Методическая статья

Автоматизированное и высокопроизводительное микробное моноклональное культивирование и сбор с использованием системы омиксной культуры микролитровых капель для одноклеточных микролитров

DOI:

10.3791/67925

⸱

14 марта 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Institute of Biochemical Engineering, Tsinghua University, 2Key Laboratory of Industrial Biocatalysis, Ministry of Education, Tsinghua University, 3Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd., 4Biobreeding Center, Wuxi Research Institute of Applied Technologies, Tsinghua University, 5Center for Synthetic and Systems Biology, Tsinghua University, 6Institute of Biomedical Health Technology and Engineering, Shenzhen Bay laboratory, 7Institute of Biopharmaceutical and Health Engineering, Shenzhen International Graduate School, Tsinghua University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе описывается, как использовать систему омикса культуры микролитровых капель (MISS cell) для выделения, культивирования и сбора микробных моноклональных клеток. Ячейка MISS обеспечивает интегрированный рабочий процесс на основе капельной микрофлюидной технологии, которая обеспечивает превосходную монодисперсность капель, высокую параллельность культивирования и высокую производительность обнаружения биомассы.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чистые бактериальные культуры необходимы для изучения микробной культуромики. Традиционные методы, основанные на твердотельных планшетах, луночных планшетах и микрореакторах, затрудняются громоздкими процедурами и низкой пропускной способностью, что препятствует быстрому прогрессу исследований микробной культуры. Для решения этих проблем мы успешно разработали систему Single-cell Microliter-droplet Culture Omics System (MISS cell) — автоматизированную высокопроизводительную платформу, которая использует микрофлюидную технологию капель для выделения, культивирования и скрининга микробных моноклональных культур. Эта система может генерировать большое количество капель одиночных клеток и культивировать, экранировать и собирать моноклональные колонии за короткое время, облегчая интегрированный процесс от микробной изоляции до сбора. В этом протоколе мы продемонстрировали его применение на примере выделения и культивирования микробиоты кишечника человека и сравнили эффективность микробной изоляции, эффективность моноклонального культивирования и производительность скрининга с использованием метода сплошной культуры. Экспериментальный процесс был простым, а расход реагентов очень низким. По сравнению с методами культивирования на твердых планшетах, клетка MISS может культивировать большее разнообразие видов кишечной микробиоты, предлагая значительный потенциал и ценность для исследований микробной культуромики.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микробная культуромика имеет широкое применение в исследовании полезных микробов в пищевой промышленности, разнообразия микробов окружающей среды, скрининге новых антимикробных соединений и микробиома человека в связи с болезнями 1,2,3,4. Традиционные методы, в первую очередь основанные на твердых планшетах, луночных планшетах или микрореакторах для получения и отбора моноклональных колоний, просты в эксплуатации, но имеют низкую пропускную способность из-за их многоступенчатости. Это ограничение препятствует таким приложениям, как скрининг микробного мутагенеза, исследования микробной культуромики и селекция высокопродуктивных колоний, которые требуют обширного моноклонального скрининга.

В последнее время были разработаны различные устройства для обнаружения и диспенсирования одиночных клеток, которые значительно повышают скорость обработки микробных образцов при одновременном снижении трудозатрат и минимизации ошибок при ручной обработке5. Тем не менее, эти инструменты обычно предназначены только для определенных этапов в рамках традиционных методов, часто требующих обширной интеграции оборудования, занимающих значительное пространство и несущих высокие затраты. В связи с этим возникла острая необходимость в разработке недорогой, универсально применимой платформы для микробного культивирования и скрининга, чтобы компенсировать упомянутые выше недостатки.

В нашей предыдущей работе мы успешно разработали автоматизированную высокопроизводительную платформу скрининга, известную как Single-cell Microliter-droplet-Culture Culture Omics System (MISS cell, далее именуемая «Omics-система»)6. Эта платформа использует капельную микрофлюидную технологию, которая обещает достичь автоматизации и интеграции в микробной изоляции, культивировании исборе 7,8,9,10. Система Omics состоит из нескольких ключевых модулей, включая модуль отбора проб, микрофлюидный чип, систему обнаружения и сбора капель, что позволяет эффективно выделять одиночные клетки, культивировать, моноклональный скрининг и собирать в микробиологических исследованиях. Мы уже использовали систему Omics для достижения высокопроизводительного скрининга мутагенеза Corynebacterium glutamicum6.

Благодаря автоматизации и высокопроизводительным возможностям скрининга системы Omics, ожидается, что ее применение в микробной культуромике позволит быстро получить большой объем микробиологических данных. В этом протоколе мы представили подробную операционную процедуру MISS-клетки на примере выделения и культивирования кишечной микробиоты человека, чтобы продемонстрировать процесс выделения, культивирования, моноклонального обнаружения и скрининга микробных одиночных клеток. Работа с системой Omics проста, и исследователям нужно только следовать указаниям программного обеспечения для последовательной установки микротрубок и микрофлюидного чипа для генерации капель, настройки параметров и подготовки образцов.

В интерфейсе работы программного обеспечения система Omics разделена на три основные функции: изоляция, выращивание и скрининг. Исследователи могут выбирать разные этапы в соответствии с экспериментом. Кроме того, на этапе скрининга капель исследователи могут выбрать один из двух режимов обнаружения: флуоресцентный сигнал или оптическая плотность. Программное обеспечение обеспечивает визуализацию процесса просеивания капель в режиме реального времени. Наконец, исследователи имеют возможность конфигурировать такие параметры, как условия культивирования, обнаруженная длина волны и количество сборных лунок в зависимости от их конкретных экспериментальных требований, и они могут приостановить работу прибора в любое время для выполнения других операций. MISS cell — это безопасная для микробов высокопроизводительная моноклональная скрининговая платформа, простая в эксплуатации и с минимальным расходом реагентов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры исследования соответствуют всем применимым этическим нормам. Процедуры были одобрены Комитетом по этике науки и техники Университета Цинхуа. Для изучения микробиоты кишечника человека были взяты образцы кала у здорового взрослого человека без серьезных заболеваний, который дал письменное информированное согласие.

1. Установка прибора

  1. Поместите прибор системы Omics в чистую или стерильную среду (например, в стерильную комнату или анаэробный стол). Прибор является прецизионным устройством, и при его размещении на объекте учитывайте следующее:
    1. Поддерживайте в приборе нормальное давление и температуру.
    2. Держите прибор вдали от сильных электрических полей, магнитных полей и источников теплового излучения.
    3. Убедитесь, что площадь размещения прибора превышает размеры 2 500 мм (Г) x 1 500 мм (Ш) x 2 000 мм (В).
    4. Поддерживайте влажность прибора в окружающей среде ниже 60%.

2. Подготовка

  1. Последовательно включайте питание системы Omics, компьютера и операционного программного обеспечения системы Omics.
  2. Установка микрофлюидных чипов MISS cell и микрофлюидных чипов для генерации капель:
    1. Откройте дверцу камеры генерации и культивирования капель (рис. 1A) и вертикально снимите защитную крышку микротрубки и микрофлюидного чипа для генерации капель. С помощью одноразового шприца добавьте 10 мл стерильной дистиллированной воды в увлажнитель внутри камеры для выращивания капель (рис. 1C) и установите на место защитную крышку микротрубки и микрофлюидного чипа для генерации капель.
    2. Откройте стерильную упаковку микротрубки и микрофлюидного чипа, генерирующего капли, и вертикально поместите его прямо над камерой культивирования (рис. 1C).
    3. В интерфейсе программного обеспечения нажмите « Установка » (рисунок 2A). В этот момент появляется всплывающее окно с запросом: Подтвердите замену микротрубки и микрофлюидный чип для генерации капель? Нажмите кнопку Да , чтобы начать установку.
    4. Выньте средство для удаления пузырьков воздуха и закрепите его вверх ногами на месте удаления пузырьков воздуха в камере генерации и культивирования капель. Будьте осторожны, чтобы не надавить на входную и выходную трубки капли устройства для удаления пузырьков воздуха (Рисунок 1E).
    5. Подсоедините трубку для выхода капель устройства для удаления пузырьков воздуха к расположенному под ним зажимному клапану и пропустите его через отверстие, которое направлено в камеру обнаружения и сбора капель (рис. 1B).
    6. Откройте дверцу камеры обнаружения и сбора капель, вертикально вставьте трубку обнаружения, уже подключенную к отводящей трубке, в гнездо обнаружения и убедитесь, что трубка обнаружения полностью вставлена (Рисунок 1D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: При установке контрольной трубки вставьте ее вертикально без каких-либо изгибов на трубке.
    7. Затяните винт, которым фиксируется контрольная трубка по часовой стрелке. Убедившись, что трубка обнаружения полностью вставлена и закреплена, закройте дверцу камеры обнаружения и сбора капель.
    8. Микротрубка и микрофлюидный чип для генерации капель состоят из 10 силиконовых трубок, каждая из которых помечена номером (L01-L10). Подсоедините каждую промаркированную трубку к соответствующему пронумерованному зажимному клапану (01-10) (Рисунок 1C).
    9. Подключите быстроразъемный соединитель микротрубки и микрофлюидного чипа для генерации капель к соответствующему порту в системе Omics: C1 к O1, C2 к O2, C4 к O4 и CF к OF.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Установка микротрубки и микрофлюидного чипа для генерации капель завершена. C3 не нужно подключать к O3.
    10. После того, как установка микротрубок и микрофлюидной стружки для генерации капель завершена, появляется всплывающее окно с предложением открыть зажимной клапан для капельной трубки. Нажмите OK, когда установка микрофлюидного чипа с микротрубками и генерацией капель будет завершена. Убедившись, что все силиконовые трубки из микротрубки и микрофлюидного чипа для генерации капель прикреплены к соответствующему зажимному клапану, нажмите OK.
  3. Инициализация инструмента
    1. Перед выполнением инициализации нажмите на интерфейс Setting (рисунок 2B) для настройки соответствующих параметров: режим обнаружения (обнаружение на основе OD или на основе флуоресценции; Наружный диаметр), температуру инкубации (37 °C) и время (30 дней = 720 ч), скорость мешалки (20 об/мин), длину волны обнаружения наружного диаметра (600 нм), а также длину волны возбуждения и излучения флуоресцентного детектирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры, используемые для выделения и культивирования кишечной микробиоты человека в данном протоколе, приведены в скобках. При настройке параметров температура выращивания должна быть в пределах от 5 °C до 50 °C. При выборе режима обнаружения оптическое волокно необходимо заменить, если волокно на модуле обнаружения капель отличается (см. шаг 2.3.2). При настройке параметров опорное значение масляной фазы (базовое спектральное) автоматически определяется программным обеспечением, что устраняет необходимость в ручной регулировке.
    2. Замена обнаруженного оптического волокна
      1. Извлеките обнаруженное волокно из держателя волокна (открутите против часовой стрелки) и ослабьте крепежный винт волокна на модуле капель (рис. 1D).
      2. Если оптическое волокно не будет использоваться, извлеките его из модуля, вставьте в держатель волокна и затяните. Вставьте обнаруженное волокно в порт обнаружения и затяните крепежный винт волокна на модуле. Замена оптического волокна завершена.
    3. Перейдите в главный интерфейс и нажмите «Инициализировать», чтобы система Omics выполнила самопроверку своих компонентов, включая насос впрыска, настройки температуры, тестирование сброса отработанной жидкости, модуль скрининга и модуль обнаружения капель.
      1. Во время инициализации проведите испытание сброса отработанной жидкости из модуля обнаружения капель, впрыскав 1 мл 75% спирта в порт для отработанной жидкости и наблюдая, нормально ли вытекает жидкость.
      2. Для тестирования скринингового модуля поместите 96-луночный планшет на место расположения планшета и посмотрите, нормально ли движение планшета.

3. Генерация капель

  1. Сбор и обработка образцов микробиоты кишечника человека
    1. Подготовьте ночной горшок и контейнеры для стула, вымойте руки и наденьте перчатки, чтобы собрать свежие образцы стула.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При сборе образцов кала по возможности избегайте загрязнения мочи. Лучше заранее помочиться, а стул поместить в чистую сухую емкость.
    2. Асептически соберите необходимое количество стула среднего сегмента и запечатайте его в стерилизованные криовиалы (примерно 3-5 г на флакон). Немедленно поместите флаконы на лед для последующей аликвотации и маркировки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если образец кала большой или не может быть собран сразу, его следует собрать в течение максимум 2 часов.
    3. На анаэробной скамье используйте стерильный тампон или инструмент для забора кала для сбора образца среднего сегмента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поверхностный слой стула содержит отторгнутые клетки слизистой оболочки кишечника и подвержен внешнему загрязнению; после контакта с воздухом некоторые микробные ДНК начинают разрушаться.
    4. Собранные образцы кала переложите в стерильные микроцентрифужные пробирки объемом 2 мл или стерильные криовиалы, каждая пробирка должна содержать 0,5-2,0 г стула. Подготовьте две аликвоты для заморозки на каждый образец.
    5. Повторно суспендируйте свежий образец кала в стерильном физиологическом растворе, при этом каждые 100 мг стула разводят в 1 мл раствора. Тщательно перемешайте стул до тех пор, пока не будут видны крупные частицы.
    6. После естественного осаждения в течение 10 минут последовательно отфильтруйте надосадочную жидкость через стерильные сетчатые фильтры с размерами пор 200 меш (0,075 мм), 400 меш (0,038 мм) и 800 меш (0,018 мм) для удаления непереваренной пищи и более мелких твердых частиц. Наконец, соберите фильтрат в стерильные центрифужные пробирки.
    7. Возьмите 10 μл отфильтрованной фекальной суспензии и определите микробную концентрацию с помощью гемоцитометра и инвертированного флуоресцентного микроскопа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После фильтрации надосадочной жидкости образца кала через ячейки разного размера остаются некоторые более мелкие частицы кала. Поэтому при определении концентрации микробов активные частицы, наблюдаемые под микроскопом, рассматриваются как микроорганизмы, что позволяет лишь приблизительно рассчитать концентрацию микроорганизмов.
    8. Перенесите фекальную суспензию в стерильную центрифужную пробирку объемом 1,5 мл и пометьте ее датой, концентрацией микроорганизмов и названием образца. Оставьте часть для последующих экспериментов, а остальное храните при температуре 4 °C в будущем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Своевременно записывайте информацию об образце (название образца, время сбора), чтобы обеспечить одновременный сбор образцов (с учетом изменений временного ритма кишечных микроорганизмов млекопитающих). Весь сбор и обработка проб должны осуществляться в анаэробной среде.
  2. Подготовка к начальной суспензии кала
    1. Приготовьте среду Brain Heart Broth (BHI) в соответствии с протоколом производителя и простерилизуйте ее путем автоклавирования при 121 °C в течение 15 минут.
    2. Возьмите фекальную суспензию из шага 3.1.8 и выполните последовательное разведение средой BHI до достижения концентрации ~50 клеток/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы наполнить флакон с образцом, приготовьте не менее 40 мл фекальной суспензии.
    3. Убедившись, что на дне находится небольшая магнитная мешалка, вылейте разбавленную фекальную суспензию в бутылку с образцом до места добавления образца. Закрутите колпачок и закрутите его. Затем вставьте быстроразъем A в быстроразъем B, чтобы завершить процесс загрузки образца (рис. 3A).
    4. Поместите флакон с образцом в указанное положение и отделите быстроразъемные соединения A и B от флакона с образцом. Подсоедините быстроразъем A флакона с образцом к порту O3 в системе Omics, а разъем C3 на микротрубке и микрофлюидном чипе для генерации капель подключите к быстроразъемному разъему B. Закройте дверцу камеры генерации капель и культивирования (рис. 3B).
  3. Генерация капель
    1. Выберите желаемое количество капельных трубок, которые будут сгенерированы в домашнем интерфейсе программного обеспечения (рис. 2A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый прогон может производить до 10 капельных трубок, при этом каждая трубка генерирует около 5 000 капель.
    2. Нажмите «Создать» в домашнем интерфейсе программного обеспечения, чтобы начать генерацию капель одиночных клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, работает ли насос для сброса отработанной жидкости или нет. Во время генерации капель каждая капля имеет объем 2,0 мкл. Смотрите раздел обсуждения для описания генерации капель.
    3. Подождите, пока звуковой сигнал не укажет на то, что генерация капель завершена. Закройте зажим на разъеме C3 (рис. 1E) и извлеките флакон с образцом.

4. Выращивание капель

  1. Выберите тот же номер капельной трубки, что и во время генерации капель, в домашнем интерфейсе программного обеспечения, нажмите «Культура», подтвердите время и температуру выращивания и начните процесс. Следите за индикатором выполнения в домашнем интерфейсе, который показывает прогресс обработки и оставшееся время.
  2. Подождите, пока звуковой сигнал не укажет на то, что выращивание капель завершено. Если время обработки необходимо продлить, отрегулируйте время непосредственно в интерфейсе настроек .

5. Просеивание капель

  1. Нажмите кнопку UV на системе Omics, чтобы включить ультрафиолетовое (УФ) излучение (рис. 1A), облучайте камеру обнаружения и сбора капель в течение 30 минут, а затем выключите ультрафиолетовое излучение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед включением ультрафиолетового излучения убедитесь, что дверца камеры обнаружения и сбора капель закрыта.
  2. В сверхчистом скамейке откройте все 96-луночные планшеты, используемые для сбора капель, и сложите их друг на друга без крышек, последовательно пронумеровав их снизу вверх. Следите за тем, чтобы верхняя пластина колодца была закрыта крышкой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В каждом прогоне может быть до десяти 96-луночных планшетов, а количество планшетов зависит от общего количества капель.
  3. Откройте дверцу камеры обнаружения и сбора капель, установите луночные пластины в обозначенные места (рис. 1D), снимите крышку с верхней луночной пластины и закройте дверцу камеры.
  4. Включите ультрафиолетовый свет на системе Omics на 30 минут, чтобы выполнить вторичную стерилизацию.
  5. Установка устройства для удаления пузырьков воздуха
    1. Снимите средство для удаления пузырьков воздуха с места установки, открутите крышку и снимите винт в форме бабочки с крышки (рисунок 3C).
    2. Налейте 200 мл масла для удаления пузырьков воздуха в средство для удаления пузырьков воздуха, плотно закрутите флакон с крышкой средства для удаления пузырьков воздуха на системе Omics, а затем зафиксируйте средство для удаления пузырьков воздуха вверх ногами на месте удаления пузырьков воздуха. Установка средства для удаления пузырьков воздуха завершена.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При фиксации средства для удаления пузырьков воздуха на месте убедитесь, что масло не вытекает. Если произошла утечка, закрутите крышку.
  6. Выберите капельную трубку для сортировки в домашнем интерфейсе, нажмите кнопку Сортировка, введите количество луночных пластин, которые необходимо собрать, а затем начните процесс. После начала скрининга капель наблюдайте за областью отображения процесса, на которой в режиме реального времени отображаются измерения оптической плотности (OD) капель или значений флуоресценции.
  7. Проанализируйте примерно 20-30 капель, чтобы проверить значение OD. Например, если обнаружено, что большинство из них имеют значение OD ~0,2, что соответствует значению OD пустых капель, основанное на распределении Пуассона, установите нижний порог OD равным 0,5, а верхний порог OD равным 4,0. Капли в этом диапазоне будут автоматически собираться в 96-луночные планшеты (Рисунок 4A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Согласно закону Беера-Ламберта, значение OD пустых капель определяется составом питательной среды внутри капель. Как правило, нижний порог OD устанавливается на 0,2-0,3 единицы выше, чем значение OD пустых капель, чтобы обеспечить четкое различие между пустыми каплями и каплями, содержащими микроорганизмы.
  8. Подождите, пока звуковой сигнал не укажет на то, что фильтрация и сбор капель завершены. Откройте дверцу камеры обнаружения и сбора капель, наденьте крышку луночной пластины на верхнюю луночную пластину, а затем выньте все луночные планшеты из камеры вместе, чтобы провести последующее секвенирование и резервное копирование.

6. Экспорт данных и отображение тепловых карт

  1. Нажмите кнопку Экспорт данных, чтобы сохранить собранные данные о сигнале капель (рис. 4A, B).
  2. Нажмите Тепловая карта, выберите файл данных сбора капель и наблюдайте за значениями наружного диаметра капель, собранных на микропланшете, отображаемом программным обеспечением. Визуализируйте эти значения ОП в виде тепловой карты, где интенсивность цвета соответствует распределению ОП по лункам, обеспечивая четкое и интуитивно понятное представление собранных значений ОП моноклональных ОП (рис. 4A, C).

7. Чистка ячейки MISS

  1. После завершения эксперимента выберите капельную трубку, которую необходимо очистить, и нажмите кнопку Очистить , чтобы начать очистку прибора.

8. Микробное моноклональное резервное копирование и секвенирование образцов

  1. Секвенирование пробоподготовки
    1. На анаэробном стенде добавьте по 100 мкл среды BHI в каждую лунку собранной капельной пластины, хорошо перемешайте с помощью пипетирования, а затем возьмите по 10 мкл из каждой лунки и переложите все это в одну стерильную пробирку объемом 15 мл. Vortex для получения смешанной микробной суспензии.
    2. Добавьте 5 мл фосфатно-солевого буфера в смешанную микробную суспензию, центрифугируйте при 1000 × г в течение 10 минут, удалите надосадочную жидкость и поместите микробную гранулу в жидкий азот для быстрого замораживания. Подготовка образца для секвенирования завершена.
    3. Используйте методы ампликон-секвенирования 16S рДНК, нацеленные на домены V3 и V4 16S рДНК. Конкретные используемые праймеры для секвенирования: 341F: ACTCCTACGGGAGGCAGCA и 806R: GGACTACHVGGGTWTCTAAT.
  2. Криоконсервация микробного моноклонального образца:
    1. После сбора 10 мкл образца из каждой лунки в капельные пластины (с шага 8.1.1) добавьте 30 мкл глицерина в каждую лунку. Поместите планшеты при температуру ниже -80 °C для сохранения микробного штамма.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

По оценкам, микробиота кишечника человека, составляющая преобладающее микробное сообщество, содержит в кишечнике примерно 4 ×10 13 микроорганизмов, что свидетельствует о ее огромном количестве и сложном составе11. В этом исследовании мы стремились изолировать и культивировать микробиоту кишечника и использовали метод твердой пластины в качестве контроля, чтобы продемонстрировать высокую пропускную способность клетки MISS.

Во-первых, мы использовали одну и ту ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе описывается работа клетки MISS для автоматизированной и высокопроизводительной микробной моноклональной изоляции, культивирования, обнаружения и сбора. По сравнению с традиционными методами, с помощью которых можно было выделить и культивировать только ~20%-30% микробиоты кишечника 2,12, количество моноклональных клонов, полученных с помощью системы Omics, было в 1,97 раза выше, чем полученных из твердых планшето...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано проектами исследований и разработок в ключевых районах провинции Гуандун (2024B1111130002), проектами исследований и разработок провинции Хэбэй (22375503D) и проектом открытия Аньхойской инженерной лаборатории по промышленной микробиологии молекулярной селекции (грант ELMB-07).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Чашка Петри 100 ммMerck KGaA, Дармштадт, ГерманияP5731-500EAДля приготовления твердых тарелок
30 мл Контейнеры для стулаBoen Healthcare Co., Ltd611101Для сбора образцов кала
37 ° C инкубатор с постоянной температуройShanghai Yiheng Technology Co., Ltd.LRH-150Культивирование твердой пластины в инкубаторе
96 лунок Прозрачное плоское дно Полистирол Микропластины, обработанные TCCorning3599Для обнаружения движения луночной пластины и сбора капель
AgarBecton, Dickinson and Company214010Для подготовки твердой пластины
Масло для удаления пузырьков воздухаLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MISS cell-S-oilСредство для удаления пузырьков воздуха во время скрининга
капель Средство для удаления пузырьков воздухаLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MISS cell-SИсключите газовую фазу между каплями перед выполнением обнаружения и сбора капель
Анаэробный стендБизнес-отдел космического оборудования с аргоном и азотом, город Хайюй, город ЧаншуVGB-4CM Для асептической эксплуатации и УФ-стерилизации в анаэробных условиях
АвтоклавPuhexi Health and Medical Equipment Co., Ltd.MLS-830LДля автоклавирования среды BHI, трубки EP и так далее.
Мозговая инфузия сердца (BHI) БульонQingdao High-Tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., LtdHB8297-1Компоненты среды BHI
Список ингредиентов:
38,5 г/л BHI Бульон в дистиллированной воде
Разбрасыватель клетокMerck KGaA, Дармштадт, ГерманияHS8151Инокулируйте микробный раствор на твердую пластину
Центрифужная трубка, 15 млBeijing Xinhengyan Technology Co., LtdHB53397Для приготовления микробных растворов
КомпьютерLenovoE450Установка программного обеспечения и управление клетками MISS
CryovialThermo Fisher2.0 млДля сохранения кала
Дистиллированная водаBeijing Mreda Technology Co., Ltd.M306444-100 млДобавьте в увлажнитель воздуха для поддержания влажности в камере для культивирования капель
EP пробиркаThermo Fisher2,0 млДля сбора образцов кала
Флуоресцентный инвертированный микроскопOlympus Life Science (LS)CKX53Проверьте и рассчитайте микробную концентрацию
ГлицеринGENERAL-REAGENTG66258AДля сохранения
штаммаГемоцитометрAcmecAYA0810-1eaРассчитать микробную концентрацию
KClAmbeedA442876Компоненты фосфатно-солевого буфера (раствор PBS)Список ингредиентов: 8 г/л NaCl, 0,2 г KCl, 1,44 г Na2HPO4, 0,24 г KH2PO4 в дистиллированной воде
KH2PO4MACKLINP815661Компоненты фосфатно-солевого буфера (раствор PBS)Список ингредиентов: 8 г/л NaCl, 0,2 г KCl, 1,44 г Na2HPO4, 0,24 г KH2PO4 в дистиллированной воде
Сетчатый фильтрAnping Jiufeng Wire Mesh Manufacturing Co., Ltd200 меш (0.075 мм), 400 меш (0.038 мм), 800 меш (0.018 мм)Удалите непереваренную пищу и более мелкие твердые частицы из образцов стула
Микротрубки и микрофлюидные чипы для генерации капельLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MISC-B2Для генерации капель и инкубации капель
MISS клеточное маслоLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MISS cell-BOS-BМасляная фаза для капельной микрофлюидики
MISS cell программное обеспечениеLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MISS cell V3.2.4Выполнить экспериментальные операции на приборе MISS cell
Na2HPO4SolarbioD7292Компоненты фосфатно-солевого буфера (PBS раствор)Список ингредиентов: 8 г/л NaCl, 0,2 г KCl, 1,44 г Na2HPO4, 0,24 г KH2PO4 в дистиллированной воде
NaClGENERAL-REAGENTG81793JКомпоненты физиологического раствора
Список ингредиентов:
9 г/л NaCl в дистиллированной воде
Пипеткаeppendorf2,5 μ L, 10 μ L, 100μ L, 1000μ LДля работы с жидкостями
трубка из политетрафторэтиленаShenzhen WOER Heat-shrinkable Material Co., Ltd.3401000141Для капельной инкубации. Этот материал уже был включен в микротрубки и микрофлюидные чипы для генерации капель
Образец бутылкиLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MISS cell-bottleОтбор проб микробного раствора
Single Cell Microliter-droplet Culture Omics System (MISS cell)Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MISS cell-G3fВыполнение микробной моноклональной изоляции, культивирования, обнаружения и сбора
Superspeed CentrifugeThermo FisherSorvall Lynx 4000 Приготовьте микробный раствор для секвенирования
ШприцJiangsu Zhiyu Medical Instructment Co., Ltd10 млНаберите дистиллированную воду и введите ее в увлажнитель воздуха в камере для выращивания капель
Ультранизкотемпературный холодильникSANYO Ultra-low МДФ-У4086С Для сохранения деформации (-80 °°; В)

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hurst, C. J. Isolation and cultivation of bacteria. The structure and function of aquatic microbial communities. , Springer International Publishing. Cham. 313-351 (2019).
  2. Xu, M. Q., Pan, F., Peng, L. H., Yang, Y. S. Advances in the isolation, cultivation, and identification of gut microbes. Mil Med Res. 11 (1), 34(2024).
  3. Lattermann, C., Büchs, J. Microscale and miniscale fermentation and screening. Curr Opin Biotechnol. 35, 1-6 (2015).
  4. Huang, Y., et al. High-throughput microbial culturomics using automation and machine learning. Nat Biotechnol. 41 (10), 1424-1433 (2023).
  5. Brehm-Stecher Byron, F., Johnson Eric, A. Single-cell microbiology: Tools, technologies, and applications. Microbiol Mol Biol Rev. 68 (3), 538-559 (2004).
  6. Jian, X., et al. Single-cell microliter-droplet screening system (miss cell): An integrated platform for automated high-throughput microbial monoclonal cultivation and picking. Biotechnol Bioeng. 120 (3), 778-792 (2023).
  7. Hu, B., et al. One cell at a time: Droplet-based microbial cultivation, screening and sequencing. Mar Life Sci Technol. 3 (2), 169-188 (2021).
  8. Leygeber, M., et al. Analyzing microbial population heterogeneity-expanding the toolbox of microfluidic single-cell cultivations. J Mol Biol. 431 (23), 4569-4588 (2019).
  9. He, Z., Wu, H., Yan, X., Liu, W. Recent advances in droplet microfluidics for microbiology. Chinese Chemical Letters. 33 (4), 1729-1742 (2022).
  10. Kaminski, T. S., Garstecki, P. Controlled droplet microfluidic systems for multistep chemical and biological assays. Chem Soc Rev. 46 (20), 6210-6226 (2017).
  11. Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Are we really vastly outnumbered? Revisiting the ratio of bacterial to host cells in humans. Cell. 164 (3), 337-340 (2016).
  12. Simrén, M., et al. Intestinal microbiota in functional bowel disorders: A rome foundation report. Gut. 62 (1), 159-176 (2013).
  13. Periyannan Rajeswari, P. K., Joensson, H. N., Andersson-Svahn, H. Droplet size influences division of mammalian cell factories in droplet microfluidic cultivation. Electrophoresis. 38 (2), 305-310 (2017).
  14. Jian, X., et al. Microbial microdroplet culture system (mmc): An integrated platform for automated, high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution. Biotechnol Bioeng. 117 (6), 1724-1737 (2020).
  15. Baret, J. -C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
  16. Kubie, L. S. The solubility of O2, CO2, and N2 in mineral oil and the transfer of carbon dioxide from oil to air. J Biol Chem. 72 (2), 545-548 (1927).
  17. Poon, C. Measuring the density and viscosity of culture media for optimized computational fluid dynamics analysis of in vitro devices. J Mech Behav Biomed Mater. 126, 105024(2022).
  18. Yao, J., Lin, F., Kim, H. S., Park, J. The effect of oil viscosity on droplet generation rate and droplet size in a t-junction microfluidic droplet generator. Micromachines. 10 (12), 808(2019).
  19. Venkateshwarlu, A., Bharti, R. P. Effects of capillary number and flow rates on the hydrodynamics of droplet generation in two-phase cross-flow microfluidic systems. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers. 129, 64-79 (2021).
  20. Nekouei, M., Vanapalli, S. A. Volume-of-fluid simulations in microfluidic t-junction devices: Influence of viscosity ratio on droplet size. Physics of Fluids. 29, 032007(2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи