Методическая статья

Трансляция внеклеточной активности переноса электронов с помощью органических электрохимических транзисторов

DOI:

10.3791/67928

⸱

31 января 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1McKetta Department of Chemical Engineering, University of Texas at Austin, 2Department of Electrical and Computer Engineering, The University of Texas at Austin, 3Microelectronics Research Center, The University of Texas at Austin, 4Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 5Simpson Querrey Institute, Northwestern University, 6Department of Pharmaceutical Chemistry, University of California San Francisco, 7Department of Biology, Stanford University, 8Department of Chemistry, University of Texas at Austin

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной работе мы представляем протокол использования органических электрохимических транзисторов (ОЭКТ) для преобразования активности внеклеточного переноса электронов (ЭЭТ) в Shewanella oneidensis в электрические сигналы. Гибридная система OECT обеспечивает повышенную надежность, чувствительность и потенциал для быстрого тестирования с высокой пропускной способностью, что делает ее эффективным инструментом для измерений ЭЭТ.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внеклеточный перенос электронов (ЭЭТ) — это процесс, с помощью которого определенные микроорганизмы могут передавать электроны через свои клеточные мембраны внешним акцепторам электронов, связывая клеточный метаболизм с окружающей средой. В то время как Geobacter и Shewanella были основными моделями для исследований ЭЭТ, новые исследования показывают, что активные виды ЭЭТ также связаны с ферментацией и микробиомом кишечника человека. Используя способность ЭЭТ соединять биологические и электронные системы, мы представляем протокол использования органических электрохимических транзисторов (ОЭСТ) для преобразования микробной активности ЭЭТ в легко обнаруживаемые электрические сигналы. Эта система позволяет использовать клеточные реакции на внешние раздражители для биосенсорных и биокомпьютерных приложений. В частности, мы продемонстрировали делегирование канала поли(3,4-этилендиокситиофена) p-типа: поли(стиролсульфонат) (PEDOT: PSS) в OECT управляется клеточным EET от Shewanella oneidensis. Путем транскрипционного управления потоком ЭЭТ с помощью генетических цепей мы установили биосенсорную способность этой гибридной системы OECT обнаруживать химические стимулы, такие как молекулы индукторов. Кроме того, мы вводим в клетки основанные на плазмидах булевы логические вентили, позволяющие им обрабатывать сигналы окружающей среды и управлять текущими изменениями в OECT, что еще раз демонстрирует биовычислительный потенциал этих устройств. Этот метод обеспечивает новый интерфейс между биологическими системами и электроникой, что позволяет в будущем использовать высокопроизводительные приложения для скрининга, биосенсорного и биокомпьютерного анализа.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Устройства, которые могут преобразовывать и усиливать биологическую и химическую активность в электрические сигналы, имеют решающее значение в различных областях, таких как сенсорика1,2, нейроморфные вычисления 3,4 и носимаяэлектроника5. Среди них органические электрохимические транзисторы (OECT) стали исключительными интерфейсами между биологическими системами и электронными считывателями благодаря их совместимости с водными средами и низким рабочимнапряжением. ОЭКТ отличаются от обычной электроники тем, что в электролите используются ионы для модуляции проводимости органического канала, который соединяет ионный и электронный транспорт для достижения исключительной проводимости8. Эти характеристики делают OECT идеальными для сопряжения биологических систем с электроникой, поскольку они могут усиливать слабые биологические сигналы и переводить их в электрические показания.

OECT работают путем изменения легирующего состояния смешанного ионно-электронного проводящего канала посредством ионной диффузии, обычно контролируемой подачей напряжения на затворный электрод. Тем не менее, биологические или окислительно-восстановительные реакции также могут изменять проводимость канала, позволяя ОЭКТ реагировать на различные химические и биологические стимулы. Функционализация OECTs с помощью липидных бислоев, ионных каналов или биомолекул позволяет им обнаруживать специфические аналиты, что делает их полезными для сенсорных приложений 9,10. Например, ОЭКТ были интегрированы с окислительно-восстановительными ферментами, такими как глюкозооксидаза, для прямого переноса электронов в канал, регулируя его проводимость в ответ на концентрацию глюкозы11. Хотя такие конфигурации эффективны для биосенсоризации, их вычислительные мощности ограничены из-за относительно простого поведения отдельных ферментов или белков.

В противоположность этому, живые клетки, в частности бактерии, представляют собой универсальную платформу, способную выполнять сложные и надежные вычисления 4,12,13,14,15. Электроактивные бактерии, такие как Shewanella oneidensis и Geobacter sulfurreducens, обладают уникальной способностью переносить электроны через свои клеточные мембраны в процессе, известном как внеклеточный перенос электронов (EET). В анаэробных условиях эти бактерии связывают свои метаболические процессы с восстановлением или окислением внешних акцепторов электронов, включая металлы, оксиды металлов и синтетические материалы, такие как проводящие полимеры16 и наночастицы17. Эта способность была использована в микробных топливных элементах для производства электроэнергии и открывает потенциал для более совершенныхбиоэлектронных приложений. Кроме того, достижения в области синтетической биологии позволили проводить точные генетические манипуляции с электроактивными бактериями для контроля путей ЭЭТ. Разрабатывая генетические схемы, которые регулируют экспрессию генов, связанных с ЭЭТ, исследователи могут модулировать поток электронов в ответ на конкретные сигналы окружающей среды или вычислительные логические операции20,21. Этот генетический контроль над EET открывает возможности для создания биогибридных систем, в которых бактериальные вычисления напрямую взаимодействуют с электронными устройствами, такими как OECT. Например, бактериальные генетические цепи могут быть спроектированы таким образом, чтобы реагировать на комбинации химических входов, включая или выключая пути ЭЭТ и тем самым модулируя проводимость канала OECT. Это позволило бы проводить прямые электрические считывания бактериальных вычислений, минуя необходимость в флуоресцентных или других традиционных биологических репортерах.

Последние достижения продемонстрировали потенциал связывания OECTs с электроактивными бактериями. Например, Méhes et al. использовали S. oneidensis для мониторинга активности ЭЭТ в реальном времени с помощью OECT p-типа, иллюстрируя, как бактериальный метаболизм может быть отслежен электрически22. В то время как эта работа подчеркивает возможность использования OECTs для обнаружения бактериальной активности, потенциал гибридной системы для биосенсорики и биовычислений остается недостаточно изученным. Чтобы решить эту проблему, мы недавно разработали гибридные транзисторы, включающие генетически модифицированный S. oneidensis в OECTsp-типа 23. Результаты показали, что канал OECT может быть дедозирован за счет бактериальной активности ЭЭТ (рис. 1B). Чтобы еще больше расширить возможности биосенсорики и получить механистическое представление о процессе дедопинга, мы разработали штаммы S. oneidensis с генетическими цепями, которые регулируют поток EET. Это приводит к предсказуемым изменениям выходной продукции OECT в ответ на сигналы окружающей среды, такие как молекулы индукторов. Более того, интегрировав булеву логику в эти генетические схемы, мы сделали возможным прямое электрическое считывание сложных бактериальных вычислений.

В этой статье мы представляем комплексный протокол работы гибридного транзистора, охватывающий изготовление устройства, подготовку клеточной культуры, процедуры измерений и анализ данных. Кроме того, мы учитываем ключевые аспекты, такие как очистка устройства, возможность повторного использования и потенциал автоматизации при высокопроизводительном тестировании.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Все химикаты использовались в том виде, в котором они были получены, без дополнительной очистки. Если не указано, использовались химикаты аналитического класса.

1. Изготовление устройств OECT

ПРИМЕЧАНИЕ: OECT изготовлены на предметных стеклах кварцевого микроскопа с использованием стандартных методов микропроизводства, адаптированных из предыдущей работы24. Как показано на рисунке 2A, восемь устройств OECT расположены на одном стандартном предметном стекле. Предварительно нарезанные листы полидиметилсилоксана (PDMS) помещаются на предметное стекло для формирования камер OECT и отверстий доступа. Проводящий полимер p-типа поли(3,4-этилендиокситиофен): поли(стиролсульфонат) (PEDOT: PSS) используется для канала OECT и электрода затвора, с размерами 150 μм x 10 μм для канала и 500 μм x 500 μм для наконечника затвора ( Рисунок 2B). Краткое описание процесса изготовления канала OECT и сборки устройства представлено на рисунке 2C.

  1. Изготовление золотых электродов
    1. Очистите кварцевые стекла, промыв их ацетоном, изопропиловым спиртом (IPA) и деионизированной (DI) водой. Высушить феном с помощью газа N2 .
    2. Выполните плазменную очистку O2 с давлением 50 sccm при 150 Вт в течение 120 с.
    3. Фоторезист (PR) AZ5209e с 2 ступенями: первый при 500 об/мин, разгон 100 об/мин за 5 с, и второй при 2000 об/мин, разгон 1000 об/мин за 45 с.
    4. Выпекать при температуре 90 °C в течение 150 с.
    5. Включите выравниватель маски (Suss MA6) и выберите i-line (365 нм) в качестве источника УФ, установите параметры: время экспозиции 3,5 с (13 Вт), зазор юстировки 15 мкм, тип WEC Contact. и тип воздействия на Hard.
    6. Загрузите маску литографии и предметное стекло в выравниватель, выровняйте предметное стекло по маске, затем выполните первоначальную экспозицию.
    7. Выпекать в обратном направлении при 110 °C в течение 180 секунд.
    8. Снимите маску литографии и выполните флуд-экспонирование со следующими параметрами: время экспозиции 25 с (13 Вт), тип экспозиции как Flood E.
    9. Разработайте PR с помощью проявителя AZ 400K 1:4, предварительно разбавленного производителем. Налейте соответствующее количество проявителя в кристаллизующуюся чашку, чтобы погрузить горку, и постоянно встряхивайте чашку круговыми движениями в течение 45 с. Затем немедленно снимите предметное стекло и замочите его в деионизированной воде на 45 секунд, промойте деионизированной водой и высушите феном с помощью N2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь процесс можно приостановить.
    10. Переместите слайды в электронно-лучевой испаритель. Насос до 2,7 x 10-4 Па (2 x 10-6 Тл) или ниже.
    11. Нанесите слой клея Ti (10 нм) и Au (100 нм) последовательно. Скорость наплавки может варьироваться в зависимости от конкретного используемого испарителя. Для достижения хорошего баланса между качеством наплавки и временем обработки рекомендуется использовать скорость наплавки 0,1 нм/с.
    12. Удалите излишки металла, замочив предметные стекла в ацетоне на ночь. После замачивания используйте пипетку, чтобы струи ацетона струились на поверхности предметного стекла, чтобы удалить остатки металла. Квартационные слайды, полученные после выполнения вышеуказанных этапов, называются электродными слайдами OECT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы используйте ультразвуковую терапию для удаления излишков металла.
  2. PEDOT: Изготовление каналов PSS
    1. Очистите предметные стекла электродов OECT, промыв их ацетоном, изопропиловым спиртом и деионизированной водой. Высушить феном с помощью газа N2 .
    2. Выпекайте предметные стекла не менее 5 минут при температуре 160 °C. Дайте предметным стеклам остыть перед нанесением отжима.
    3. Прядильное покрытие AZ5209e PR с 2 ступенями: сначала при 500 об/мин, 100 об/с разгон за 5 с, затем 2000 об/мин, разгон 1000 об/мин за 45 с.
    4. Выпекать при температуре 90 °C в течение 150 с.
    5. Начните первичную экспозицию с i-line в режиме жесткого контакта в течение 3,5 с при мощности 13 Вт.
    6. Выпекать в обратном направлении при 110 °C в течение 180 с.
    7. Выполняйте воздействие затопления в течение 25 с при 13 Вт.
    8. Проявите проявителем AZ 400K 1:4 в течение 45 с с постоянным круговым встряхиванием тарелки. Затем замочите слайды в деионизированной воде на 45 секунд, промойте деионизированной водой и высушите феном с помощью N2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь процесс можно приостановить.
    9. Ультразвуковая обработка PEDOT: диспергирование ПСС в течение 5 минут путем всплытия флакона на водяной бане, заполненной до линии заполнения ультразвукового аппарата. Отфильтруйте дисперсию PEDOT: PSS с помощью фильтра 0,22 мкм для удаления комков.
    10. Прядильное покрытие PEDOT: PSS при 3500 об/мин с ускорением при 3500 об/мин в течение 60 с. Сушите при температуре 90 °C в течение 15 минут.
    11. Удалите излишки пленки PEDOT:PSS, замочив предметные стекла в ацетоне на 12 минут, а затем проведите ультразвуковую обработку в течение 1 минуты.
    12. Промойте слайды ацетоном, а затем IPA и высушите феном с N2.
    13. Проведите обработку этиленгликолем (EG), поместив предметные стекла на горячую плиту при температуре 90 °C, затем опустите EG, достаточное для покрытия всех PEDOT: PSS, на 5 минут. Промойте деионизированной водой и высушите феном с помощью N2. Квартовые слайды, полученные после выполнения вышеуказанных шагов, называются слайдами OECT.
  3. Изготовление камеры для устройств PDMS
    1. Сделайте листы PDMS, смешав основу и отвердитель в соотношении 10:1. Отлить раствор в форму до толщины 3 мм и дегазировать в течение 1 часа в камере дегазации с 2 четвертью, подключенной к вакуумному насосу.
    2. Отверждите смесь, поместив форму на выровненный стол на 48 часов при комнатной температуре, чтобы получить гладкие поверхности PDMS. Накройте форму крышкой, чтобы избежать загрязнения мусором, переносимым по воздуху.
    3. Вырежьте PDMS с помощью бритвенных лезвий и создайте камеры устройства и отверстия для обмена жидкости с круглыми отверстиями диаметром 5 мм и 1,5 мм соответственно. Убедитесь, что высота PDMS составляет 3 мм, как контролируется во время литья в форму (шаг 1.3.1)

2. Подготовка СМИ

  1. Автоклав на 500 мл сверхчистой воды, четыре дозирующие иглы из нержавеющей стали, две резиновые колбы (для колб с круглым дном объемом 250 мл), две колбы с круглым дном объемом 250 мл и одна стеклянная бутылка для фильтрующего материала объемом 500 мл. Храните стерильную сверхчистую воду при температуре 4 °C для использования в будущем.
  2. Приготовьте 2x базальную среду Shewanella (SBM) с добавлением 2x Wolfe's Trace Mineral Mix 0,1% казаминокислот в соответствии с Таблицей 1. Фильтр стерилизует среду на дно стерильного стеклянного фильтра (получено в Шаге 2.1) с помощью фильтра на крышке бутылки. Эта среда обозначается как 2x SBM++, где каждый + указывает на добавление смеси микроэлементов и казаминокислот. Хранить при температуре 4 °C для дальнейшего использования.
  3. Фильтруйте стерильно (фильтр 0,22 мкм) каждое из следующих химических веществ отдельно: 50 мл 1 М фумарата натрия в стерильную центрифужную пробирку объемом 50 мл; 1 мл 2,5 мг/мл канамицина (KAN), называемого 100x KAN, в стерильную микроцентрифужную пробирку. Поместите 1 мл 60% мас.% стерильного лактата натрия (используемого в полученном виде) в микроцентрифужную пробирку. Хранить все приготовленные растворы при температуре 4 °С.
  4. Отдельно приготовьте 1 мл следующих химических веществ в стерильных микроцентрифужных пробирках: 100 мМ изопропил ß-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ), обозначаемый как 100х ИПТГ; 10 мМ 3-оксогексаноил-гомосериновый лактон (OC6), обозначаемый как 100x OC6; 1 мМ ангидротетрациклина гидрохлорида (aTc), обозначается как 100x aTc. Хранить при температуре 4 °C для дальнейшего использования.
  5. С помощью стерилизованных колб, резиновых колпачков и игл, подготовленных на шаге 2.1, продуйте средний запас. Распределите по 200 мл стерильной 2X SBM++ и сверхчистой воды в отдельные колбы по 250 мл с круглым дном. Запечатайте колбы резиновыми колпачками и вставьте стерильные дозирующие иглы, чтобы создать установку для промывки газа (игла для входа воздуха погружена в жидкость; игла для выхода газа находится над поверхностью жидкости). Продувка N2 в течение 15 мин.
  6. Переложите продутые 2x SBM++ и сверхчистую воду, лактат, 1 М фумарата натрия, 100x KAN, 100x IPTG, 100x OC6 и 100x aTc в перчаточный ящик для дальнейшего использования с OECT.

3. Мониторинг сотовой ЭЭТ с помощью устройств OECT

ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения анаэробики эксперимент OECT проводится в перчаточном ящике без контроля влажности при комнатной температуре.

  1. День 1
    1. Стерилизация и подготовка аппарата
      1. Автоклавирование предметных стекол OECT, листов PDMS и электрода сравнения (RE) Ag/AgCl в отдельных контейнерах. Высушите путем запекания при 80 °C. Положите в перчаточный ящик предметные стекла из автоклавного материала OECT и Ag/AgCl RE.
      2. Десорбировал захваченный кислород в листах PDMS, подвергая его воздействию вакуума в прихожей перчаточного ящика в течение 4 часов. Соберите устройство OECT, поместив листы PDMS поверх слайдов OECT в перчаточном ящике.
      3. Введите 45 μL соответствующей среды SBM в каждую камеру OECT. Для большинства экспериментов используйте 1x SBM++ с добавлением 20 мМ лактата. Например, приготовьте 1 мл 1x SBM++, смешав 500 мкл 2x SBM++, 497 мкл стерильной сверхчистой воды и 2,85 мкл 60% мас.% лактата натрия.
      4. Накройте отверстия камеры OECT листами PDMS, чтобы избежать испарения среды и загрязнения.
      5. Контролируйте ток в канале OECT IDS при постоянном канальном напряжении VDS -0,05 В и напряжении затвора VGS 0,2 В до тех пор, пока ток не стабилизируется. Выбор напряжения может варьироваться в зависимости от устройства OECT или биологических образцов. Используйте одно и то же непрерывное напряжение смещения для затвора и канала на протяжении всего измерения. Стабилизация может занять от нескольких часов до нескольких дней, в зависимости от уровня вакуума и продолжительности десорбции в прихожей.
    2. Клеточные культуры
      1. Нанесите запасы клеток (хранящиеся при -80 °C) на агаровые планшеты, содержащие LB (для штаммов, не содержащих плазмиды) или LB с канамицином 25 мкг/мл (для штаммов, содержащих плазмиды) и вырастите их аэробно в течение ночи при 30 °C20,23.
  2. День 2
    1. Подготовка клеток (аэробные культуры)
      1. Случайным образом отбирайте одиночные колонии из агаровых планшетов LB (полученных на шаге 3.1.2.1) в 2 мл 1x SBM++ с добавлением 20 мл лактата в культуральных пробирках объемом 15 мл. Оставьте клетки на ночь при температуре 30 °C и встряхивании со скоростью 250 об/мин. Приготовьте 6 мл питательной среды без клеток в качестве абиотического контроля, которая будет использоваться в дальнейшем при промывке клеток.
    2. Клеточный препарат (анаэробная культура)
      1. Перенесите агаровые пластины LB с тестируемыми штаммами в перчаточный ящик.
      2. Случайным образом выберите отдельные колонии из агаровых планшетов LB в 1 мл соответствующего SBM с добавлением 20 мМ лактата и 40 мМ фумарата в пробирках с культуральными культурами объемом 15 мл. Например, приготовьте 1 мл среды для индуцируемого ИПТГ штамма, требующего 1 мМ ИПТГ и 25 мкг/мл KAN, смешав 500 мкл 2x SBM++, 437 мкл стерильной сверхчистой воды, 2,85 мкл 60% мас.% лактата натрия, 40 мМ 1 М фумарата натрия, 10 мкл 100 мМ ИПТГ и 10 мкл 2,5 мг/мл KAN.
      3. Выдерживать клетки при температуре 30 °C в течение 18 - 24 ч без встряхивания. Чтобы обеспечить сопоставимость между экспериментальными партиями, поддерживайте постоянное время роста.
  3. День 3
    1. Первичное электрохимическое измерение OECT
      ПРИМЕЧАНИЕ: Типы характеристик OECT варьируются от статических типов, таких как смещение постоянного напряжения, до динамических, таких как импульсы затвора. Здесь мы используем ступенчатое испытание напряжения затвора для получения как динамических, так и статических характеристик. Реконфигурация электрического соединения между OECT и прибором (в данном случае многоканальный потенциостат) осуществляется с помощью специализированных печатных плат ручного мультиплексирования (MUX). Автоматизированные платы мультиплексора могут быть разработаны для высокопроизводительных измерений.
      1. Измерьте ток в канале OECT IDS , соответствующий шагу напряжения затвора от 0 В до 0,2 В с настройками, описанными ниже (точные названия могут отличаться в зависимости от прибора).
      2. Канал прибора 1 измеряет ток IDS в канале OECT. Для этого установите Название техники: Быстрая амперометрия; Время балансировки: 1 с; Уравновешивающее напряжение: - 0,05 В; Напряжение смещения: -0,05 В; Время работы: 14 с; Интервал дискретизации: 0,5 мс.
      3. Канал прибора 2 управляет напряжением затвора OECT VGS. Для этого установите Имя техники: Смешанный режим; Время кондиции: 1 с; Напряжение состояния: 0 В; Режим Stage 1: Constant E; Напряжение смещения Stage 1: 0 В; Продолжительность 1 этапа: 4 с; Режим ступени 2: Постоянная E; Напряжение смещения Stage 2: 0.2 В; Продолжительность этапа 2: 10 с; Интервал дискретизации: 0,5 мс.
      4. Повторите ступенчатую проверку напряжения затвора (шаги с 3.3.1.1 по 3.3.1.3) для всех OECT. Этот шаг может быть автоматизирован для высокопроизводительного тестирования.
      5. Подайте постоянное напряжение канала VDS -0,05 В и напряжение затвора VGS 0,2 В на все OECT до модифицирования. Убедитесь, что напряжение смещения совпадает с напряжением, используемым при стабилизации устройства (шаг 3.1.1.5).
    2. Препарат посевного материала (аэробные культуры)
      1. Трижды промыть клетки центрифугированием при 1503 x g в течение 4 мин и суспендированием в 1 мл свежей среды, используемой для роста клеток (шаг 3.2.1.1). После последнего (3-го) спина ресуспендируйте клетки в 0,5 мл (или половине исходного объема культуры) для получения концентрированной клеточной суспензии с наружным диаметром600 от 1 - 3,5. Отрегулируйте итоговый объем суспензии соответствующим образом.
      2. Перенесите клеточную суспензию в бардачок.
      3. Чтобы получить инокулюм, разбавьте клетки до предполагаемого наружного диаметра600 , равного 0,1 (или в 10 раз большему наружному диаметруинокуляции 600). Бредовая среда имеет ту же структуру, что и среда для роста, но готовьте ее свежей в бардачке с помощью продуваемых медиа-акций. Например, если клетки были аэробно выращены в SBM++ с добавлением лактата, приготовьте свежий SBM++ с добавлением лактата в бардачке для разведения инокулюма.
      4. Остановите прием потенциостата. Введите 5 μL инокулюма в камеру OECT (содержащую 45 μL соответствующего SBM) для достижения конечного OD600 0,01 в OECT. Накройте отверстия камеры OECT листами PDMS, чтобы избежать испарения среды и загрязнения.
    3. Препарат посевного материала (анаэробные культуры)
      1. Для получения инокулюма клеточные культуры разбавляют в 10 раз. Используйте иллюзорную среду, которая имеет ту же конституцию, что и питательная среда, но не содержит фумарата. Например, если клетки были анаэробно выращены в SBM++ с добавлением лактата, фумарата, KAN и IPTG, приготовьте свежий SBM++ с добавлением лактата, KAN и IPTG в бардачке для разведения посева.
      2. Остановите прием потенциостата. Введите 5 μL инокулюма в камеру OECT (содержащую 45 μL соответствующего SBM). Накройте отверстия камеры OECT листами PDMS, чтобы избежать испарения среды и загрязнения.
    4. Непрерывное измерение и временные точки
      1. Подавайте постоянное напряжение смещения на каналы OECT (VDS = -0,05 В) и затвор (VGS = 0,2 В) на протяжении всего эксперимента, за исключением измерений во временных точках, когда потенциостат подключен к отдельным OECT для определения характеристик.
      2. Проводите эксперимент в течение 24 ч после прививки. Рассматривайте измерение перед инокуляцией (см. шаг 3.3.1) как временную точку 0 часов.
      3. Значительные изменения в состоянии легирования канала OECT обычно происходят в течение первых 8 часов. Выберите 5-7 временных точек для измерений в течение этого периода, затем одно измерение между 12 часами и 16 часами и конечная временная точка на отметке 24 часа. Примеры временных точек могут включать сразу после инокуляции и через 1 ч, 2 ч, 3 ч, 4,5 ч, 6 ч, 8 ч, 18 ч и 24 ч после инокуляции.
      4. Чтобы избежать ночных измерений, начинайте инокуляцию (см. шаг 3.3.2 или 3.3.3) рано утром, чтобы обеспечить частые измерения в течение первых 8 часов.
      5. Повторите шаг, описанный в пункте 3.3.1, для каждого измерения временной точки.
  4. День 4
    1. Измерение передаточной кривой в последней точке времени (24 ч)
      1. Вставьте Ag/AgCl RE в камеру OECT, осторожно поворачивая и проталкивая RE через отверстие для обмена жидкости.
      2. Измерьте передаточные кривые OECT путем развертки напряжения затвора в диапазоне от -0,1 В до 0,6 В, контролируя ток канала IDS с постоянным смещением VDS при -0,05 В. Измерьте точные потенциалы затвора и электрода источника в зависимости от Ag/AgCl RE.
      3. Настройте прибор так, как описано ниже (точные названия могут отличаться в зависимости от прибора).
      4. Канал прибора 1 измеряет ток канала OECT IDS, используйте следующую настройку: Название метода: Хроноамперометрия (CA), Время уравновешивания: 5 с, Напряжение уравновешивания: - 0,05 В, Напряжение смещения: -0,05 В, Время работы: 35 с, Интервал дискретизации: 0,09915 с.
      5. Канал прибора 2 управляет напряжением затвора OECT VGS, используйте следующую настройку: Название метода: Линейная развертка вольтамперометрии (LSV), Время уравновешивания: 5 с, Уравновешивающее напряжение: - 0.1 В, Начальное напряжение: -0.1 В, Конечное напряжение: 0.6 В, Шаг напряжения: 0.002 В, Скорость сканирования: 0.02 В/с.
      6. Канал прибора 3 измеряет потенциал источника OECTV S против Ag/AgCl RE, используйте следующую настройку: Название метода: Потенциометрия с разомкнутым контуром (OCP), Время работы: 40 с, Интервал выборки: 0,09915 с.
      7. Канал прибора 4 измеряет потенциал затвора OECTV G по отношению к Ag/AgCl RE, используйте следующую настройку: Название метода: Потенциометрия с разомкнутым контуром (OCP), Время выполнения: 40 с, Интервал выборки: 0,09915 с.
      8. Повторите измерение передаточной кривой для всех OECT. После каждого измерения промойте электрод сравнения Ag/AgCl 70% этанолом и протрите его новым полотенцем с низким ворсом. Ag/AgCl RE может быть повторно использован в пределах одной и той же выборочной группы для трипликатов, но не должен повторно использоваться между разными группами выборки.

4. Анализ данных

  1. Извлечение данных
    1. Используйте пользовательский код MATLAB для обработки данных, чтобы автоматизировать извлечение и регистрацию данных из собственного программного обеспечения прибора, что значительно сокращает время обработки. Скрипты MATLAB доступны в Техасском репозитории данных (https://doi.org/10.18738/T8/MNKO8D).
  2. Обработка данных
    1. Подгонка данных тока IDS в канале OECT для получения констант скорости k для дальнейшего анализа и сравнения (рис. 3). Для образцов клеток, совместимых с ЭЭТ, мы считаем, что лучше всего подходит одиночная экспоненциальная модель. Поэтому мы использовали однофазную модель экспоненциального распада в аналитическом программном обеспечении, чтобы подогнать данные временных рядов IDS и получить аппроксимированную константу скорости k. Эти данные временных рядов IDS могут быть исходными значениями или нормализованными до 0 часов, так как константа скорости k отражает скорость изменения, а не абсолютные значения.
    2. Получите нормализованное IDS путем деления значений IDS на значение временной точки 0 h (IDS0), обозначаемое как IDS/IDS0.
  3. Определение константы скорости k
    1. Откройте программное обеспечение для анализа (Prism 10, GraphPad) и создайте новый проект, нажав кнопку «Файл» > «Новый > новый файл проекта». На вкладке Создать выберите XY. В разделе «Параметры» установите X в положение «Числа» и Y в положение «Enter» и постройте одно значение Y для каждой точки.
    2. Импортируйте данные текущего IDS канала OECT в таблицу. Подогнайте данные IDS к однофазной модели экспоненциального распада, нажав кнопку "Анализ" на вкладке "Анализ". Найдите метод Нелинейная регрессия (аппроксимация кривой) в анализе XY. Убедитесь, что вы выбрали все наборы данных, которые необходимо подогнать, справа, затем нажмите OK.
    3. В новом окне «Параметры» выберите «Модель одного фазового распада » в группе «Экспоненциальный», затем нажмите кнопку «ОК». Уравнение модели выглядит следующим образом:
      Y=(Y0 - Плато)*e-k*X + Плато
      Где: Y — текущий IDS канала OECT, T — время, k — константа скорости.
    4. После получения k значений проверьте качество посадки, проверив значение R в квадрате для каждой посадки. Хорошая посадка должна иметь R2 выше 0,95.
  4. Непарный двухвостый t-критерий Стьюдента
    1. Чтобы оценить статистическую значимость между группами выборки, проведите непарный двусторонний t-критерий Стьюдента.
    2. Откройте программное обеспечение для анализа и создайте новый проект, нажав кнопку «Файл» > «Новый > новый файл проекта». На вкладке Создать выберите XY. В разделе Параметры установите для параметра X значение Numbers и Y для параметра Enter 3 для репликации значений в параллельных подстолбцах.
    3. Импортируйте в таблицу значения аппроксимированной константы скорости k. Выполните t-критерий, нажав кнопку «Анализ» на вкладке «Анализ». Метод t-критерия (и непараметрических тестов) можно найти в разделе Колоночный анализ. Обязательно выберите «Два набора данных каждый раз», затем нажмите «ОК».
    4. В руководстве по экспериментальному дизайну выберите Без пары, Да. Используйте параметрический тест и непарный t-критерий. Предположим, что обе популяции имеют одинаковые варианты SD. Для каждого сравнения будут сгенерированы p-значения. На рисунках p-значения представлены следующим образом: н.с.: p > 0,05 (не значимо), *: p ≤ 0,05, **: p ≤ 0,01, ***: p ≤ 0,001, ****: p ≤ 0,0001.
    5. Повторите шаги 4.4.3 -4.4.4 для всех соответствующих наборов данных.

5. Очистка устройства OECT и возможность повторного использования

  1. После эксперимента разберите прибор и прокипятите предметные стекла OECT в мыльной воде (1:10, мыло: вода DI) в течение 15 минут.
  2. Быстро переместите слайды в стакан с деионизионной водой комнатной температуры и подождите 5 минут, пока слайды остынут. Промойте слайды с помощью DI и высушите феном чистым воздухом.
  3. Измерьте сопротивление канала OECT с помощью мультиметра. Если сопротивление канала находится в пределах 400% от исходного значения, устройство может быть повторно использовано для эксперимента после стерилизации (Шаг 3.1.1). Предметные стекла OECT также могут быть очищены с помощью следующих этапов и подходят для изготовления каналов с использованием шага 1.2.
    ВНИМАНИЕ: Раствор пираньи обладает высокой коррозионной стойкостью и может выделять значительное количество тепла. Всегда используйте соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), включая перчатки, очки и лабораторный халат. Обращайтесь с особой осторожностью и соблюдайте рекомендации учреждения по технике безопасности.
  4. Приготовьте раствор пираньи в хорошо проветриваемом вытяжном шкафу. Осторожно и медленно добавьте 30% (по массе) перекиси водорода к 98% серной кислоте в соотношении 1:4, помешивая, осторожно наклоняя кристаллизующуюся форму вперед и назад.
  5. Поместите кристаллизующую чашку на горячую плиту, нагретую до 70 °C. С помощью пинцета доведите предметные стекла и погрузите их в раствор пираньи на 1 минуту.
  6. Осторожно переложите предметные стекла в стакан с деионизионной водой и дайте им постоять не менее 1 минуты. Тщательно промойте слайды деионизированной водой и высушите феном на воздухе.
  7. Утилизируйте раствор пираньи в соответствии с инструкциями по утилизации химических отходов учреждения. Нейтрализуйте раствор пираньи, медленно добавляя его в стакан, содержащий смесь льда и воды, примерно в 4 раза превышающую объем раствора. Постепенно добавляйте нейтрализующий агент (например, 10 М NaOH), контролируя pH с помощью тест-полосок до нейтрального состояния.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Подогнанная постоянная скорость k
Подогнанная константа скорости k тока IDS в канале OECT служит надежной метрикой для оценки активности ЭЭТ образца. В то время как постоянные напряжения смещения затвора будут влиять на константы скорости, мы выбираем напряжение 0,2 В, чтобы обеспечить положительное смещение, стимулирующее перенос электронов бактериями, избегая при этом быстрого делегирования при более высоких напряжениях затвора и обеспечивая и минимизируя ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сравнение электрохимических ячеек (ЭК)
Одним из основных преимуществ подгонки константы скорости от тока канала OECT является то, что она сводит к минимуму вариации устройства, фокусируясь на основной динамике изменений IDS , а не на исходном выходе. В сочетании с присущей OECT способностью усиления сигнала этот подход повышает надежность гибридных систем OECT по сравнению с традиционными электрохимическими ячейками (EC). Например, в конце каждого 24-часово...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Базовые плазмиды для схемы NAND были любезно предоставлены лабораторией Фойгта через Addgene (#49375, #49376, #49377). Это исследование было проведено при финансовой поддержке Фонда Уэлча (грант F-1929, B.K.K.), Национальных институтов здравоохранения под номером R35GM133640 (B.K.K.), от премии NSF CAREER (1944334, B.K.K.) и от Управления научных исследований ВВС под номером FA9550-20-1-0088 (B.K.K.). A.J.G. была поддержана в рамках стипендий Национального научного фонда для аспирантов (Program Award No. DGE-1610403). Авторы признают использование совместных исследовательских установок, частично поддерживаемых Техасским институтом материалов, Центром динамики и контроля материалов: NSF MRSEC (DMR-1720595) и Национальной скоординированной инфраструктурой нанотехнологий NSF (ECCS-1542159). Мы с благодарностью отмечаем использование оборудования в основной лаборатории микроскопии Института клеточной и молекулярной биологии Техасского университета в Остине.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
3-оксогексаноил-гомосерин лактон Сигма-Олдрич
ангидротетрациклина гидрохлорид VWR
казаминокислоты VWR
Оборудование
Этиленгликоль Сигма-Олдричбезводный 99,8%, 
Буферный раствор HEPES VWR1 М в воде, pH = 7,3
изопропил ß-D-1-тиогалактопиранизид Текнова
канамицина сульфат Growcells
II) сульфат гептагидрат VWR
PEDOT:PSS водная суспензия Heraeus Epurio LLCClevios PH1000
Фосфат калия двухосновный Сигма-Олдрич
Одноосновной фосфат калияСигма-Олдрич
Потенциостат PalmSens BVMultiPalmSens4
Кварцевые микроскопические слайды AdValue FQ-S-003
Кварцевые микроскопические слайды 
Хлорид натрия VWR
Sodium DL-лактат ТЦИ60% в воде
Фумарат натрия VWR98%
Серная кислота Sigma-Aldrich95,0%-98,0%
Двухкомпонентный силиконовый эластомер Электронная микроскопия НаукаSylgard184
Смесь микроэлементов Вульфа АТКС
Магний(

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Luo, Y. F., et al. Technology roadmap for flexible sensors. Acs Nano. 17 (6), 5211-5295 (2023).
  2. Din, M. O., Martin, A., Razinkov, I., Csicsery, N., Hasty, J. Interfacing gene circuits with microelectronics through engineered population dynamics. Sci Ad. 6 (21), eaaz8344(2020).
  3. Markovic, D., Mizrahi, A., Querlioz, D., Grollier, J. Physics for neuromorphic computing. Nat Rev Phys. 2 (9), 499-510 (2020).
  4. Daniel, R., Rubens, J. R., Sarpeshkar, R., Lu, T. K. Synthetic analog computation in living cells. Nature. 497 (7451), 619-623 (2013).
  5. Ates, H. C., et al. End-to-end design of wearable sensors. Nat Rev Mater. 7 (11), 887-907 (2022).
  6. Rivnay, J., et al. Organic electrochemical transistors. Nat Rev Mater. 3 (2), e17086(2018).
  7. Rashid, R. B., Ji, X. D., Rivnay, J. Organic electrochemical transistors in bioelectronic circuits. Biosens Bioelectron. 190, 113461(2021).
  8. Bernards, D. A., Malliaras, G. G. Steady-state and transient behavior of organic electrochemical transistors. Adv Funct Mater. 17 (17), 3538-3544 (2007).
  9. Lubrano, C., Matrone, G. M., Iaconis, G., Santoro, F. New frontiers for selective biosensing with biomembrane-based organic transistors. Acs Nano. 14 (10), 12271-12280 (2020).
  10. Guo, K., et al. Rapid single-molecule detection of COVID-19 and MERS antigens via nanobody-functionalized organic electrochemical transistors. Nat Biomed Eng. 5 (7), 666-677 (2021).
  11. Pappa, A. M., et al. Direct metabolite detection with an n-type accumulation mode organic electrochemical transistor. Sci Adv. 4 (6), eaat0911(2018).
  12. Siuti, P., Yazbek, J., Lu, T. K. Synthetic circuits integrating logic and memory in living cells. Nat Biotechnol. 31 (5), 448-452 (2013).
  13. Brophy, J. A. N., Voigt, C. A. Principles of genetic circuit design. Nat Meth. 11 (5), 508-520 (2014).
  14. Rubens, J. R., Selvaggio, G., Lu, T. K. Synthetic mixed-signal computation in living cells. Nat Comm. 7, 11658(2016).
  15. Rizik, L., Danial, L., Habib, M., Weiss, R., Daniel, R. Synthetic neuromorphic computing in living cells. Nat Comm. 13 (1), 5602(2022).
  16. Tseng, C. P., et al. Solution-deposited and patternable conductive polymer thin-film electrodes for icmrobial bioelectronics. Adv Mater. 34 (13), 2109442(2022).
  17. Dundas, C. M., Graham, A. J., Romanovicz, D. K., Keitz, B. K. Extracellular electron transfer by Shewanella oneidensis controls palladium nanoparticle phenotype. Acs Synth Biol. 7 (12), 2726-2736 (2018).
  18. Catania, C., Karbelkar, A. A., Furst, A. L. Engineering the interface between electroactive bacteria and electrodes. Joule. 5 (4), 743-747 (2021).
  19. Logan, B. E., Rossi, R., Ragab, A., Saikaly, P. E. Electroactive microorganisms in bioelectrochemical systems. Na Rev Microbiol. 17 (5), 307-319 (2019).
  20. Graham, A. J., et al. Transcriptional regulation of living materials via extracellular electron transfer. Nat Chem Biol. 20 (10), 1329-1340 (2024).
  21. Cao, Y. X., et al. A synthetic plasmid toolkit for Shewanella oneidensis MR-1. Front Microbiol. 10, 410(2019).
  22. Mehes, G., et al. Organic microbial electrochemical transistor monitoring extracellular electron transfer. Adv Sci. 7 (15), 2000641(2020).
  23. Gao, Y., et al. A hybrid transistor with transcriptionally controlled computation and plasticity. Nat Commun. 15 (1), 1598(2024).
  24. Yoo, B., Dodabalapur, A., Lee, D. C., Hanrath, T., Korgel, B. A. Germanium nanowire transistors with ethylene glycol treated poly(3,4-ethylenedioxythiophene): poly(styrene sulfonate) contacts. Appl Phys Lett. 90 (7), 072106(2007).
  25. Tahernia, M., et al. A 96-well high-throughput, rapid-screening platform of extracellular electron transfer in microbial fuel cells. Biosens Bioelectron. 162, 112259(2020).
  26. Ainla, A., et al. Open-source potentiostat for wireless electrochemical detection with smartphones. Anal Chem. 90 (10), 6240-6246 (2018).
  27. Rowe, A. A., et al. CheapStat: an open-source, "do-it-yourself" for analytical and educational applications. PLoS One. 6 (9), e23783(2011).
  28. Salyk, O., et al. Organic electrochemical transistor microplate for real-time cell culture monitoring. Appl Scil. 7 (10), 998(2017).
  29. Zhao, F. J., et al. Light-induced patterning of electroactive bacterial biofilms. Acs Synth Biol. 11 (7), 2327-2338 (2022).
  30. Tan, S. T. M., et al. Operation mechanism of organic electrochemical transistors as redox chemical transducers. J Mater Chem. 9 (36), 12148-12158 (2021).
  31. White, S. P., Dorfman, K. D., Frisbie, C. D. Operating and sensing mechanism of electrolyte-gated transistors with floating gates: Building a platform for amplified biodetection. J Phys Chem. 120 (1), 108-117 (2016).
  32. Huang, B., Gao, S., Xu, Z., He, H., Pan, X. The functional mechanisms and application of electron shuttles in extracellular electron transfer. Curr Microbiol. 75 (1), 99-106 (2018).
  33. Light, S. H., et al. A flavin-based extracellular electron transfer mechanism in diverse Gram-positive bacteria. Nature. 562 (7725), 140-144 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Shewanella Oneidensis

Похожие статьи