Создание и оценка in vitro усовершенствованной модели легочного фиброза на основе человека

Summary

Был разработан метод визуализации для оценки активации фибробластов в срезах легких человека, выполненных с прецизионной резкой, на основе белка активации фибробластов (FAP). Эта методология создает надежную и воспроизводимую платформу для определения стадии фиброзной прогрессии, продвигая трансляционные модели in vitro для терапевтической разработки при сохранении верности микроокружения тканей человека.

Abstract

Фиброз легких характеризуется необратимым разрушением альвеолярной структуры и избыточным отложением внеклеточного матрикса. Несмотря на то, что животные модели широко использовались в исследованиях легочного фиброза, ни одна из доступных в настоящее время моделей полностью не повторяет прогрессирующую природу ИЛФ или ее определяющий гистологический признак, такой как фибробластические очаги. Усовершенствованные модели in vitro , в том числе прецизионно вырезанные срезы легких (PCLS), часто считаются наиболее физиологически значимой системой легочных тестов и успешно используются для скрининга лекарственных средств. Тем не менее, невозможность дифференцировать степень фиброза в легком IPF привела к ослеплению и неопределенности в полученных PCLS. Предыдущие исследования показали, что активационный белок фибробластов (FAP) может оценить профибротическую активность ИЗЛ, потенциально способствуя ранней диагностике и выбору соответствующих терапевтических окон. В этом исследовании 600 мкм PCLS будет получен от здоровых доноров и пациентов с IPF с использованием шокового слайсера и оценен с помощью молекулярных зондов, нацеленных на FAP, для определения степени активности фибробластов на основе интенсивности флуоресцентного сигнала. Этот подход обеспечивает передовую модель in vitro и метод оценки для исследования легочного фиброза, расширяя возможности изучения механизмов заболевания и оценки терапевтических вмешательств.

Introduction

Фиброз легких (ЛП) является распространенной формой с неизвестной этиологией и особенно плохим прогнозом, при этом средняя пятилетняя выживаемость составляет всего 25%¹. Модель введения интратрахеального блеомицина в настоящее время является наиболее широко используемой моделью животных для доклинических исследований². Тем не менее, фиброз, индуцированный блеомицином, является преходящим и со временем разрешается, что резко контрастирует с необратимой природой IPF³. Кроме того, внутритрахеальная модель блеомицина представляет значительные трудности из-за неоднородной тяжести фиброза, возникающего в результате эндотрахеального введения, будь то хирургическое или нехирургическое вмешательство. Эти ограничения современных животных моделей способствуют высокому проценту неудач клинических испытаний, нацеленных на IPF⁴.

Прецизионно вырезанные срезы легких (PCLS) используются при различных заболеваниях, поскольку они надежно сохраняют специфические для болезни клеточные сети перекрестных помех и микроокружение ^5,6,7. При легочном фиброзе PCLS из легких IPF сохраняет нативную тканевую архитектуру и клеточную гетерогенность, что позволяет наблюдать за различными типами клеток и клеточно-внеклеточными матриксными взаимодействиями ^8,9, делая их репрезентативной моделью ex vivo для исследования легочной патофизиологии. Однако, поскольку легочный фиброз характеризуется гетерогенными фиброзными поражениями в легких, отбор проб PCLS по своей природе слепой. Визуально различить, представляют ли полученные срезы фиброзные участки в фазе покоя, активной фазе или нормальной легочной ткани. Это ограничение подчеркивает необходимость инструментов визуальной оценки и скрининга. Предыдущие исследования показали, что активационный белок фибробластов (FAP) был высоко и специфичен в легочной ткани пациентов с IPF, что указывает на то, что FAP может оценить профибротическую активность ILD¹⁰.

В этом исследовании одноцепочечное антитело против FAP было помечено индоцианином зеленым (ICG) для разработки целевого молекулярного зонда визуализации с усиленным проникновением в ткани. С помощью этого зонда визуализировали 600 мкм PCLS, полученные от здоровых доноров и пациентов с ИЛФ, и оценивали активность фибробластов на основе интенсивности флуоресцентного сигнала. Этот метод визуализации превосходит традиционные методы оценки фиброза (вестерн-блоттинг, кПЦР, трихромное окрашивание Массона или иммунофлуоресценция) благодаря простоте эксплуатации, сохранению цитоархитектурной целостности и жизнеспособности, а также возможности продольного отслеживания прогрессирования патогена. Что еще более важно, он прост в эксплуатации и занимает всего 90 минут. Это обеспечивает усовершенствованный инструмент скрининга для модели PCLS in vitro , облегчая исследование фиброза легких.

Protocol

Исследование было одобрено Этическим комитетом Первой больницы Медицинского университета Гуанчжоу (2021G-29). Диагноз ИЛФ был поставлен на основании физикального осмотра и результатов компьютерной томографии грудной клетки с высоким разрешением в соответствии с диагностическими критериями, установленными ATS/ERS/JRS/ALAT (2022). Все образцы пациентов с ИЛФ были получены путем трансплантации легких или биопсии легких. Образцы здоровой легочной ткани были получены от доноров органов с диагнозом смерть мозга10. Письменное согласие на забор ткани было получено от каждого пациента или его семьи до забора ткани. Для получения подробной информации обо всех материалах, решениях и инструментах, используемых в этом протоколе, см. Таблицу материалов.

1. Получение PCLS человека

Примечание: Пациенты регулярно проходят скрининг на вирусы, такие как ВИЧ, ВГС или сифилис, перед трансплантацией легких или биопсией, и перед проведением последующих экспериментов у них должен быть отрицательный результат, чтобы обеспечить профессиональную безопасность лабораторного персонала.

1. Приготовление растворов
   1. Приготовьте фосфатный буферный раствор (1× PBS) и предварительно охладите при 4 °C.
   2. Приготовьте 2% раствор агарозы. Взвесьте 2 г агарозы и переложите ее в колбу Эрленмейера. Добавьте 100 мл PBS, тщательно перемешайте и нагревайте в микроволновой печи до тех пор, пока смесь не достигнет сильного кипения (≥95 °C), став полностью прозрачной, однородной и без видимых частиц или разводов. Время от времени поворачивайте колбу во время нагревания, чтобы предотвратить чрезмерное кипение. Поместите раствор на водяную баню при температуре 37 °C до использования.
2. Прецизионно нарезанные ломтики легких
   1. Промойте наружную поверхность легочной ткани PBS для удаления излишков загрязнений и крови.
   2. С помощью шприца объемом 20 мл (игла 1,2 мм) отасуньте соответствующий объем агарозы и введите ее в трахею. Медленно вводите агарозу в доли легких до полного надувания. Прекратите инъекцию при обнаружении заметного сопротивления, чтобы предотвратить утечку агарозы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Требуется примерно 10 мл агарозы на каждые 5 × 2 × 1 см тканевого блока, избегая переполнения. Для небольших кусочков ткани используйте шприц объемом 5 мл и формы для встраивания (например, силиконовые формы, пластиковые лотки или центрифужные пробирки, нарезанные по размеру), чтобы облегчить встраивание. Залейте в форму базовый слой агарозы толщиной 1-2 мм и дайте ему частично застыть. Аккуратно поместите легочную ткань на полутвердую агарозу, затем медленно влейте дополнительную агарозу, чтобы полностью покрыть ткань, избегая образования пузырьков. Дайте агарозе полностью застыть.
   3. Поместите легкие на лед примерно на 30 минут, чтобы обеспечить полимеризацию агарозы. Проверьте плевру на твердость и прохладу для подтверждения полимеризации; При необходимости продолжайте охлаждать.
   4. Разрежьте легочную ткань на плиты по 1-2 см с помощью острого лезвия.
   5. Расположите противень для ледяной ванны по центру на разделочном столе и заранее заполните его кубиками льда для предварительного охлаждения.
   6. Включите выключатель питания, нажмите и удерживайте кнопку UP, чтобы поднять предметный столик в подходящее положение.
   7. Осторожно наденьте лезвие на держатель ножа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обращайтесь с лезвием осторожно, чтобы не получить травму. Утилизируйте использованные лезвия в специально отведенных контейнерах для острых предметов.
   8. Отрежьте кусок ленты примерно 3 см в длину и 1 см в ширину. Приложите липкую сторону к лотку и равномерно смажьте нелипкую сторону цианоакрилатным клеем.
   9. Возьмите кусочек легочной ткани с помощью щипцов. Промокните поверхность насухо впитывающей бумагой и положите ее на клеевую ленту. Осторожно надавите, чтобы обеспечить прочную адгезию.
   10. После того как клей схватится, загрузите лоток на поддон для ледяной бани. Заполните предварительно охлажденным PBS до тех пор, пока тканевый блок не будет погружен в воду.
   11. Установите частоту вибрации на "10", а скорость резки на "2". Нажмите кнопку FWD, чтобы начать нарезку. После того, как первый ломтик будет полностью разрезан, нажмите кнопку STP , чтобы остановиться, затем нажмите кнопку RVE , чтобы втянуть лезвие. Выбросьте первый ломтик.
   12. Вручную поверните поворотный стол 6 раз, чтобы установить толщину сечения на 600 мкм. Нажмите кнопку FWD, чтобы продолжить нарезку, и нажмите кнопку STP после того, как секция будет разрезана. Нажмите RVE, чтобы втянуть нож и извлечь срез легкого с помощью пинцета. Поместите ломтик в PBS, содержащий 1% пенициллина/стрептомицина (P/S), и держите его на льду.
   13. Повторите описанные выше шаги нарезки для получения дополнительных PCL, толщина каждого из которых составляет примерно 600 мкм.
   14. Когда текущий тканевый блок почти исчерпан, замените его новым тканевым блоком и повторите шаги с 1.2.4 по 1.2.13.

2. Очистка антител к FAP

Примечание: Сгенерируйте FAP-специфичное однодоменное антитело, содержащее С-концевую метку His, как описано ранее^11,12.

1. Выполнение фагового дисплея для обеспечения высокопроизводительного отбора FAP-специфичных фрагментов антител (scFv) путем многократного панорамирования комбинаторных библиотек по иммобилизованным мишеням или мишеням в фазе раствора. Восстановление связанных фагов с помощью строгого промывания и элюирования. Амплифицируйте фаги путем повторного заражения E. coli и обогащайте целевые связывающие вещества в течение 3-4 циклов. Валидация клонов с помощью фагового ИФА и секвенирования ДНК для идентификации высокоаффинных антител¹².
2. Клонировать последовательность ДНК, кодирующую одноцепочечный вариабельный фрагмент анти-FAP, в вектор pET-28a(+), слитый с меткой His для экспрессии в E. coli¹³.
3. Трансформируйте рекомбинантную плазмиду в клетки E. coli BL21 (DE3). Индуцирование экспрессии белка с помощью изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) в культурах встряхиваемых колб, инкубированных в течение ночи при 20 °C¹⁴.
4. Очистите антитела FAP от надосадочной жидкости с помощью гранул никель-нитрилотриуксусной кислоты (Ni-NTA). Выполнение буферного обмена с PBS для последующих приложений.
5. Оцените чистоту антител с помощью электрофореза в полиакриламидном геле додецилсульфата натрия (SDS-PAGE). Одна доминирующая полоса с ожидаемой молекулярной массой указывает на высокую чистоту.

3. Оценка аффинности антител к FAP

1. Культивирование клеток эмбриональной почки человека 293T (HEK 293T) в модифицированной среде Dulbecco Eagle's Medium (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицина.
2. Добавьте лентивирус с гиперэкспрессией белка активации фибробластов человека (hFAP) к клеткам 293T при 90% конфлюенции. Инкубируйте в течение 96 ч для получения стабильной клеточной линии 293T-hFAP.
3. Расщепите клетки 293T и 293T-hFAP с 0,25% трипсин-ЭДТА и соберите клетки.
4. Промойте клетки PBS и инкубируйте с антителами к FAP с последующим вводом Alexa Fluor 488-конъюгированного анти-His IgG.
5. Анализируйте интенсивность флуоресценции с помощью проточного цитометра NovoCyte^15,16.

4. Мечение молекулярного зонда scFv-FAP-ICG

1. Отрегулируйте концентрацию FAP-scFv до 2 мг/мл с помощью PBS.
2. Добавьте индоцианин зеленый эфир NHS (ICG-NHS) для достижения молярного соотношения 5:1 (ICG-NHS:FAP-scFv).
3. Тщательно перемешайте, вортексируя и встряхивая.
4. Инкубируйте реакцию в темноте при комнатной температуре в течение 2 ч.
5. Удалите несвязанный краситель с помощью обессоливающей колонны. Готовый конъюгированный продукт хранить при температуре 4 °C в темноте.

5. Молекулярный зонд scFv-FAP-ICG для оценки степени активности фибробластов в PCLS

1. После резки PCLS поместите по одной секции на лунку в 12-луночную пластину. Промойте каждую лунку дважды 1 мл PBS, чтобы удалить остатки крови и мусора.
2. Погрузите PCLS в 1 мл DMEM без FBS. Добавьте scFv-FAP-ICG в конечной концентрации 5 мкг/мл. Выдерживать в шейкере при комнатной температуре в течение 1 ч с легким встряхиванием, защищенным от света.
3. Промойте образцы PBS три раза, каждый раз в течение 5 минут.
4. Получение флуоресцентных изображений PCLS методом ICG с помощью системы визуализации животных in vivo со следующими настройками: длина волны возбуждения на длине волны 785 нм и длина волны излучения на длине волны 810 нм.
5. Оценивайте фиброзную активность PCLS на основе интенсивности флуоресценции. Определение областей интереса (ROI) с помощью совместимого программного обеспечения с выражением излучения флуоресценции в виде фотонов/с/^см2/ср.
   1. Нажмите кнопку Select ROI , чтобы позволить программному обеспечению автоматически обводить псевдоцветную область. Если ROI размещен неточно, настройте его вручную. Нажмите « Рассчитать », чтобы определить уровень сигнала в регионе. Если выбрано несколько субрегионов, суммируйте значения из всех субрегионов.

Results

Процедура подготовки ПЦЛС из легочной ткани человека изображена на рисунке 1. Легочная ткань человека была внедрена в агарозу и впоследствии обрезана на тканевые блоки размером примерно 1 см³ с помощью бритвенного лезвия. Обрезанные и сплющенные ткани прикрепляли к платформе для среза на толщине 600 мкм с помощью микротома (рис. 1A, B). PCL инкубировали в 12-луночных планшетах (рис. 1C).

Получе...

Discussion

С помощью вышеуказанных методов исследования были получены ПЦЛС от здоровых доноров и пациентов с ИЛФ. Одновременно с этим клетки млекопитающих были использованы для экспрессии одноцепочечных вариабельных фрагментов FAP, и их чистота и специфичность были проверены. Молекулярный зонд, нацеленный на FAP и меченный ICG, был использован для определения уровней экспрессии FAP, отражающих степень активации фибробластов. Этот подход обеспечивает передовой метод оценки лечения легочного фиброза....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25 % трипсин-ЭДТА	Gibco	15050-057
2&раз; Color SYBR Green qPCR Master Mix (ROX2)	EZBioscience	A0012-R2
20 мл шприц	Winner	V532159
293T cell	Beyotime	C6008
502 клей	Zhuolide	D-40
Agarose, низкая температура гелеобразования	Sigma Aldrich	A9414-25G
Anti-Collagen I антитело	abcam	ab138492
Антитела к фибронектину	abcam	ab2413
Anti-His-tag mAb-Alexa Fluor 488	MBL	D291-A48
BL21	Beyotime	D1009S
Blade	Gillette	7in83a7Q
Color Reverse Transcription Kit (с удалителем gDNA)	EZBioscience	A0010CGQ
Coomassie Blue Super Fast Раствор для окрашивания	Beyotime	P0017F
DMEM	Gibco	12800017
колба Эрленмейера	Sichuan Shunbo	GG-17
FAP Rabbit mAb	CST	66562
FBS	Gibco	10099-141
щипцы	Roboz	RS-5135
ICG-NHS	Ruixibio	R-TE-157
IPTG	MCE	367-93-1
микровесы	Secura	Secura225D-1CN
микроволновая Mideo		PM2002
многорежимная система визуализации животных in vivo	BioLight	AniView600
Ni-NTA	Genscript	L00250
NovoCyte проточный цитометр	ACEA  Biosciences	Novocyte
PBS	Gibco	10010023
пенициллин-стрептомицин	Gibco	15140122
SDS-PAGE	Beyotime	P00528
Универсальная очистка РНК	EZBioscience	EZB-RN4
Vibratome	DOSAKA	DTK-1000N
β-актин Rabbit pAb	Yeasen	30102ES
Primer
β-актин праймер-F	iGenebook Biotech		CATGTACGTTGCTATCCAGGC
β-актин праймер-R	iGenebook Biotech		CTCCTTAATGTCACGCACGAT
FAP primer-F	iGenebook Biotech		TTGAGTGGATGGGAGGGAT
FAP primer-R	iGenebook Biotech		GCTGTGCTCGTGGATTTGT
Collagen-I primer-F	iGenebook Biotech		GAGGGCCAAGACGAAGACATC
Collagen-I primer-R	iGenebook Biotech		CAGATCACGTCATCGCACAAC
Fibronectin primer-F	iGenebook Biotech		CGGTGGCTGTCAAAAG
Fibronectin primer-R	iGenebook Biotech		AAACCTCGGCTTCCTCCATAA