Мышиная модель прогрессирующего периодонтита, индуцированного нейлоновой лигатурой во втором верхнем моляре

Пародонтоз (БП) — это воспалительное заболевание поддерживающих тканей зубов, которое является одним из самых распространенных заболеваний в мире¹; сообщалось, что частота БП колеблется от 20% до 50% во всем мире². БП имеет разную степень прогрессирования; Его легкая форма, называемая гингивитом, поражает только мягкие ткани, а тяжелая форма, называемая периодонтитом (ПТ), поражает твердые ткани, такие как кость³. Поскольку ПТ является воспалительным заболеванием, его следует рассматривать как комплексный иммунный ответ, который может быть изменен несколькими факторами^{риска, которые} могут изменить процесс заболевания, такими как сахарный диабет⁵, сердечно-сосудистые заболевания⁶, гормональные взаимодействия, такие как неблагоприятные исходы беременности⁷ или преэклампсия⁸, воспалительные заболевания⁹ и даже изменения глаз¹⁰ или деменция¹¹.

Таким образом, чтобы понять этиологию, связанную с развитием или распространенностью ПТ, протестировать новые или более эффективные терапевтические стратегии или выявить корреляцию между системными заболеваниями и ПТ или микробиотой пародонта, необходимы животные модели¹².

Выбор эффективного метода исследования имеет решающее значение для понимания развития ФТ и адекватного ответа на исследовательские вопросы¹³. На протяжении многих лет для изучения ПТ были разработаны различные животные модели; Тем не менее, такие модели, как приматы, собаки, кролики и миниатюрные свиньи, дороги и сложны в использовании 14,15,16. Мышиные модели ПТ, в частности модель ПТ, индуцированная лигированием, имеют множество преимуществ, включая быструю разработку, воспроизводимость, предсказуемость и^{низкую стоимость.}

Несмотря на то, что для индукции ПТ используются несколько методов, таких как пероральная бактериальная инокуляция, инъекция липополисахаридов и индукция лигатуры^10,20, каждый из них имеет свои преимущества и недостатки¹⁷, мышиная модель ПТ, индуцированная нейлоновой лигатурой, напоминает человеческий механизм ее развития 20,21,22,23. ПТ происходит за счет удержания резидентной микробиоты, вызывая воспаление и приводя к потере тканей. Кроме того, мыши могут быть генетически модифицированы для изучения различных клеточных популяций или молекул, представляющих интерес для изучения ПТ.

Лигирование зубов может проводиться с использованием различных материалов, таких как ортодонтическая проволока, шелковые шовные нити^24,25 или нейлоновые шовные нити²⁶. Наиболее распространенным материалом для индуцирования ПТ путем лигирования у мышей является шелк; Эта методология была объяснена различными авторами, такими как Marchesan et ^al.18, Abe et ^al.27 и Chadwick et ^al.22, каждый со своими собственными модификациями, и все эти методы были успешно использованы несколькими исследователями²⁸. Тем не менее, наложение шелкового шва вокруг верхних коренных зубов у мышей может быть сложным. Marchesan et al. предложили использовать «лигатурный держатель»; Abe et al. и Chadwick et al. поместили шов через точку контакта, хотя Chadwick et al. поместили его вокруг коренных зубов M1 и M2.

Нейлоновые шовные материалы разной толщины использовались для разработки PT на различных моделях животных 29,30,31. Lima et ^al.31 использовали нейлоновые шовные материалы 5-0; В предыдущих исследованиях мы использовали нейлоновые шовные материалы 6-0 с аналогичными результатами²⁸.

По сравнению с мультифиламентными шовными нитями, нейлоновые шовные нити являются нерезорбируемыми монофиламентными синтетическими и демонстрируют более низкую воспалительную реакцию тканей³²; кроме того, нейлоновые шовные материалы также допускают накопление микробов^33,34, и имеются данные о адгезии Fusobacterium nucleatum и Porphyromona intermedia^35,36, наряду с факультативными анаэробными бактериями в нейлоновых шовных материалах 12,14,17,19,24,27,35,37 (Таблица 1).

Эти характеристики могут позволить воспалительной реакции быть сфокусированной в основном на накоплении бактерий, а не на накоплении материалов. Кроме того, нейлон обладает лучшими механическими свойствами, такими как прочность на разрыв, чем шелк³⁸.

Таким образом, в настоящем исследовании нейлоновый шов 6-0, размещенный вокруг M2 под межпроксимальной контактной зоной, индуцировал развитие периодонтита на поздней стадии у мышей. Такой подход позволяет применять лигатуру с помощью обычного пинцета, и результаты получаются стабильными. Через 30 дней развитие ПВ может быть подтверждено с помощью гистометрического и гистологического анализа.

Все процедуры с участием подопытных животных проводились в строгом соответствии с «Этическими рамками биомедицинских исследований на лабораторных животных» в соответствии с официальным мексиканским стандартом NOM-062-ZOO-1999. Это исследование было одобрено комитетом по этике Facultad de Estudios Superiores Iztacala (FES-Iztacala) в соответствии с протоколом CE/FESI/072024/1765. Мыши были размещены в камерах для животных со свободным доступом к пище и воде в свободной от патогенов среде в животноводческом центре FES-Iztacala. Этот протокол является модификацией метода, ранее описанного Abe et ^al.27. Самки мышей BALB/c в возрасте от 6 до 8 недель (массой 16 г) были разделены на контрольную (CTL) и периодонтитную (PT) группы. Пародонтит был вызван наложением нейлонового шва 6-0 на 0-й день, чтобы способствовать устойчивой бактериальной адгезии и вызвать тяжелое прогрессирование хронического заболевания. Через 30 дней всех мышей усыпляли (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами) для оценки повреждения тканей и потери прикрепления (AL) с помощью гистометрического анализа (рис. 1). Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Подготовка к анестезии

1. Готовят разведение ксилазина и кетамина (1:10) с инъекционной водой (запас). Хранить при температуре 4 °C и использовать в течение 4 недель.
2. Определите и взвесьте каждую мышь. Приготовьте весовую дозу ксилазина (1 мг/кг) и кетамина (2 мг/кг) для внутримышечного введения с помощью инсулинового шприца.
3. Введите 50% от общей дозы раствора анестетика в заднюю четвертину. Повторите процедуру с обратной стороны.
4. Поместите мышей в глубокую коробку (10 см³) и дайте им заснуть, что займет примерно 3-5 минут.
5. Предотвратите сухость глаз и повреждение роговицы из-за анестезии, нанося капли гипромеллозы на каждый глаз каждые 15 минут, пока мыши полностью не проснутся и не смогут нормально моргать.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши должны находиться под наблюдением в течение 45 минут, приблизительной продолжительности анестезии. Если мышь просыпается до завершения процедуры, процедуру следует приостановить, а мышь следует заменить.

2. Позиционирование животного

1. Когда мышь заснет, положите ее на рабочий стол лицевой стороной вверх головой к оператору. Аккуратно потяните каждую ногу без напряжения и закрепите их микропористой лентой, чтобы предотвратить резкие непроизвольные движения. Накройте мышь одеялом или марлей, чтобы сохранить тепло тела.
2. Чтобы морда оставалась открытой, поместите один конец ортодонтической резинки вокруг верхних резцов, а другой конец закрепите на верхнем держателе без натяжения. Поместите вторую ортодонтическую резинку вокруг нижних резцов и закрепите ее на нижнем держателе с помощью резиновой ленты.
3. Поместите разделители щек и осторожно сдвиньте язычок в сторону для лучшей видимости.
4. Расположите микроскоп так, чтобы обеспечить адекватную визуализацию верхних моляров, начиная с объектива наименьшего увеличения. После этого отрегулируйте увеличение, чтобы обеспечить оптимальный комфорт и концентрацию внимания оператора.

3. Наложение лигатуры

1. После того, как изображение станет четким, определите три верхних моляра: самый большой и проксимальный моляр (M1), следующий моляр (M2) и самый маленький и дистальный моляр (M3). Наложите нейлоновый шов 6-0, так как его диаметр облегчает наложение лигатуры и вызывает меньше механических повреждений тканей, чем более широкие швы.
   1. Найдите дистальную сторону M2, возьмитесь пинцетом за кончик нейлонового шовного материала 6-0 и поместите кончик у основания сосочка от нёба. Надавите светом через основание межпроксимального небного пространства по направлению к щечной поверхности (Рисунок 2A).
   2. Как только нейлоновый шов 6-0 пересечет, протяните его через межпроксимальное пространство к щечной стороне (Рисунок 2B).
2. Поместите кончик нейлонового шовного материала 6-0 у основания межпроксимальной области на мезиальной поверхности M2 со стороны щеки. Осторожно надавите на кончик шва, чтобы пересечь его под межпроксимальным пространством, и проведите его через щечное пространство обратно к нёбу (рис. 2C).
3. Осторожно натяните нейлоновый шов 6-0, удерживайте кончик пинцетом, отрегулируйте его вокруг M2 и закрепите шов тремя простыми узлами.
4. Разрежьте нейлоновый шов 6-0 тонкими ножницами (Рисунок 2D).

4. Восстановление животных

1. Чтобы освободить мышь, снимите с ног разделители щек, микропористую ленту и ортодонтические резинки. Сначала снимите резинку вокруг нижних резцов, затем снимите резинку вокруг верхних резцов.
   1. Снимите мышь с рабочего стола, заверните ее в марлю или ткань и положите лицевой стороной вверх. Держите язык в стороне, чтобы дыхательные пути оставались открытыми и предотвращали закупорку.
2. Держите животное в тепле, накрыв тканью или марлей, и под наблюдением до полного пробуждения. Затем поместите их в обычные клетки.
3. Нанесите каплю гипромеллозы на каждый глаз, пока мышь не сможет нормально моргать.
4. Содержать животное следует в стандартных условиях.

5. Проверка лигатуры

1. Проверяйте стойкость нейлоновой лигатуры каждую неделю (Рисунок 3A, B).
2. Возьмите мышь, крепко держите голову и тело и с помощью пинцета откройте морду. Обратите внимание на нейлоновый шов 6-0 вокруг M2 при свете лампы.
3. Устанавливают развитие пародонтоза на основе накопления биопленки и механического раздражения. Убедитесь в этом с помощью гистологического анализа.

6. Гистология

1. Через 30 дней усыпьте мышей в камере с_CO2 (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами). Соберите верхние челюсти, как сообщалось ранее³⁹. Заготовленные ткани промойте в 0,9% растворе NaCl и поместите их в новые, маркированные микроцентрифужные пробирки.
2. Зафиксируйте образцы в 4% растворе параформальдегида на 2 ч при перемешивании.
3. Промойте образцы водопроводной водой в течение 2 часов.
4. Для удаления минералов из кости и приготовления высококачественных парафиновых срезов декальцинируйте образцы в двадцати объемах 4% раствора ЭДТА (pH 7,3) в течение 20 дней в микроцентрифужных пробирках, меняйте ЭДТА каждые 4 дня⁴⁰.
5. Заделайте образцы в парафин. Разрежьте участки размером 5 мкм в области М2 и окрасьте их гематоксилином и эозином (H&E)⁴¹.

7. Анализ данных

1. Рассмотрите окрашенные гистологические срезы под оптическим микроскопом для проведения описательного анализа изменений конфигурации эпителия борозды, десневых волокон, периодонтальных волокон, высоты и целостности альвеолярного гребня.
2. Определите потерю прикрепления (AL), измерив расстояние между цементоэмалевым соединением (CEJ) и самой высокой точкой костного гребня. Проведите линию между этими двумя точками с помощью программы цифрового редактирования. Выполните гистометрический анализ щечной и нёбной поверхностей по методике, описанной Semenoff et ^al.42 (рис. 4).

8. Статистический анализ

1. Проанализируйте данные, полученные из групп CTL и PT, с помощью U-критерия Манна-Уитни. Рассмотрим p < 0,05 как статистически значимый. Используйте программное обеспечение для статистики и построения графиков для анализа.

Эта методология позволяет индуцированным мышам развивать пародонтит (ПТ) со второй недели. За мышами наблюдали еженедельно для проверки наличия лигатуры. Эвтаназия была проведена на 30-й день. Оценивались клинические характеристики всех групп. Контрольная группа сохраняла нормальные характеристики, такие как цвет и структура краевой десны, с течением времени. По сравнению с тканями в группе CTL, в тканях группы ПТ наблюдалось воспаление, кровотечение и образование пародонтальных карманов, которые наблюдались на десневом крае у индуцированных мышей (рис. 5).

Развитие заболевания было подтверждено проведением гистологического и гистометрического анализа AL пародонтальной ткани М2 в обеих группах. В группе CTL были представлены гистологические характеристики, сходные с таковыми у здоровых тканей: эпителий краевой и борозды десны, волокна десны (рис. 6A, синяя стрелка CTL), соединительный эпителий и альвеолярный гребень (рис. 6A, зеленая стрелка CTL); волокна соединительной ткани находились в нормальном положении и высоте; Волокна Шарпи были неповрежденными при их введении в альвеолярную кость и цемент корня; и наблюдалась симметричная толщина вокруг корня (рис. 6A, оранжевая стрелка CTL), особенно в месте крепления как на буккальном, так и на нёбном видах. Ядра клеток в волокнах периодонтальной связки (PDL), соединительной ткани и остеоцитах альвеолярной кости были хорошо видны (40x). В группе ПТ ткани пародонта имели тяжелые повреждения, с наличием пародонтальных карманов, характеризующиеся потерей альвеолярного гребня (рис. 6А, ПТ, зеленая стрелка), апикальной миграцией эпителия и отслоением волокон Шарпея на поверхности корня (рис. 6А, ПТ, оранжевая стрелка). В соединительной ткани, десне и кости щечной и нёбной сторон отсутствовали клеточные ядра (рис. 6A, PT, синяя стрелка), все из которых характерны для пародонтоза.

Гистометрический анализ показал, что в группе CTL положение костного гребня было постоянным с обеих сторон: щечной и нёбной. Более того, по сравнению с группой CTL, в группе ПТ наблюдалось достоверное увеличение глубины AL щечной поверхности (p = 0,0001, 117,5 нм ± 6 против 209,17 нм ± 10) из-за потери тканей. По сравнению с группой CTL, площадь небной поверхности группы PT была достоверно больше (p = 0,03, 175,25 нм ± 8 против 254,03 нм ± 50). Несмотря на то, что с обеих сторон наблюдалось разрушение тканей, оно было более заметным на нёбной поверхности, с большей глубиной и большей потерей прикрепления, чем на щечной поверхности (рис. 6B, C). Эти результаты согласуются с нашими ранее опубликованными результатами, которые показали аналогичное поведение28.

Рисунок 1: Экспериментальный дизайн. Пародонтит (ПТ) индуцировали у шести-восьминедельных мышей BALB/c (16 г) с использованием модели нейлоновой лигатуры 6-0 (день 0). Через тридцать дней после индукции мышей PT и здоровых (CTL) мышей усыпляли для оценки тканей пародонта. Были проведены три независимых эксперимента; общее количество мышей в группах CTL и PT составило n = 9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Пошаговая процедура установки лигатуры для индукции пародонтита. Репрезентативные изображения последовательности шагов, используемых для индуцирования пародонтита во втором верхнем моляре мыши: (A) показано, как нейлоновый шов 6-0 вводится дистальнее M2, от нёбного к щечному; (В) показывает, как следует аккуратно прикладывать давление под зоной контакта; (C) показывает, как нейлоновый шов должен проходить через мезиальную часть M2, от нёбной до щечной; и (D) показано, как нейлоновый шов регулируется вокруг M2 и закрепляется тройным узлом, действуя как лигатура. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Модель заболевания пародонта с нейлоновой лигатурой. (A) Иллюстрация положения лигатуры во втором верхнем моляре. (B) Изображение нейлоновой лигатуры, помещенной в модель мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Гистометрический анализ. Потерю прикрепления (AL) определяли с учетом расстояния между цементоэмалевым соединением (CEJ) и ближайшей точкой альвеолярного гребня, проводя линию между обеими точками на щечной и небной поверхностях. Справочно: V(B): щечный, P нёбный. Увеличение: 10x; масштабная линейка = 100 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Развитие клинических признаков пародонтита у мышей WT. Репрезентативная клиническая картина тканей пародонта, контроль CTL; ПТ, пародонтоз на 1-й день после наложения нейлонового шва 6-0; 30 день после снятия швов. Были получены репрезентативные изображения трех независимых экспериментов; общее количество мышей в группах CTL и PT составило n = 9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 6: Ткани пародонта показали потерю прикрепления и повреждение тканей в нейлоновой модели пародонтита. (A) Репрезентативные гистологические изображения с H&E-окрашиванием тканей пародонта, контроль (CTL); периодонтит (ПТ), левая панель 10х, показан гистометрический анализ, с линией от цементоэмального соединения (CEJ) до края альвеолярного гребня, щечной (B), нёбной (P), обозначенной в синей коробке щечной красной коробкой нёбной. Правые панели щечные и палатинские при близком увеличении в 40x. Синяя стрелка, соединительная ткань; оранжевая стрелка, введение периодонтальной связки в корешковом цементе; зеленая стрелка, костяной гребень. Масштабные линейки = 100 мкм. (B, C) Гистометрический анализ CEJ и самой высокой точки альвеолярного гребня. Было выполнено репрезентативное изображение трех независимых экспериментов; общее количество мышей в группах CTL и PT составило n = 9. Данные выражены в виде средних ± SEM, а значения *p < 0,05 и ****p < 0,0001 были признаны статистически значимыми по U-критерию Манна-Уитни. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Различные материалы, используемые для индукции пародонтоза с помощью лигатуры у мышей.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в связи с публикацией данной статьи.