В этом протоколе описан метод индуцирования односторонней обструкции мочеточника (НН) у мышей для изучения прогрессирования фиброза тканей при обструктивной нефропатии. Он включает в себя хирургические процедуры, послеоперационный уход и методы оценки фиброза.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Модель односторонней обструкции мочеточника для исследования интерстициального фиброза почек
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Фиброз почек является конечным патологическим последствием прогрессирующей хронической болезни почек (ХБП). Модель односторонней обструкции мочеточника (НН) широко используется для выяснения молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе интерстициального фиброза почек, и для выявления потенциальных терапевтических мишеней. Эта модель была установлена на мышах с помощью хирургического лигирования одностороннего мочеточника, процедуры, которая относительно проста и проста в выполнении. Тем не менее, известно, что мышиная модель UUO демонстрирует значительную изменчивость и непостоянство, на которые влияют такие факторы, как деформация мыши, возраст, пол, тип анестезии, продолжительность операции, температура тела во время процедуры, хирургические навыки оператора, условия кормления и общее состояние здоровья мышей. Различия в хирургических техниках, наложении швов и продолжительности обструкции способствуют вариабельности результатов. Кроме того, непоследовательный отбор проб из обструктивных почек еще больше увеличивает вариабельность в оценке фиброза почек. В этом исследовании описывается процесс разработки мышиной модели UUO и оценки интерстициального фиброза, обсуждаются технические проблемы, способствующие непредсказуемости модели, и предлагаются потенциальные решения. Эти выводы направлены на создание более стандартизированного и универсально применимого подхода к исследованию фиброза почек.
Введение
Хроническая болезнь почек (ХБП) поражает более 10% населения мира, и ее распространенностьрастет1. Различные заболевания мочевыводящих путей, включая врожденные анатомические аномалии, нефролитиаз, гиперплазию предстательной железы и опухоли мочевого пузыря, могут приводить к обструкции мочеточника². В результате, мышиная модель односторонней обструкции мочеточника (UUO) является ключевым инструментом для выявления новых механизмов интерстициального фиброза почек, понимания прогрессирования заболевания и оценки потенциальных стратегий лечения. Он широко использовался для исследования происхождения миофибробластов, субкластеров (мио)фибробластов, метаболизма канальцевых клеток и остановки клеточного цикла, частичного эпителиально-мезенхимального перехода и других связанных с ним процессов 3,4,5,6,7,8.
В дополнение к интерстициальному фиброзу почек, индуцированному UUO, другие часто используемые модели интерстициального фиброза почек у грызунов включают модели, индуцированные токсинами, например, с использованием аристолоховой кислоты, фолиевой кислоты и аденина, а также хирургически индуцированные модели, такие как нефрэктомия 5/6 и ишемия-реперфузионное повреждение (ИРИ). Модель UUO имеет ряд преимуществ по сравнению с альтернативными моделями фиброза почек. Например, вызванный токсинами фиброз почек требует относительно длительного периода моделирования (примерно 1-2 месяца), а его токсические побочные эффекты на другие органы могут осложнить исследование механизмов фиброза. Хирургически индуцированные модели, такие как нефрэктомия 5/6, могут привести к значительному кровотечению из почек и инфекции, увеличивая риск послеоперационной смертности. Кроме того, степень индуцированного интерстициального фиброза напрямую коррелирует с объемом резецированной почечной ткани, что затрудняет последовательное воспроизведение одной и той же степени фиброза у каждой мыши.
Почечная модель IRI является основным методом индуцирования острого повреждения почек при ХБП и имеет значительную клиническую значимость. Тяжесть фиброза может быть модулирована путем регулировки времени ишемии и температуры тела; однако, по сравнению с моделью UUO, она более сложна хирургически, и индукция интерстициального фиброза требует более длительной продолжительности13. По сравнению с этими моделями, модель UUO имеет ряд преимуществ, в том числе короткую продолжительность моделирования, минимальную вариабельность, повторяемость и относительно простую хирургическую процедуру. Мышиная модель UUO, которая не включает токсины, создается путем перевязки одного мочеточника, что приводит к обструктивной нефропатии в течение двух недель. Это приводит к гидронефрозу, расширению канальцев и интерстициальному фиброзу, что очень похоже на патологический процесс, наблюдаемый у человека14. Тяжесть фиброза — легкую, умеренную или тяжелую — можно контролировать, корректируя продолжительность эксперимента.
Несмотря на то, что мышиная модель UUO проще в использовании, чем другие модели исследования ХБП, несколько факторов могут существенно повлиять на ее стабильность. Эти факторы включают в себя деформацию мыши, возраст, пол, тип анестезии, продолжительность операции, температуру тела во время операции, хирургические навыки оператора, а также условия кормления и состояние здоровья мышей15,16.
Сведение к минимуму хирургического стресса и инфекции при выполнении процедуры устойчивым и организованным образом под анестезией имеет важное значение для создания воспроизводимой модели мыши UUO. Кроме того, исследования механизмов и потенциальных терапевтических мишеней ХБП могут быть скомпрометированы неопытными операторами, что приводит к увеличению потерь мышей и большей гетерогенности моделей. Для решения этих проблем выделяются ключевые технические аспекты хирургического процесса — до, во время и после процедуры — с акцентом на критические вопросы, требующие внимания. Кроме того, методология оценки мышиной модели UUO детализирована, чтобы предоставить исследователям последовательный и надежный подход.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры с животными проводятся в соответствии с руководящими принципами агентства и одобрены Институциональным комитетом по этике животных Нанкинского медицинского университета. Для устранения половых и штаммовых различий и обеспечения сопоставимости результатов используют только самцов мышей CD1 в возрасте 8-10 недель и массой 22-25 г. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.
1. Подготовка животных и инструментов
- Автоклавируйте все хирургические инструменты перед операцией.
- Взвесьте и обезболите мышей (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами). Правильно подключите аппарат для ингаляционной анестезии и поместите мышей в индукционную камеру с 2% изофлураном, смешанным с кислородом в дозе 1-2 л/мин. Затем поместите нос мыши в носовой конус с постоянным запасом анестезии. Подтвердите надлежащий уровень седативного эффекта, оценив отсутствие реакции на защемление пальца ноги.
ПРИМЕЧАНИЕ: Регулярно проверяйте частоту дыхания и оценивайте уровень анестезии с помощью педального рефлекса мышей. При необходимости отрегулируйте дозу изофлурана. - Поместите мышь на электронную грелку в положении лежа на спине, вытянув голову и шею, чтобы дыхательные пути оставались открытыми. Закрепите лапы малоклейкой лентой.
- Используйте термометр для контроля температуры окружающей среды и поддерживайте ее на уровне 37-38 °C. Введите ректальный зонд и поддерживайте температуру тела мышей на уровне 36,5-37 °C во время процедуры.
- Наносите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы предотвратить травму при ксерозе роговицы.
- Сбрейте волосы над хирургической областью с помощью крема для эпиляции и трижды продезинфицируйте их раствором бетадина.
2. Хирургическое вмешательство
ПРИМЕЧАНИЕ: Как только температура тела стабилизируется на заданном уровне и рефлекс защемления пальцев ног отсутствует, начните следующие хирургические процедуры.
- С помощью хирургического лезвия сделайте вертикальный хирургический разрез примерно на 1-1,5 сантиметра от мочевого пузыря до нижнего левого края ребер, чтобы обнажить брюшную полость.
- Переместите кишечник в правую сторону брюшной полости с помощью ватного тампона, смоченного в стерильном обычном физрастворе, чтобы обнажить левую почку, расположенную ниже задней части селезенки и прилегающую к позвоночнику.
- Используйте щипцы с изогнутой радужной оболочкой, чтобы очистить жир и соединительную ткань, окружающую левый мочеточник. После легкой изоляции перевяжите левый мочеточник близко к нижнему полюсу почки с помощью шелкового плетеного шва 3/0. Выполните вторую лигацию левого мочеточника между первой лигацией и мочевым пузырем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму вариабельность среди мышей, убедитесь, что положение лигирования остается одинаковым у всех субъектов. С помощью левых щипцов наложите шов на кончики правых щипцов и продвиньте шов обратно под мочеточник17. Избегайте включения избытка жира и соединительной ткани в лигирование, так как это может привести к неполной непроходимости почек. Добивайтесь этого, аккуратно поглаживая мочеточник сухими ватными палочками. - Осторожно переместите кишечник в брюшную полость. Сшивайте мышечный и кожный слои отдельно с помощью шелкового плетеного швова 3/0.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наложение швов на кожу и мышечные слои может привести к разрыву раны и повреждению внутренних органов брюшной полости. - При работе с несколькими мышами очистите хирургические инструменты проточной водой и 75% этанолом, прежде чем приступать к следующей мыши.
3. Послеоперационный уход и мониторинг
- Введите 0,5 мл теплого физиологического раствора внутрибрюшинно, чтобы предотвратить обезвоживание.
- Поместите мышей обратно в чистую клетку, пока они не придут в полное сознание.
- Вводите бупренорфин (50 мкг/кг) путем подкожной инъекции в течение 3 дней. Ежедневно наблюдайте за мышами на предмет признаков отсутствия груминга, снижения приема пищи и ненормальной осанки.
4. Послеоперационные оценки
- Гистология
- Усыпьте мышей с помощью передозировки изофлурана (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами). Забор обструкционных и контралатеральных необструкционных почек18 после эвтаназии.
- Для гистологического исследования используйте наибольшую площадь поперечного сечения среза почки.
- Зафиксировать ткани почек в 4% параформальдегиде и разрезать полученные образцы на срезы по 4 мкм.
- Окрашивание срезов почек периодическим кислотным окрашиванием по методу Шиффа (PAS), трихромным окрашиванием по Массону (MTS) или окрашиванием по красному цвету Sirius для выявления повреждения почечных канальцев и фиброза почек.
- Выберите десять случайных полей срезов почек под световым микроскопом при увеличении 200×.
- Рассчитайте долю коллаген-положительной синей области с помощью программного обеспечения ImageJ.
- Вестерн-блот
- Извлечь примерно 20 мг почечной ткани из того же полюса почек UUO с помощью буфера радиоиммунопреципитации (RIPA)18.
- Количественное определение концентрации белка с помощью анализа бицинхониновой кислоты19.
- Загрузите равное количество образцов белка на 4%-10% гели Bis-Tris для электрофореза и перенесите их на мембраны из поливинилидендифторида (PVDF).
- Заблокируйте мембраны PVDF 5% молоком в трис-буферизованном физиологическом растворе Tween (TBST) и инкубируйте их с первичными антителами в течение ночи при 4 °C.
- Мембраны PVDF промыть TBST и инкубировать их со вторичными антителами при комнатной температуре в течение 1 ч.
- Определяйте уровни белков с помощью метода усиленной хемилюминесценции (ECL) и анализируйте их с помощью программного обеспечения ImageJ с глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой (GAPDH) в качестве контроля нагрузки.
- Функция почек
- Обезболите мышей ингаляционным изофлураном (см. шаг 1.2).
- Соберите образцы крови ретроорбитально после анестезии.
- Центрифугируйте образцы крови при давлении 3000 x g в течение 15 минут при комнатной температуре.
- Измеряйте уровень креатинина сыворотки крови и азот мочевины (мочевины) в крови с помощью автоматического сухого химического анализатора для мониторинга функции почек.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Гистология
Периодическое окрашивание кислотой-Шиффом (PAS) выявило расширение канальцев, потерю границ кисти, образование гипса и отек эпителия канальцев. Трихромное окрашивание по методу Массона и окрашивание в красный цвет Сириуса показало интерстициальный фиброз после НВО, в отличие от нормальных компактных канальцев с различимыми просветами, наблюдаемых в фиктивной группе. Степень почечного интерстициального фиброза, обозначенная синими областями при трихромном окрашивании по Массону и красными уч...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Предложена комплексная процедура создания модели UUO, широко используемого подхода к исследованию интерстициального фиброза почек. Кроме того, демонстрируется идентификация и оценка модели, включая оценку функции почек и гистологических изменений. Обсуждаются переменные, влияющие на неоднородность модели, и модифицируемые технические факторы.
Восприимчивость к UUO значительно варьируется в зависимости от возраста, пола и штамма мыши. По сравнению с мышами C57B...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантами Национального научного фонда Китая (82370686/2024YFA1107704), грантом специально назначенного профессора Цзянсу, Проектом научно-технических инноваций Нанкина, Программой высокого уровня развития талантов больницы провинции Цзянсу (этап I) (CZ0121002010037), Фондом естественных наук провинции Цзянсу (BK20240055) и Медицинской инновационной группой Цзянсу JR; Проект по повышению клинического потенциала больницы провинции Цзянсу (первая аффилированная больница Нанкинского медицинского университета) (JSPH-MA-2023-4), приоритетное развитие академических программ высших учебных заведений провинции Цзянсу (Китай) и Национальный фонд естественных наук Китая (81970639/82151320) для Ее Величества.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1 мл шприц | Mingankang | / | |
| 4/0 хирургический шов | Jinhuan Medical | F401 | |
| 75% этанол | лиркон | 6303060031 | |
| для анестезии Воздушный насос | RWD Life Science | R510-29 | |
| Индукционные камеры для анестезии | RWD Life Science | V102-V | |
| Машинка для стрижки шерсти животных | Jinke | / | |
| Бетадин раствор | Lircon | 6303030036 | |
| бупренорфин (анальгетик) | RWD Life Science | / | |
| Изогнутые щипцы для радужной оболочки | глаза jinke | / | |
| Электронная грелка | Reptizoo | AHM23 | |
| тонкие прямые щипцы | Jinke | / | |
| Канистра с газовым фильтром | RWD Life Science | R510-31-6 | |
| Марлевые салфетки | Winner Medical | 601-026576 | |
| Ножницы для радужной оболочки | Jinke | / | |
| изофлуран (анестетик) | RWD Life Science | R510-22-10 | |
| Многовыходной аппарат для анестезии животных | RWD Life Science | R550IE | |
| Иглодержатель | джинке | / | |
| Офтальмологическая мазь | Dechra NDC | 17033-211-38 | |
| Стерильный ватный тампон | Winner Medical | 601-015213 | |
| Стерильный физиологический раствор | Shimen | H20066533 |
Ссылки
- Bello, A. K., et al. An update on the global disparities in kidney disease burden and care across world countries and regions. Lancet Glob Health. 12 (3), e382-e395 (2024).
- Klahr, S. Obstructive nephropathy. Intern Med. 39 (5), 355-361 (2000).
- Lovisa, S., et al. Epithelial-to-mesenchymal transition induces cell cycle arrest and parenchymal damage in renal fibrosis. Nat Med. 21 (9), 998-1009 (2015).
- Grande, M. T., et al. Snail1-induced partial epithelial-to-mesenchymal transition drives renal fibrosis in mice and can be targeted to reverse established disease. Nat Med. 21 (9), 989-997 (2015).
- Kang, H. M., et al. Defective fatty acid oxidation in renal tubular epithelial cells has a key role in kidney fibrosis development. Nat Med. 21 (1), 37-46 (2015).
- Lebleu, V. S., et al. Origin and function of myofibroblasts in kidney fibrosis. Nat Med. 19 (8), 1047-1053 (2013).
- Yang, L., Besschetnova, T. Y., Brooks, C. R., Shah, J. V., Bonventre, J. V. Epithelial cell cycle arrest in g2/m mediates kidney fibrosis after injury. Nat Med. 16 (5), 535-543 (2010).
- Kuppe, C., et al. Decoding myofibroblast origins in human kidney fibrosis. Nature. 589 (7841), 281-286 (2021).
- Ren, J., et al. The transcription factor twist1 in the distal nephron but not in macrophages propagates aristolochic acid nephropathy. Kidney Int. 97 (1), 119-129 (2020).
- Perales-Quintana, M. M., et al. Metabolomic and biochemical characterization of a new model of the transition of acute kidney injury to chronic kidney disease induced by folic acid. PeerJ. 7, e7113(2019).
- Kim, K., et al. Skeletal myopathy in CKD: A comparison of adenine-induced nephropathy and 5/6 nephrectomy models in mice. Am J Physiol Renal Physiol. 321 (1), F106-F119 (2021).
- Tan, R. Z., et al. An optimized 5/6 nephrectomy mouse model based on unilateral kidney ligation and its application in renal fibrosis research. Ren Fail. 41 (1), 555-566 (2019).
- Fu, Y., Xiang, Y., Wei, Q., Ilatovskaya, D., Dong, Z. Rodent models of aki and AKI-CKD transition: An update in 2024. Am J Physiol Renal Physiol. 326 (4), F563-F583 (2024).
- Kramann, R., Menzel, S. Mouse models of kidney fibrosis. Methods Mol Biol. 2299, 323-338 (2021).
- Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney Int. 75 (11), 1145-1152 (2009).
- Nørregaard, R., Mutsaers, H. aM., Frøkiær, J., Kwon, T. H. Obstructive nephropathy and molecular pathophysiology of renal interstitial fibrosis. Physiol Rev. 103 (4), 2827-2872 (2023).
- Thornhill, B. A., Chevalier, R. L. Variable partial unilateral ureteral obstruction and its release in the neonatal and adult mouse. Methods Mol Biol. 886, 381-392 (2012).
- Ren, J., et al. Twist1 in infiltrating macrophages attenuates kidney fibrosis via matrix metallopeptidase 13-mediated matrix degradation. J Am Soc Nephrol. 30 (9), 1674-1685 (2019).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
- Puri, T. S., et al. Chronic kidney disease induced in mice by reversible unilateral ureteral obstruction is dependent on genetic background. Am J Physiol Renal Physiol. 298 (4), F1024-F1032 (2010).
- Falke, L. L., et al. Age-dependent shifts in renal response to injury relate to altered BMP6/CTGF expression and signaling. Am J Physiol Renal Physiol. 311 (5), F926-F934 (2016).
- Song, L., Shi, S., Jiang, W., Liu, X., He, Y. Protective role of propofol on the kidney during early unilateral ureteral obstruction through inhibition of epithelial-mesenchymal transition. Am J Transl Res. 8 (2), 460-472 (2016).
- Saad, K. M., et al. Reno-protective effect of protocatechuic acid is independent of sex-related differences in murine model of UUO-induced kidney injury. Pharmacol Rep. 76 (1), 98-111 (2024).
- Goorani, S., Khan, A. H., Mishra, A., El-Meanawy, A., Imig, J. D. Kidney injury by unilateral ureteral obstruction in mice lacks sex differences. Kidney Blood Press Res. 49 (1), 69-80 (2024).
- La Russa, D., Barberio, L., Marrone, A., Perri, A., Pellegrino, D. Caloric restriction mitigates kidney fibrosis in an aged and obese rat model. Antioxidants (Basel). 12 (9), 1778(2023).
- Wei, Q., Dong, Z. Mouse model of ischemic acute kidney injury: Technical notes and tricks. Am J Physiol Renal Physiol. 303 (11), F1487-F1494 (2012).
- Hammad, F. T. The long-term renal effects of short periods of unilateral ureteral obstruction. Int J Physiol Pathophysiol Pharmacol. 14 (2), 60-72 (2022).
- Chevalier, R. L., Thornhill, B. A., Wolstenholme, J. T., Kim, A. Unilateral ureteral obstruction in early development alters renal growth: Dependence on the duration of obstruction. J Urol. 161 (1), 309-313 (1999).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
