Методическая статья

Мультимодальная платформа оптической визуализации для изучения клеточного метаболизма

DOI:

10.3791/67906

⸱

6 июня 2025 г.

 ,  ,  , 
1Shu Chien-Gene Lay Department of Bioengineering, University of California San Diego, 2Aiiso Yufeng Li Family Department of Chemical and Nano Engineering, University of California San Diego, 3Department of Electrical and Computer Engineering, University of California San Diego, 4Institute of Engineering in Medicine, University of California San Diego, 5Synthetic Biology Institute, University of California San Diego

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Используя мультимодальную платформу, сочетающую безмаркерные методы оптической визуализации, мы разработали протокол для визуализации и количественной оценки клеточной динамики и метаболизма. С помощью визуализации с помощью многофотонной флуоресценции, генерации второй гармоники и микроскопии вынужденного комбинационного рассеяния мы можем создать целостный обзор клеточной и молекулярной среды.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Технологии оптической визуализации имеют решающее значение в биомедицинских исследованиях благодаря их способности получать как морфологическую, так и функциональную информацию из биологических образцов с высоким пространственным разрешением. Эти оптические процессы используют различные взаимодействия световых молекул, такие как рассеяние, поглощение, излучение и генерация гармоник, между фотонами и молекулами в клетках, тканях или органах. В то время как традиционная биомедицинская визуализация исторически была сосредоточена на применении одного метода, недавние исследования показали, что эти различные методы обеспечивают взаимодополняющие идеи, а их совместные результаты обеспечивают более полное понимание молекулярных изменений в процессах старения и развитии заболеваний, а также основы клеточной биологии.

В последние десятилетия методы оптической визуализации без меток продвинулись вперед, что позволило детально исследовать клеточную и субклеточную среду. Например, многофотонная флуоресценция (MPF) не только облегчает целевую визуализацию белков, но и количественно измеряет метаболическую активность с помощью автофлуоресцентных коферментов, достигая высокой глубины проникновения и пространственного разрешения. Генерация второй гармоники (ГВГ) используется для визуализации таких структур, как коллаген во внеклеточном матриксе, в то время как стимулированное комбинационное рассеяние (SRS) отображает химические связи и молекулярный состав in situ с субклеточным разрешением.

Мы разработали мультимодальную платформу визуализации, которая сочетает в себе методы MPF, SHG и SRS. Интеграция этих модальностей в единую платформу позволяет получать многогранную информацию из одной и той же локализации в клетках, тканях, органах или даже телах, способствуя более детальному исследованию сложных взаимоотношений между клеточным метаболизмом, структурой внеклеточного матрикса и молекулярным составом. Эта мультимодальная система обеспечивает субклеточное разрешение, глубокое проникновение в ткани, визуализацию живых клеток/тканей in situ, а также обнаружение без меток и мгновенную корегистрацию без необходимости корректировки положения, переключения устройства или выравнивания после анализа. В этой статье мы представляем протокол визуализации без меток с помощью этой мультимодальной платформы и демонстрируем его применение для характеристики клеточного метаболизма и молекулярной гетерогенности в клетках и тканях для изучения старения и заболеваний.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оптическая биомедицинская визуализация сыграла ключевую роль в углублении нашего понимания биологической структуры и функций. Изображения генерируются путем модуляции возбуждающего света и детектирования сигналов от взаимодействия света с тканью. Первый составной микроскоп, разработанный Гансом и Захариасом Янссенами около 1590 года, использовал две выпуклые линзы в трубке, обеспечивающие увеличение до 30x1. Современные оптические микроскопы, следуя многовековым достижениям, теперь могут достигать разрешения до 1-3 нм 2,3. В дополнение к высокому разреш....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Эксперименты по мультимодальной визуализации без меток

ПРИМЕЧАНИЕ: Данный протокол посвящен настройке и процедуре получения данных мультимодальной визуализации без этикеток.

  1. Настройка мультимодального микроскопа (рис. 1A) и калибровка системы
    1. Разогрейте лазер и подождите примерно 15-20 минут.
    2. Включите блоки управления и мониторы в следующей последовательности: Блок управления | Контроллер с сенсорной панелью | Адаптер переменного тока для основного лазерного пульта Адаптер переменного тока для вспомогательного лазерного пульт....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изображения на рисунке 2 являются репрезентативными для результатов, полученных в результате следования протоколу получения автофлуоресценции FAD и NADH, а также четырех каналов SRS для белка, общих липидов, ненасыщенных липидов и насыщенных липидов. Здесь мы также генерируем псевдогистологическое изображение, как описано в протоколе, с помощью смешивания цветов RGB. Получение каналов MPF и SRS позволяет получить файлы изображений, которые в дальнейшем будут использоваться в ратиометрическом.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта мультимодальная система представляет собой мощную платформу визуализации для целостной визуализации молекулярного окружения образцов в широком диапазоне биологического происхождения и патологических состояний. Преимущество использования различных безметочных методов заключается в возможности получения дополнительной информации и нацеливания на конкретные аналиты, что в противном случае было бы затруднительно или невозможно в рамках одного метода визуализации без меток. В частности, т.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим доктора Глорию Прихубер и членов ее команды HuBMAP за предоставленные срезы легочной ткани человека. Мы благодарим доктора Кун Чжана за предоставление тканей человеческого мозга. Мы также благодарим доктора Ген-Шен Фэн за предоставленные образцы печени мышей. Мы выражаем признательность за поддержку со стороны NIHU54DK134301, NIH R01GM149976, NIH U01AI167892, NIH R01HL170107, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIH U54CA132378, фондов стартапов UCSD, премии Sloan Research Fellow Award и премии CZI DAF2023-328667.

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Фильтр кубический 460 нмOlympusOCT-ET 460/50M32
Полосовой фильтрKR ElectronicsKR27248 МГц
BNC 50 ОмТерминатор Мини схемыSTRM-50
DC блок питанияTopWard6302D
Dichroic MountThorlabsKM100CL
FIJI ImageJImageJ
Масляный конденсатор с высоким содержанием NAOlympus6-U130
Фильтр короткого прохода с высоким наружным диаметромThorlabs950 нм
Инвертированный лазерный сканирующий микроскопOlympusFV1200MPE
Lock-in AmplifierZurich Instruments
picoEmerald Laser SystemПрикладная физика и Электроника, Инк.  Синхронизированный импульсный луч насоса (настраиваемый 720– 990  нм длина волны, 5– 6  PS длительность импульса, а также 80  частота следования МГц) и Стокса (длина волны на 1032&тоньсп; нм, 6&тонкие; PS длительность импульса, а также 80  Частота повторения МГц)
Фотодиодный детектор SIДомашняя
сенсорная панельКонтроллер Olympus
VF-300 Compresstome Прецизионный

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wollman, A. J. M., Nudd, R., Hedlund, E. G., Leake, M. C. From Animaculum to single molecules: 300 years of the light microscope. Open Biol. 5 (4), 150019(2015).
  2. Vicidomini, G., Bianchini, P., Diaspro, A. STED super-resolved microscopy. Nat Methods. 15 (3), 173-182 (2018).
  3. Weber,....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи