирование плана тела — могут быть легко визуализированы с помощью стандартной микроскопии. Кроме того, наличие трансгенных линий, которые можно использовать для отслеживания специфического клеточного поведения и динамических молекулярных событий в пространстве и времени во время развития, в сочетании с передовыми методами создания генетических моделей, является непревзойденным. Кроме того, фенотипические показания могут быть оценены на нескольких уровнях у рыбок данио (от организменных до клеточных дефектов), и уже разработаны специальные анализы для нескольких заболеваний, включая RASopathies5. Более того, относительно простые методы погружения в ванну для введения лекарств на ранних стадиях, по крайней мере, для водорастворимых соединений, позволяют проводить высокопроизводительный скрининг лекарств in vivo в формате 96 лунок.
С молекулярной точки зрения, исследования с использованием стандартных подходов, таких как иммуногистохимия и иммуноблоттинг, убедительно демонстрируют корреляцию между активацией ERK и RASopathy-ассоциированными дефектами развития у эмбрионов рыб 6,7. Недавно разработанный биосенсор FRET типа EKAR у рыбок данио (Tg[ef1a:ERK biosensor-nes], Teen) представляет собой надежный инструмент in vivo для регистрации активации ERK во время эмбриогенеза с пространственно-временным разрешением. Следовательно, это может быть полезно для лучшей оценки динамических изменений ERK и фармакологических модуляций в моделях рыб RASopathy.
В сенсоре Teen специфический субстрат ERK в репортере фосфорилируется при активации ERK, вызывая конформационное изменение, которое приводит к тому, что донор флуоресцентного CFP (D) и акцептор флуоресцентного Ypet (улучшенный YFP) (A) находится в непосредственной близости друг от друга. Если спектр излучения D значительно перекрывается со спектром поглощения A, может произойти FRET (поглощение энергии от D к A). Это пропорционально расстоянию между D и A и, следовательно, у подростка — статусу активации ERK. Различные протоколы визуализации могут быть настроены с использованием как стандартных, так и усовершенствованных модулей визуализации стандартных или конфокальных микроскопов как в живых, так и в фиксированных образцах. При D-возбуждении получение мультиспектральных сканов вдоль определенного спектра излучения (λ) от CFP до YFP с последующим использованием спектральных алгоритмов «несмешивания» является одним из наиболее надежных методов регистрации и количественнойоценки данных FRET. Его можно применять и к живым образцам рыбок данио-рерио для записи динамики тканей in vivo .
В соответствии с предыдущими отчетами 6,9 и нашим недавним приложением7, здесь мы подробно описываем пошаговый рабочий процесс с использованием рыб-подростков для оценки активации ERK в клетках на краю животного полюса NS моделей в начале гаструляции и соотнесения его с характерными дефектами осей тела, видимыми только на более поздних этапах развития. Мы показываем, как получить и изучить количественные данные FRET из живых гаструл NS до и после лечения доступным MEKi, а также как провести перекрестную валидацию результатов с помощью стандартной иммуногистохимии против фосфорилированного (активного) ERK или выполнить корреляционный морфометрический анализ дефектов удлинения эмбриона.
Рабочий процесс может быть применен для повышения функционального тестирования новых вариантов и генов заболеваний, предположительно связанных с RASopathies, а также для получения информации о корреляции динамики активации ERK в пространстве и во времени во время развития позвоночных и морфологических дефектов у эмбрионов. Мы показываем, что этот протокол также может быть использован для проверки эффективности препаратов-кандидатов, действующих на модулирование активации ERK.