Методическая статья

Односторонний анализ объема легких с помощью микрокомпьютерной томографии для расширенной оценки легочного фиброза в доклинических моделях

DOI:

10.3791/67837

⸱

20 июня 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Respiratory Diseases, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, Guangzhou Institute of Respiratory Health, the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 2Guangzhou National Laboratory, 3Second Department of Elderly Respiratory, Guangdong Provincial People's Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University, Guangdong Provincial Geriatric Institute

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной работе мы представляем протокол использования микрокомпьютерной томографии (микро-КТ) для количественной оценки вентилируемых областей в односторонней модели легочного фиброза, вызванного блеомицином, путем интратрахеального инстилляции на стороне поражения.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Фиброз легких (ЛП) — это прогрессирующее и необратимое интерстициальное заболевание легких, характеризующееся плохим прогнозом и ограниченными возможностями лечения. Традиционная мышиная модель легочного фиброза, вызванного интратрахеальным введением блеомицина, может привести к неравномерному распределению лекарств и высоким показателям смертности. Усовершенствованный метод односторонней интратрахеальной инстилляции для введения блеомицина мышам позволяет создать более однородную и контролируемую модель легочного фиброза, обеспечивая лучшее моделирование заболевания у людей. В данной работе мы представляем протокол использования микрокомпьютерной томографии (микрокомпьютерной томографии) для количественной оценки вентилируемых областей в односторонней модели легочного фиброза, вызванного блеомицином, путем интратрахеального инстилляции на стороне поражения. Этот подход позволяет количественно оценить общий объем легких и вентилируемые области легких, обеспечивая чувствительную и точную оценку прогрессирования заболевания и ответа на лечение. Это исследование включает в себя анестезию, точное введение лекарств, микрокомпьютерную томографию и постобработку с использованием программного обеспечения 3D Slicer для анализа изображений. Односторонний анализ объема легких после лечения блеомицином показал значительное уменьшение объема легких по сравнению с контрольной группой. Трихромное окрашивание Массона подтвердило наличие и повышенное отложение коллагена у мышей, получавших BLM. В данной работе мы оценили легочный фиброз в доклинических моделях путем проведения одностороннего объемного анализа легких с использованием микрокомпьютерной томографии, что предоставило исследователям точный и тщательный метод оценки терапевтических вмешательств в исследованиях ЛП.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Фиброз легких (ЛП) – это разрушительное и необратимое заболевание легких с ограниченными методами лечения. Глобальная заболеваемость ЛП колеблется от 1 до 13 на 100 000 человек, при этом значительное увеличение распространенности наблюдается с возрастом1 год. Несмотря на значительные усилия за последние десятилетия, терапевтический ландшафт для ЛП остается ограниченным, и только два антифибротических препарата, нинтеданиб и пирфенидон, в настоящее время одобрены для лечения ЛП2. Основной патогенез легочного фиброза очень сложен и охватывает различные аспекты молекулярной и клеточной физиологии3. Экспериментальные животные модели in vivo , индуцированные различными агентами, в настоящее время являются важными инструментами для исследования патогенных механизмов и фенотипов заболеваний.

Мышиная модель легочного фиброза, индуцированная блеомицином, вводимая путем интратрахеальной инстилляции, широко известна для выяснения основных клеточных и молекулярных механизмов и для идентификации потенциальных терапевтических мишеней4. Однако асимметричное и неселективное распределение внутритрахеально закапываемого блеомицина может привести к высоким показателям смертности, в первую очередь из-за неоднородного фиброза и двустороннего повреждения легких 5,6. Для решения этой проблемы мы предложили односторонний подход к интратрахеальному введению, чтобы обеспечить равномерную доставку экспериментальных препаратов в левое легкое и лучше имитировать патологический процесс, наблюдаемый у пациентов с ЛП 7,8,9. Кроме того, техника одностороннего введения может быть также использована для оценки лекарственных средств, требующих локализованного распределения, или для других экспериментальных вмешательств, нацеленных на конкретное легкое.

В доклинических моделях микрокомпьютерная томография (микро-КТ) становится все более ценной для изучения легочных патологий и зарекомендовала себя как мощный инструмент для лонгитюдных исследований, способный предоставить качественные и количественные данные для мониторинга прогрессирования заболевания, а также ответа натерапевтические вмешательства. Микрокомпьютерная томография была использована для оценки общего объема, вентилируемых и невентилируемых областей, морфологии бронхов и плотности тканей. Основываясь на наших предыдущих исследованиях, мы разработали новый метод визуализации, в котором микрокомпьютерная томография использовалась для анализа одностороннего объема легких и оценки уровня фиброза в мышиной модели фиброза легких 7,8,9. Этот метод позволяет количественно оценить аэрированные области легких, обеспечивая более точную и чувствительную меру прогрессирования заболевания и реакции на лечение.

В этом исследовании представлен метод одностороннего анализа объема легких с помощью искусственной вентиляции легких, полученный на основе микрокомпьютерной томографии у мышей, получавших блеомицин. Этот инновационный метод обеспечивает более точную и всестороннюю оценку фиброза легких, потенциально изменяя подход к оценке эффективности терапевтических вмешательств в доклинических исследованиях. Это исследование вносит превосходный вклад в анализ доклинических моделей фиброза легких, обеспечивая мощный метод количественного анализа для оценки эффектов лечения наряду с прогрессированием заболевания.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Гуанчжоуского медицинского университета. Эксперименты проводились на мышах C57BL/6 в возрасте 6-8 недель весом 25-30 г. Мыши содержались в 12-часовом цикле свет/темнота (свет: 25 люкс) с ограниченным доступом к пище и воде и были случайным образом распределены в контрольные группы и группы BLM.

1. Одностороннее легочное интратрахеальное закапывание

  1. Обезболивайте мышей-самцов C57BL/6 (в возрасте 6-8 недель, 25-30 г) с помощью внутрибрюшинной инъекции 1% пентобарбитала натрия (50 мг/кг).
  2. Контролируйте уровень анестезии, наблюдая за частотой дыхания и рефлексом отведения конечностей.
  3. Закрепите мышь в лежачем положении на пластиковой доске под углом 70°-90°, удерживая за резцы и конечности.
  4. Используйте стерильные щипцы с тупым концом, чтобы аккуратно втянуть язык.
  5. Введите специальную тупую иглу 22 G в трахею с помощью ларингоскопа маленького животного для визуализации надгортанника и структуры ротоглотки. Поверните доску против часовой стрелки на -70°, чтобы выровнять левый основной бронх параллельно основному бронху. Продвигайте иглу до тех пор, пока не почувствуете сопротивление.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно измерьте длину катетера с помощью тренировочной мыши аналогичного размера, чтобы обеспечить оптимальную длину введения.
  6. Быстро поверните на угол 30° и влейте 40 μл раствора блеомицина (0,02 мг). Извлеките иглу.
  7. Удерживайте мышь в неподвижном положении не менее 30 секунд, чтобы обеспечить правильное распределение лекарства.
  8. Дайте мышке восстановиться лежа на утепляющем одеяле.

2. Микрокомпьютерная томография (микрокомпьютерная томография)

ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши были отсканированы с помощью системы микро-КТ в соответствии с инструкциями производителя.

  1. Проводите микрокомпьютерную томографию на мышах в течение 3 недель после закапывания блеомицина.
  2. Добавьте соответствующее количество изофлурана в испаритель аппарата для газовой анестезии мелких животных, включите испаритель, отрегулируйте индукционную концентрацию до 3% и поместите мышей в индукционную коробку до тех пор, пока они не потеряют рефлекс шлепка и не начнут медленно дышать.
  3. Извлеките мышей из индукционной коробки и положите их лежа на стол для сканирования так, чтобы конечности мышей были вытянуты, а их тела выровнены по средней линии.
  4. Установите поддерживающую концентрацию изофлурана в таблице сканирования на 1%.
  5. Установите режим сканирования Micro-CT: поперечное поле зрения 43 мм, разрешение 2K x 2K, размер пикселя 0,042 мм, толщина среза 0,042 мм.
  6. После сканирования поместите мышей на теплое одеяло, пока они не проснутся.

3. Постобработка микро-КТ: односторонняя селективная сегментация легких и объемный анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Обработка изображений и количественный анализ выполнялись с использованием бесплатного программного обеспечения с открытым исходным кодом 3D Slicer (http://www.slicer.org) в соответствии с инструкциями производителя. Для нормализации изображений HU были применены диапазоны Clinical Hounsfield Unit (HU) для окна легких, сегментируя паренхиму легких на нормо-аэрированные области ([-1000, -350] HU), как сообщалось ранее 8,9,11. Процедура обработки изображений описана следующим образом:

  1. Откройте 3D Срез. Рабочий интерфейс показан на рисунке 1.
  2. Нажмите кнопку Загрузить, чтобы импортировать данные изображения в формате DICOM. Аксиальные, корональные и сагиттальные изображения будут отображаться в главном интерфейсе (рис. 2).
  3. Настройте параметры, относящиеся к сагиттальному виду, как показано на рисунке 3 (опционально). (1: показать скрытые параметры; 2: выбрать Переименовать текущий объем; 3: ввести новое имя).
  4. В модуле «Редактор сегментов » нажмите « Добавить », чтобы создать сегментацию для селективного анализа легких (правое легкое) (Рисунок 4) (1: Объемы; 2: Редактор сегментов; 3: Добавить сегмент; 4: Установить порог; 5: Настроить пороговый диапазон; 6: Использовать для маскирования; 7: Установить сферическую кисть).
  5. Установите пороговый диапазон на [-1000, -350] HU и включите параметр Использовать для маскировки .
  6. Используйте инструмент «Рисование » со сферической кистью, чтобы сегментировать нужные области легких.
  7. Выберите инструмент «Остров» и выберите «Сохранить выбранный остров». Выделите правое легкое, затем нажмите «Показать 3D», чтобы отобразить 3D-модель на панели визуализации (Рисунок 5) (1: Редактировать острова (соединенные компоненты); 2: Выберите «Сохранить выбранный остров»; 3: Показать 3D-модель).
  8. На панели Терминология измените цвет 3D-модели на синий (необязательно).
  9. Повторите шаги 3.4-3.6 для левого легкого. Обрабатывайте снимки осевой компьютерной томографии грудной клетки слой за слоем, чтобы рассчитать объем вентилируемого левого легкого и создать 3D-модель (Рисунок 6).
  10. Измените цвет 3D-модели левого легкого на желтый (опционально).
  11. Установите непрозрачность сегментации правого легкого на 0,2.
  12. Экспортируйте 3D-модель по мере необходимости (рис. 7).
  13. Сделайте скриншоты 3D-вида или нарежьте изображения и сохраните их (Рисунок 8) (1: Скриншот аннотации; 2: Выберите формат изображения; 3: Измените путь сохранения).
  14. Используйте модуль «Статистика сегментов » для расчета объема легких (мм3) для каждого сегмента и выполнения количественного анализа нормо-аэрированных областей (рис. 9).

figure-protocol-1
Рисунок 1: Интерфейс программного обеспечения 3D Slicer. На рисунке показан основной рабочий интерфейс программного обеспечения 3D Slicer. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-protocol-2
Рисунок 2: КТ-изображения легочного фиброза, вызванного односторонней интратрахеальной инстилляцией у мышей. Аксиальная, корональная и сагиттальная проекции, а также 3D-реконструкция легких после инстилляции блеомицина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-protocol-3
Рисунок 3: Настройка параметров сагиттального обзора. На рисунке показана регулировка параметров, обеспечивающая точную визуализацию и анализ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-protocol-4
Рисунок 4: Сегментация, редактирование и корректировка параметров. На рисунке показан процесс редактирования сегментации и соответствующей корректировки параметров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-protocol-5
Рисунок 5: 3D-сегментация правого легкого. Процесс включает в себя три последовательных шага: редактирование подключенных компонентов для сегментации легких (шаг 1), выбор параметра «Сохранить выбранный остров», чтобы изолировать нужное легкое (шаг 2), и нажатие кнопки «Показать 3D » для рендеринга модели на панели визуализации (шаг 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-protocol-6
Рисунок 6: 3D-реконструкция левого легкого на основе микрокомпьютерной томографии. Аксиальные КТ-изображения грудной клетки обрабатывались слой за слоем для сегментации аэрируемых областей, количественной оценки объема вентиляции и реконструкции 3D-модели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-protocol-7
Рисунок 7: 3D-реконструкция легких на основе микрокомпьютерной томографии объема легких, находящихся на искусственной вентиляции легких, в односторонней модели легочного фиброза. Восстановленные модели экспортировались в заданных форматах в предопределенные директории. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-protocol-8
Рисунок 8: Руководство по сохранению изображений. На рисунке показаны последовательные шаги для сохранения изображений, начиная с запуска функции сохранения через меню «Скриншот аннотации » и заканчивая выбором форматов и определением путей хранения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-protocol-9
Рисунок 9: Статистический анализ на основе микро-КТ в модели одностороннего легочного фиброза. Были проанализированы количественные данные, полученные из нормо-аэрированных областей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

4. Окрашивание трихомами Массона

  1. Зафиксируйте образец легких с помощью 4% параформальдегида при комнатной температуре (RT) на ночь, обезвожьте с помощью градуированного этанола и замесите в парафин. Приготовьте ломтики толщиной 5 мкм с помощью вращающегося микротома.
  2. Выполните трихромное окрашивание Массона на срезах следующим образом.
    1. Депарафинизированные и регидратированные участки промыть в дистиллированной воде с последующей обработкой протравливанием в предварительно подогретой жидкости Bouin при температуре 56-60 °C в течение 1 ч или в течение ночи при RT.
    2. После мытья срезы испачкать раствором гематоксилина железа Вейгерта в течение 10 мин, прополоскать под проточной теплой водой из-под крана в течение 10 мин и погрузить в раствор фуксина скарлатиновой кислоты Бибриха на 10-15 мин.
    3. Добейтесь дифференцировки с помощью раствора фосфомолибдо-фосфовольфрамовой кислоты в течение 10-15 минут и контролируйте, пока богатые коллагеном участки не превратятся из красного в прозрачный.
    4. Затем непосредственно переложите предметные стекла в раствор анилинового синего на 5-10 минут, промойте в дистиллированной воде и дифференцируйте в 1% растворе уксусной кислоты в течение 2-5 минут.
    5. После обезвоживания с помощью сортированного этанола (95% до абсолютного спирта) и очистки от ксилола смонтируйте секции со смолистой средой.

5. Анализ трихромного окрашивания Массона на машинном обучении

  1. Гистопатологическая оценка анализа состава коллагена в легких контрольной группы и легких, обработанных блеомицином, с использованием трихромного окрашивания Массона.
  2. Чтобы уменьшить погрешности, зависящие от наблюдателя, получите цифровые изображения окрашенных участков легких с высоким разрешением с помощью сканера изображений цельного стекла.
  3. Затем количественно проанализируйте коллагеновые участки с помощью автоматизированного программного анализа орбитального изображения 8,9,12. Процесс обучения кратко описан ниже.
    1. Вручную выделите несколько репрезентативных аннотаций для каждой категории тканей (например, коллаген, нормальная ткань и фиброзная ткань). Используйте извлеченные попиксельные функции из аннотированных областей обучения для создания обучающей выборки для метода опорных векторов (SVM).
    2. Для участков, окрашенных Массоном, определите классификацию тканей на три категории: коллаген, нормальная ткань и фон.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Модель машинного обучения подвергается итеративному обучению на целых слайдовых изображениях (WSI) путем повторного аннотирования и уточнения до тех пор, пока проверенные патологоанатомами оценки не подтвердят точную категоризацию тканей. Как только достигается удовлетворительная точность классификации, процесс становится полностью автоматизированным: из каждого пикселя извлекаются особенности в пределах допустимых областей интереса (ROI), и SVM впоследствии с высокой точностью прогнозирует соответствующую категорию ткани.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На рисунке 10A-D представлены результаты изменения объема легких и анализ окрашивания.

Чтобы оценить влияние блеомицина (BLM) на легочную ткань, мы провели сравнительный анализ объемов легких между группами, получавшими физиологический раствор (Ctrl) и группами, получавшими BLM, с использованием методов 3D-визуализации. Объем левого легкого значительно уменьшен в группе BLM по сравнению с Ctrl. Количественная оценка объема левого ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Фиброз легких – это разрушительное заболевание, характеризующееся прогрессирующим рубцеванием легочной ткани, приводящим к снижению функции легких и, в конечном итоге, к дыхательной недостаточности1. Мышиная модель легочного фиброза, индуцированная различными фармакологическими агентами и методами введения, является важным инструментом для понимания прогрессирования заболевания и оценки эффективности потенциальных терапевтических средств, особенно при инстилляции ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (82300092) и Независимого исследования Государственной ключевой лаборатории респираторных заболеваний (SKLRD-Z-202302), а также Проекта по финансированию инновационного потенциала научно-исследовательских институтов провинции Гуандун (KD032024001).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,9% физиологического раствораХоупбиоHBPP008-100
Тупой игла 22GБД383922
3D Слайсер  Платформа для обработки изображений3D Слайсер https://www.slicer.org/
БлеомицинMCEHY-17565
ИзофлуранЗадний приводР510-22
Набор для морилки MassonЙезен60532ЭС58
Микрокомпьютерная томографияПиньшеньОднопланетная телеграф SNC-100
ОрбитаАнализ орбитальных изображенийhttps://www.orbit.bio/
Пентобарбитал натрияСигмаП3761
Ларингоскоп для мелких животныхИнструменты YuyanКГ-02М
СПССIBMВерсия 19.0 
Теплое одеялоЛаборатория Аним ТехЛАТ-16-0323

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Podolanczuk, A. J., et al. Idiopathic pulmonary fibrosis: state of the art for 2023. Eur Respir J. 61 (4), 2200957(2023).
  2. Raghu, G., Selman, M. Nintedanib and pirfenidone: new antifibrotic treatments indicated for idiopathic pulmonary fibrosis offer hopes and raises questions. Am J Respir Crit Care Med. 191 (3), 252-254 (2015).
  3. Moss, B. J., Ryter, S. W., Rosas, I. O. Pathogenic mechanisms underlying idiopathic pulmonary fibrosis. Annu Rev Pathol. 17, 515-546 (2022).
  4. Kolb, P., et al. The importance of interventional timing in the bleomycin model of pulmonary fibrosis. Eur Respir J. 55 (6), 1901105(2020).
  5. Jenkins, R. G., et al. An official American Thoracic Society workshop report: use of animal models for the preclinical assessment of potential therapies for pulmonary fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol. 56 (5), 667-679 (2017).
  6. Wu, Z., et al. Integrating network pharmacology, experimental validation and molecular docking to reveal the alleviation of Yinhuang granule on idiopathic pulmonary fibrosis. Phytomedicine. 128, 155368(2024).
  7. Liao, S., et al. Direct intrabronchial administration to improve the selective agent deposition within the mouse lung. J Vis Exp. (147), e59450(2019).
  8. Fu, Z., et al. Therapeutic effects of fatty acid binding protein 1 in mice with pulmonary fibrosis by regulating alveolar epithelial regeneration. BMJ Open Respir Res. 10 (1), e001568(2023).
  9. Song, S., et al. Intracellular hydroxyproline imprinting following resolution of bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Eur Respir J. 59 (5), 2100864(2022).
  10. Pennati, F., et al. Micro-CT-derived ventilation biomarkers for the longitudinal assessment of pathology and response to therapy in a mouse model of lung fibrosis. Sci Rep. 13 (1), 4462(2023).
  11. Choi, E. J., et al. Serial micro-CT assessment of the therapeutic effects of rosiglitazone in a bleomycin-induced lung fibrosis mouse model. Korean J Radiol. 15 (4), 448-455 (2014).
  12. Yang, P., et al. Comprehensive analysis of fibroblast activation protein expression in interstitial lung diseases. Am J Respir Crit Care Med. 207 (2), 160-172 (2023).
  13. Liu, T., De Los, S. F., Phan, S. H. The bleomycin model of pulmonary fibrosis. Methods Mol Biol. 1627, 27-42 (2017).
  14. Ruscitti, F., et al. Longitudinal assessment of bleomycin-induced lung fibrosis by micro-CT correlates with histological evaluation in mice. Multidiscip Respir Med. 12, 8(2017).
  15. Vande, V. G., et al. Longitudinal micro-CT provides biomarkers of lung disease that can be used to assess the effect of therapy in preclinical mouse models, and reveal compensatory changes in lung volume. Dis Model Mech. 9 (1), 91-98 (2016).
  16. Buccardi, M., et al. A fully automated microCT deep learning approach for precision preclinical investigation of lung fibrosis progression and response to therapy. Respir Res. 24 (1), 126(2023).
  17. Ferrini, E., et al. A new anesthesia protocol enabling longitudinal lungfunction measurements in neonatal rabbits by microCT. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 321 (6), L1206-L1214 (2021).
  18. Jensen, M., et al. 3D whole body preclinical microCT database of subcutaneous tumors in mice with annotations from 3 annotators. Sci Data. 11 (1), 1021(2024).
  19. Lai, R., et al. The longitudinal and regional analysis of bleomycininduced pulmonary fibrosis in mice by microcomputed tomography. Heliyon. 9 (5), e15681(2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

3D Slicer

Похожие статьи