Методическая статья

Прогнозирование и валидация регуляции повреждения подоцитов и лечение диабетической болезни почек от Иньхо Тана

812 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67939

⸱

20 июня 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Nephropathy Department, the Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 2College of Integrated Chinese and Western Medicine, Changchun University of Chinese Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Используя сетевую фармакологию и экспериментальную валидацию, этот протокол раскрывает механизм действия Yinhuo Tang (YHT) в лечении диабетической болезни почек (DKD) и то, как YHT снижает повреждение подоцитов у мышей с DKD за счет ингибирования сигнального пути PI3K/AKT/NF-κB.

Аннотация

Диабетическая болезнь почек (ДБП) — это хроническое заболевание почек, характеризующееся массивной протеинурией и сниженной скоростью клубочковой фильтрации. Основным патологическим признаком ДБП является почечная микроангиопатия, и у ~40% пациентов с диабетом развивается ДБП. Ассоциированные с подоцитами белки CD2AP и WT-1 играют решающую роль в поддержании нормальной функции подоцитов и целостности клубочкового фильтрационного барьера. Когда структура или функция подоцитов нарушается из-за воспаления, окислительного стресса или других патологических повреждений, щелевая диафрагма и актиновый цитоскелет повреждаются, что приводит к увеличению проницаемости клубочкового фильтрационного барьера и приводит к протеинурии. Yinhuo Tang (YHT) — это рецепт традиционной китайской медицины, который имеет функцию уменьшения протеинурии и задержки ухудшения функции почек; однако механизм применения YHT при лечении ДБП не ясен. В данной работе, основываясь на сетевой фармакологии и экспериментах на животных, мы изучили уровень глюкозы в крови, функцию печени, функцию почек, липиды крови, почечную патологию, уровни экспрессии подоцитарных маркерных белков CD2AP и WT-1, а также сигнальный путь PI3K/AKT/NF-κB у мышей db/db после введения YHT в течение 8 недель. Наши результаты показывают, что YHT снижает уровни экспрессии воспалительных факторов за счет ингибирования сигнального пути PI3K/AKT/NF-κB, тем самым уменьшая повреждение подоцитов, которое играет роль в задержке прогрессирования ДБП.

Введение

Диабетическая болезнь почек (ДБП) является распространенным и серьезным осложнением диабета и остается основной причиной терминальной стадии почечной недостаточности во всем мире1. Заболевание прогрессирует в результате ряда сложных патологических процессов, таких как увеличение клубочков, мезангиальное расширение, тубулоинтерстициальный фиброз и чрезмерное накопление компонентов внеклеточного матрикса 2,3. Несмотря на улучшения в лечении диабета, современные методы лечения в основном направлены на контроль уровня глюкозы в крови и артериального давления, что только замедляет прогрессирование ДБП, а не обращает вспять лежащие в его основе патологические изменения. Это подчеркивает настоятельную потребность в более комплексных и эффективных вариантах лечения 4,5.

Традиционная китайская медицина (ТКМ) стала перспективной альтернативной терапией в лечении хронических заболеваний, таких как DKD 6,7,8. ТКМ делает акцент на целостном подходе к лечению, который может решить сложную, многоцелевую природу ДБК. Среди различных составов ТКМ было показано, что Yinhuo Tang (YHT) обладает множеством физиологических функций, таких как питание инь (для увеличения объема крови), тонизирование почек (для улучшения функции почек), очищение от тепла (для подавления воспаления) и подавление ян (для снижения кровяного давления)9,10,11. Тем не менее, всестороннее понимание механизмов, с помощью которых YHT смягчает DKD, все еще отсутствует.

Связанный с подоцитами белок CD2AP является ключевым белком в подоцитах, имеющим решающее значение для поддержания целостности фильтрационного барьера, в то время как WT-1 играет решающую роль в развитии почек и фиброзе 12,13,14,15,16. Таким образом, нормальная функция этих двух белков жизненно важна для нормальной функции клубочковой фильтрации. Существующая литература предполагает, что эти мишени участвуют в прогрессировании ДБЗ, и мы предполагаем, что активные компоненты YHT могут взаимодействовать с этими мишенями для оказания терапевтического эффекта. Данное исследование направлено на подтверждение этих взаимодействий и более глубокое понимание того, как YHT модулирует пути развития ДБП.

В этом исследовании мы используем комбинацию сетевой фармакологии и экспериментов на животных для изучения терапевтических механизмов YHT при ДБП. Сетевая фармакология, которая объединяет инструменты биоинформатики для анализа сложных взаимодействий между активными соединениями и биологическими мишенями, позволяет нам исследовать многомишенную, многоходовую природу действия YHT 17,18,19. Традиционные методы поиска лекарств часто делают акцент на вмешательствах с одной мишенью. В отличие от этого, сетевая фармакология служит прогностическим инструментом, который помогает идентифицировать потенциальные пути и молекулярные мишени, предлагая предварительное понимание возможных механизмов действия сложных методов лечения. Несмотря на то, что сетевая фармакология не заменяет строгих экспериментальных и регуляторных шагов, необходимых для разработки лекарств, она может направлять генерацию гипотез и оптимизировать исследования на ранних стадиях.

В конечном счете, это исследование направлено на преодоление разрыва между традиционной и современной медициной, предоставляя научные доказательства интеграции ТКМ в лечение ДБП. Результаты этого исследования могут помочь разработать более эффективные и безопасные стратегии лечения ДБП, предлагая альтернативу стандартному лечению, которое часто ограничено побочными эффектами. Прояснив молекулярные механизмы YHT и подтвердив его терапевтический потенциал, мы надеемся продемонстрировать широкую применимость ТКМ в лечении ДБП.

Протокол

В общей сложности тридцать самцов 6-недельных спонтанных мышей с диабетом II типа (C57BL/Ksj db/db) и шесть самцов контрольных мышей без диабета (db/m) с одинаковым генетическим фоном. Мыши были размещены в течение 2 недель в стерильной среде с SPF в Центре экспериментов на животных Чанчуньского университета традиционной китайской медицины (номер лицензии: SYXK (JI) 2023-0014). В этот период они обеспечивались регулярным поддерживающим питанием и стерильной водой. Уровень глюкозы в крови натощак измерялся у мышей db/db в начале и в конце 2-недельного периода, и только те, у кого результаты превышали 11,1 ммоль/л в обоих тестах, были включены в эксперимент. Исследование было одобрено Этическим комитетом Чанчуньского университета традиционной китайской медицины (идентификационный номер: 2024147).

1. Приготовление лекарственных препаратов

  1. Приготовление YHT (Таблица 1)
    1. Выберите Rehmannia glutinosa (30 г), Ophiopogon japonicus (10 г), Morindae Officinalis Radix (10 г), Poria cocos (15 г) и лимонник китайский (6 г) и промойте травы водой, чтобы удалить загрязнения и пыль с поверхности. Затем смешайте 71 г сырой травы с 710 мл дистиллированной воды и замочите в керамических горшочках на 60 минут
    2. После закипания при 100 °C снизьте температуру отвара до 80 °C на 60 мин, а затем отфильтруйте осадок через два слоя медицинской марли. Храните жидкость в холодильнике при температуре 4 °C.
    3. Добавьте к вышеуказанной муть 710 мл дистиллированной воды, и повторите замачивание с шага 1.1.1 и шага 1.1.2 один раз; хранить жидкость в холодильнике при температуре 4 °C.
    4. Смешайте две вышеуказанные лекарственные жидкости из этапов 1.1.2 и 1.1.3 и поместите их в лоток для материала вакуумного лиофилизатора. Запустите вакуумный насос для удаления воздуха из камеры сублимационной сушки, установите температуру -40 °C и поддерживайте ее в течение 6 ч для замораживания воды в растворе препарата в твердое состояние. Затем отрегулируйте температуру до -20 °C в течение 36 часов, чтобы сублимировать воду в виде кристаллов льда в газ. Наконец, установите температуру на 40 °C, поддерживайте ее в течение 24 часов, чтобы удалить остатки влаги из раствора препарата, выключите нагревательный и вакуумный насос и удалите лиофилизированный порошок (порошок YHT).
    5. Массу составляют 0,4615 г, 0,923 г и 1,846 г лиофилизированного порошка YHT, суспензию в 1 мл физиологического раствора и делают суспензию YHT в концентрациях 0,4615 г/мл, 0,923 г/мл и 1,846 г/мл соответственно.
  2. Приготовление валсартана
    1. Добавьте валсартан (10,29 мг) в 50 мл PEG300 и хорошо встряхните до полного растворения.
    2. Добавьте в раствор 50 мл физиологического раствора с шага 1.2.1 и хорошо встряхните до гомогенизации и получения раствора валсартана с концентрацией 10,29 мг/мл.

2. Медикаментозное лечение

Эксперимент был разделен на шесть групп: нормальная контрольная группа (CON), модельная группа (MOD), группа положительного контроля валсартана (POS), группа низких доз YHT (YH-L), группа средних доз YHT (YH-M) и группа высоких доз YHT (YH-H). Взрослому человеку необходимо 71 г YHT в день. Согласно формуле пересчета экспериментальной дозы препарата для мыши и человека, суточная доза для мыши составила ~9,23 г/кг:

Эквивалентная экспериментальная доза для мыши (г/кг) = доза для человека (г)/масса тела (70 кг) × 9,1

  1. Крепко возьмитесь за спину мышей недоминирующей рукой так, чтобы их головы, шеи и тело находились на прямой линии (чтобы избежать борьбы), и расположите иглу для зондирования объемом 1 мл под углом, аналогичным физиологическому искривлению пищевода мышей. Протолкните иглу через угол рта мышей, надавите на язык, прижмите к нёбу и осторожно протолкните внутрь в желудок.
  2. Медленно введите препарат указательным пальцем доминирующей руки и выведите иглу вертикально, чтобы завершить операцию зондажа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Доза препарата составляла 10 мл/кг в общей сложности 4 недели.
    1. Вводите 10 мл∙кг-1∙день-1 физиологический раствор через зонд мышам CON и MOD.
    2. Вводите суспензию валсартана в дозе 10,29 мг∙кг-1∙день-1 через зонд мышам группы POS.
    3. В этих группах вводят следующие дозы YHT через зонд: 4,615 г∙кг-1∙сут-1 в группу YH-L; 9,23 г∙кг-1∙сут-1 в группу YH-M; 18,46 г∙кг-1∙сут-1 в группу YH-H.

3. Оценка эффективности YHT

  1. Определение биохимических показателей крови и мочи
    1. После 8 недель непрерывного приема препарата соберите 24 ч мочи у мышей с помощью метаболической клетки, центрифугируйте собранную мочу в дозе 7992 × г в течение 10 минут, удалите надосадочную жидкость и измерьте уровень белка в моче с помощью набора для тестирования белка в моче.
    2. Возьмитесь за заднюю часть мыши недоминирующей рукой, чтобы зафиксировать мышь, и используйте мизинец и безымянный палец той же недоминирующей руки, чтобы зафиксировать хвост мыши. Простерилизуйте кончик хвоста мыши ватными шариками на парах йода. Доминирующей рукой возьмите иглу для сбора крови, чтобы быстро проколоть кончик хвоста мыши, сожмите от корня хвоста мыши до кончика хвоста и капните кровь на бумагу для анализа уровня глюкозы в крови.
    3. Используя недоминирующую руку, возьмитесь за хвост мыши, одновременно фиксируя лопаточную область большим и указательным пальцами, следя за тем, чтобы брюшко мыши было обращено вверх. Доминирующей рукой держите шприц объемом 1 мл, наполненный фенобарбиталом натрия. Введите иглу (глубиной 3-5 мм) в брюшную полость под углом 30-45°, нацеливаясь на область между пупком и задними конечностями, при этом игла направлена к голове. Медленно извлеките поршень шприца, чтобы проверить наличие крови; Если кровь аспирирована, измените положение иглы соответствующим образом.
    4. Медленно вводите раствор пентобарбитала натрия, чтобы обеспечить равномерное введение, и извлеките шприц после завершения инъекции. Подождите 10 минут, затем с помощью щипцов в доминирующей руке аккуратно ущипните пальцы задних конечностей мыши, чтобы проверить реакцию. Если реакция по-прежнему наблюдается, при необходимости введите небольшую дополнительную дозу (10 мг/кг).
      Примечание: Предполагая, что мышь весит 60 г и раствор фенобарбитала составляет 1% по массе, 0,06 мл является дополнительной дозой, которую следует ввести в случае любой реакции.
    5. С помощью ножниц подстригайте усы и волосы вокруг глаз мышей, используя недоминирующую руку, чтобы надавить на кожу вокруг глаз, из которых должны быть удалены глазные яблоки, чтобы глазные яблоки выступали. Простерилизовать кожу вокруг глазных яблок этанолом, с помощью пинцета быстро извлечь глазные яблоки, чтобы кровь капала в микроцентрифужные пробирки (1,5-2 мл), инкубировать пробирки при комнатной температуре в течение 10 мин, центрифугировать пробирки в течение 10 мин при концентрации 7,992 × г и извлечь надосадочный раствор.
    6. Измерьте уровни экспрессии креатинина сыворотки крови (Scr), азота мочевины крови (BUN), альбумина (ALB), аланинаминотрансферазы (ALT), аспартатаминотрансферазы (AST), триглицеридов (TG) и общего холестерина (TC) в сыворотке крови в соответствии с инструкциями набора.
  2. Разделение почечных тканей
    1. После забора крови зафиксировать мышей на операционной пластине в положении лежа на спине, подстричь шерсть переднего грудного отдела мышей, простерилизовать передний грудной отдел с помощью этанола, разрезать ножницами кожу живота, отодвинуть в сторону тонкий и толстый кишечник, чтобы обнажить почки.
    2. Удалите ткань почки мыши, с помощью гемостатических щипцов резко отделите надкостницу и поместите левую почку в морозильную камеру при температуре -80 °C для хранения, а правую почку в пробирку объемом 20 мл, содержащую 4% раствор параформальдегида, для фиксации почки.
    3. Удалите правые почки из формальдегида через 24 часа, кратковременно промойте дистиллированной водой в течение 5 минут, обезвожьте с помощью градиента безводного этанола (100% → 95% → 85% → 75%, по 5 минут каждая), прозрачите с помощью градиентного ксилола (2 x 10 минут), погрузите в парафин и дайте восковым блокам застыть при комнатной температуре21. Затем поставьте его в морозильную камеру при температуре -20 °C на ночь.
    4. Снимите восковой блок, нарежьте его толщиной 3 мкм, поместите в воду, чтобы развернуть, затем выловите его с помощью предметного стекла и поместите в духовку постоянной температуры при температуре 40 °C для запекания в течение 30 минут, а затем храните для последующего анализа
  3. Почечный гистопатологический анализ
    1. Удалите правую почку, выполните градиентную депарафинизацию ксилола и обезвоживание безводного этанола, как указано выше (шаг 3.2.3), и промойте дистиллированной водой.
    2. Выполняйте окрашивание в соответствии с инструкциями Гематоксилина и Эозина (H&E), Периодического кислотного окрашивания по Шиффу (PAS) и наборов для окрашивания Массона.
    3. Снова выполните градиентное обезвоживание безводного этанола и прозрачность ксилола, как в шаге 3.2.3.
    4. После высыхания при комнатной температуре закрепите участки ткани на предметных стеклах с помощью защитного стекла, используя нейтральную камедь в качестве монтажной среды. Наблюдайте за предметными стеклами и визуализируйте их под световым микроскопом с 400-кратным увеличением.
  4. Иммуногистохимический анализ почечной ткани
    1. Удалите правую почку, удалите парафин и обезвожьте участки, как описано в шаге 3.2.3, поместите их в буферный раствор цитрата натрия 10 мМ (pH 6,0) и нагрейте (125 °C, 103 кПа) в течение 5 минут для восстановления антигена. Через 10 минут снимите пряди, остудите до комнатной температуры и вымойте их 3 x 5 минут в 1x PBS.
    2. Поместите секции в 3% раствор перекиси водорода на 10 минут для блокировки эндогенной пероксидазы и промойте 3 x 5 минут в PBS.
    3. Добавьте 10% козьей сыворотки по каплям на секции, следя за тем, чтобы козья сыворотка равномерно покрывала весь участок. Поместите секции во влажную камеру, выдерживайте при температуре 37 °C в течение 30 минут и промойте 3 x 5 минут PBS.
    4. Добавьте первичные антитела COI-I (1:200), α-SMA (1:200), WT-1 (1:200), CD2AP (1:200) по каплям (см. Таблицу материалов) и инкубируйте во влажной коробке при 4 °C в холодильнике на ночь.
    5. Снимите срез, промойте PBS 3 x 5 минут, добавьте вторичные антитела (1:3 000) по каплям, инкубируйте при 37 °C в течение 60 минут и промойте PBS в течение 3 x 5 минут.
    6. Добавить 3,3'-раствор для проявления цвета диаминобензидина (DAB) в течение 10 мин, смыть раствор для проявления цвета дистиллированной водой, инкубировать со 100 мкл гематоксилина в течение 5 мин при комнатной температуре и промыть дистиллированной водой в течение 5 мин.
    7. Обезвоживайте, прозрачьте и герметизируйте, как описано в шаге 3.2.3, и соберите изображения с помощью оптического микроскопа.
  5. Количественный анализ полимеразной цепной реакции в реальном времени (qRT-PCR)
    1. Возьмите ~100 мг замороженной почечной ткани в пробирку-гомогенизатор объемом 10 мл, тщательно измельчите ее пестиком до тех пор, пока не останется явной тканевой массы, а затем добавьте 1 мл реагента для экстракции РНК для гомогенизации.
    2. Добавьте 250 мкл хлороформа, встряхните в вихревом миксере в течение 10 с, инкубируйте его на льду в течение 5 минут, центрифугируйте при 15 984 × г в течение 10 минут при 4 °C и выведите верхнюю водную фазу пипеткой в новую пробирку.
    3. Добавьте 500 μL изопропанола в водную фазу, тщательно перемешайте с помощью вихревого миксера в течение 10 секунд и инкубируйте смесь на льду в течение 5 минут. После этого центрифугируйте при 15 984 × г в течение 10 минут. Осторожно удалите надосадочную жидкость и промойте гранулу РНК 1 мл 75% этанола. После краткого перемешивания снова центрифугируйте при 15 984 × g в течение 10 минут. Выбросьте этанол и дайте грануле РНК высохнуть на воздухе при комнатной температуре.
    4. Добавьте 30 μл воды из диэтилпирокарбоната, чтобы растворить РНК, и измерьте поглощение раствора РНК при 260 нм и 280 нм с помощью спектрофотометра для расчета концентрации РНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чистота РНК оценивается по соотношению A260/A280 . Идеальное соотношение A260/A280 должно быть в диапазоне от 1,8 до 2,0, что указывает на хорошую чистоту РНК. Если соотношение ниже 1,8, это может указывать на наличие белкового или фенольного загрязнения, и требуется дополнительная очистка, такая как проведение дополнительной фенол-хлороформной экстракции или осаждение этанола для удаления загрязняющих веществ.
    5. Смешайте 3 г общей РНК, 4 мкл 4 г смеси Wiper Wiper 4 г и не содержащий РНКазы ddH2O до конечного объема 16 μл, центрифугируйте при 1 250 × г в течение 10 с и инкубируйте при 42 °C в течение 2 минут. Добавьте 4 мкл 5-кратной обратной транскриптазы к 16 мкл вышеуказанного раствора, центрифугируйте при 1250 × г в течение 10 с. Выполните программу обратной транскрипции при температурах 50 °C (15 мин) → 85 °C (5 с) → 4 °C (10 мин). Храните синтезированную кДНК при температуре -20 °C.
    6. Извлеките раствор кДНК из морозильной камеры и проведите предварительную денатурацию при 90 °C (10 мин), затем 40 циклов при 94 °C (30 с) → 60 °C (30 с) → 72 °C (24 с) и, наконец, лизиз порядка 95 °C (15 с) → 60 °C (60 с) → 95 °C (350 с, 60 °C постепенно увеличивайте до 95 °C со скоростью 0,1 °C/с).
    7. Рассчитайте относительную экспрессию WT-1, CD2AP, PI3K, AKT, NF-κB и IL-1β методом 2-ΔΔCt на основе значения Ct каждого образца с Gapdh в качестве внутреннего референса (ΔΔCt = значение Ct гена-мишени - значение Ct внутреннего референсного гена) (см. таблицу 2).
  6. Анализ вестерн-блоттинга (WB)
    1. Возьмите ~100 мг замороженной почечной ткани в пробирке-гомогенизаторе объемом 10 мл, затем 500 мкл раствора лизиса (ингибитор протеазы: ингибитор фосфатазы: RIPA= 1:1:100) и измельчите пестиком до тех пор, пока не останется явной массы ткани.
    2. Инкубируйте пробирку на льду в течение 30 минут, центрифугируйте при 15 984 × г в течение 10 минут и аспирируйте надосадочную жидкость.
    3. Определите концентрацию белка в каждом образце с помощью анализа BCA. Основываясь на измеренных концентрациях, пипетка помещает равное количество общего белка (например, 30 мкг) из каждой группы в новые пробирки и регулирует окончательный объем с помощью PBS для обеспечения консистенции. Затем добавьте 5-кратный буфер для загрузки белка, варите при 100 °C в течение 10 минут, а затем снимите и охладите до комнатной температуры.
    4. Используйте 12,5% гель-электрофорез SDS-PAGE для разделения белков. Сначала используйте 80 В, чтобы образец медленно проходил через концентрационный гель, затем отрегулируйте напряжение до 120 В, пока образец не дойдет до дна разделительного геля, и выключите устройство.
    5. Смочите фильтровальную бумагу в мембранном буфере для переноса, с помощью пинцета удерживайте угол мембраны из ПВДФ и погрузите ее в метанол для ее активации. Удалите гель, с помощью пластиковой пластины отрежьте концентрированный гель и дно разделительного геля, а затем, в соответствии со структурой сэндвича фильтровальной бумаги/геля/мембраны из ПВДФ/фильтровальной бумаги для установки устройства для переноса мембраны (гель в качестве отрицательного полюса, мембрана из ПВДФ в качестве положительного полюса), поместите установку в резервуар для переноса мембраны, заполненный предварительно охлажденным буфером для переноса. окружите его кубиками льда для поддержания низкой температуры, и выполняйте передачу при постоянном токе 200 мА.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Определите время переноса в соответствии с молекулярной массой белка (чем больше молекулярная масса, тем дольше время переноса).
    6. Поместите мембрану PVDF в блокирующий буфер, встряхните блокирующий буфер в течение 90 минут при комнатной температуре и промойте TBST (50 мл 20x TBS и 0,5 мл Tween-20 на л TBST) в течение 3 x 5 минут.
    7. Используя разбавляющее первичное антитело разбавленным первичным антителом: WT-1 (1:1,000), CD2AP (1:1,000), P-PI3K (1:1,000), P-AKT (1:1,000), P-NF-κB (1:1,000) и IL-1β (1:1,000), добавьте первичное антитело на мембрану PVDF и инкубируйте во влажном боксе в холодильнике при температуре 4°C в течение ночи (см. Таблицу материалов).
    8. Снимите мембрану PVDF с холодильника при температуре 4 °C, промойте TBST в течение 3 x 5 минут, Используя разбавитель вторичного антитела (1:10000), добавьте вторичное антитело, инкубируйте при комнатной температуре в течение 60 минут, промойте TBST в течение 3 x 5 минут, поместите мембрану PVDF в хемилюминесцентный тепловизор и равномерно добавьте люминесцентную жидкость ECL по каплям (A: B = 1:1).

4. Сетевой фармакологический анализ YHT для лечения ДБП

  1. Скрининг активных ингредиентов и мишеней YHT
    1. Определите активные ингредиенты Radix Rehmanniae Praeparata, Morindae Officinalis Radix, Poria и Schisandra Chinensis с использованием базы данных TCMSP (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) и Maitake из базы данных BATMAN-TCM (http://bionet.ncpsb.org/batmantcm). Установите пероральную биодоступность (OB) ≥ 30% и лекарственную схожесть (DL) ≥ 0,18 в качестве критериев скрининга для идентификации активных ингредиентов.
    2. Выполните поиск в базе данных TCMSP (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) для определения мишеней действия активных ингредиентов из вышеуказанных ТКМ.
    3. Уменьшите акцент на целевых показателях вышеуказанных активных ингредиентов и объедините их в список для дальнейшего анализа. Стандартизируйте названия мишеней с помощью базы данных белков Uniprot (https://www.uniprot.org).
  2. Построение целевой сети активных ингредиентов YHT
    1. Импортируйте активные ингредиенты и соответствующие им мишени в theoftware: Создайте сеть «активный ингредиент-мишень», выбрав Файл | Импорт | Сеть и загрузка соответствующих данных.
    2. Выполнение анализа топологии сети в разделе Инструменты | Сетевой анализ | Анализируйте сеть для визуализации взаимосвязей между лекарствами, активными ингредиентами, мишенями и болезнями. В визуализации сети узлы представляют активные ингредиенты, а края представляют взаимодействия между активными ингредиентами и мишенями.
  3. Скрининг целей, связанных с ДКД
    1. Используя диабетическую болезнь почек в качестве поискового термина и установив вид как человек, отфильтруйте цели, связанные с ДБЗ, из следующих баз данных: база данных GeneCards (https://www.genecards.org); база данных OMIM (http://www.omim.org); База данных TTD (https://www.ttd.cn); База данных DrugBank (http://www.drugbank.ca); База данных DisGeNET (http://www.disgenet.org).
    2. После получения результатов из пяти баз данных объедините их в электронную таблицу и удалите дубликаты с помощью функции «Удалить дубликаты » в меню « Данные », гарантируя, что сохраняются только уникальные имена целей, связанных с DKD.
  4. Построение ИПП (белок-белковое взаимодействие) и скрининг основных мишеней
    1. Используйте программное обеспечение для работы с электронными таблицами для определения целей пересечения YHT и DKD, вводя список целей YHT в один столбец и список целей DKD в другой. Примените условное форматирование, чтобы выделить общие записи в обоих столбцах, тем самым определив цели пересечения.
    2. Откройте веб-сайт базы строк (https://cn.string-db.org/), выберите Ввод | Вставьте или загрузите для пакетного импорта данных и установите пороговое значение Степень ≥ 1 , чтобы отфильтровать свободные цели (цели без взаимодействий) в сети.
    3. Выбрать файл | Импорт | Сеть и импортируйте отфильтрованные цели пересечения в программное обеспечение для создания окончательной визуализации.
    4. Перейти к Сетевой анализ | Анализируйте сеть и отфильтровывайте основные цели YHT-DKD на основе значения градуса.
  5. Функциональный анализ онтологии генов (GO) и анализ обогащения путей Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG)
    1. Откройте платформу Metascape, посетив http://metascape.org/gp/index.html, выберите «Начать анализ», вставьте список целей для YHT и DKD в поле ввода в разделе «Пользовательский анализ», установите вид на Homo sapiens из выпадающего меню, выберите «Пользовательский анализ» и установите пороговое значение P-значения на <0,01, а затем нажмите «Отправить», чтобы запустить анализ.
    2. После того, как результаты будут возвращены из Metascape, перейдите в http://www.bioinformatics.com.cn/, выберите Инструменты | обогащение термина GO, вставьте термины GO из результатов и нажмите Отправить , чтобы создать пузырьковые диаграммы. Визуализируйте 10 основных терминов GO, отсортировав их по P-значению.
    3. Отсортируйте пути KEGG на основе P-значения из результатов анализа Metascape. Перейдите на тот же веб-сайт Microbiology (http://www.bioinformatics.com.cn/), выберите go kegg pathway enrichment, вставьте выбранные 10 основных путей KEGG и нажмите «Отправить », чтобы визуализировать пузырьковые диаграммы KEGG.

5. Статистический анализ

  1. Если данные имеют нормальное распределение, а дисперсии однородны, используйте однофакторный ANOVA. Если дисперсии неоднородны, используйте Т3-критерий Даннетта или независимый выборочный t-критерий.
  2. Для данных, которые не следуют нормальному распределению, используйте тест ранговой суммы из непараметрических методов.
  3. Считаем P < 0,05 статистически значимым.

Результаты

Улучшение уровня глюкозы в крови, функции печени и почек, а также нарушения липидного обмена у мышей с ДБП
После 8 недель приема различные дозы YHT значительно снижали уровни случайного уровня глюкозы в крови, 24 ч UTP, Scr и BUN, улучшали функцию почек (рис. 1A-D); повысил уровень ALB; снижение уровня АЛТ и АСТ; улучшение функции печени (рисунок 1E-G); снижение уровня ТС и ТГ; и улучшилась регуляция липидного обмена (рис. 1H,I). Вышеуказанные результаты показали, что YHT оказывает защитное действие на уровень глюкозы в крови, функцию печени и почек, а также регуляцию липидов.

Улучшение гистопатологического повреждения почек у мышей с ДБП
Чтобы проверить, может ли YHT улучшить повреждение почек у мышей с ДБК, степень патологического повреждения почечных тканей была изучена с помощью окрашивания H&E, PAS и Masson, а также ИГХ. Окрашивание H&E и PAS выявило клубочковую атрофию, расширение области белочной оболочки, отек и отслоение эпителиальных клеток канальцев, интерстициальную инфильтрацию воспалительных клеток и очевидное отложение клубочкового гликогена в группе MOD (рис. 2A, B). Окрашивание Массона показало значительное увеличение синих коллагеновых волокон в почках группы MOD по сравнению с группой CON (рис. 2C,D). ИГХ показала, что процент областей, положительных на COI-I и α-SMA, был значительно выше в группе MOD, чем в группе CON (рисунок 2E-G). Напротив, после применения YHT и POS значительно уменьшились клубочковая атрофия, расширение привязанной зоны, отек и отслаивание эпителиальных клеток канальцев, степень интерстициальной инфильтрации воспалительных клеток и отложение клубочкового гликогена; значительно уменьшилась площадь синих коллагеновых волокон; и процент областей, положительных на COI-I и α-SMA, значительно снизился. Вышеуказанные результаты показали, что YHT может ослаблять патологическое повреждение почек и фиброз почек у мышей с ДБЗ.

Ослабление повреждения подоцитов у мышей с ДБЗ
Повреждение клеток стопы у мышей с ДБП наблюдалось с помощью ИГХ, ПЦР и ВБ. Результаты ИГХ показали, что уровни экспрессии белков-маркеров функциональных клеток стопы, CD2AP и WT-1, были значительно снижены в группе MOD по сравнению с группой CON, что указывает на повреждение почечных клеток стопы. Лечение YHT увеличило уровни экспрессии CD2AP и WT-1 и уменьшило повреждение клеток стопы (рис. 3A-C). Результаты ПЦР и WB показали, что относительные уровни экспрессии мРНК и белков функциональных маркеров клеток стопы, CD2AP и WT-1, были значительно снижены в группе MOD по сравнению с группой CON, а относительные уровни экспрессии мРНК и белков CD2AP и WT-1 были значительно повышены после лечения YHT (рисунок 3D-H). Вышеуказанные результаты показали, что YHT может ослаблять повреждение подоцитов у мышей с ДБК.

Выяснение потенциальных мишеней и сигнальных путей, связанных с влиянием YHT на ДБЗ, с помощью сетевой фармакологии
Активные ингредиенты YHT (291) были проверены через базы данных TCMSP и BATMAN-TCM, из которых 39 активных ингредиентов соответствовали критериям OB ≥ 30% и DL ≥ 0,18. Активные ингредиенты были найдены в базе данных для идентификации их мишеней, и после объединения и удаления повторяющихся значений было получено в общей сложности 303 мишени (рис. 4A). После объединения результатов пяти баз данных, включая GeneCards, OMIM, TTD, Drugbank и DisGeNET, и удаления повторяющихся значений, в конечном итоге было получено 1867 целей, связанных с DKD. Затем http://www.bioinformatics.com.cn/ был использован для пересечения экранированных активных ингредиентов YHT с мишенями DKD, в результате чего получилось 84 пересекающиеся мишени (рис. 4B). Эти 84 мишени были импортированы в программное обеспечение Cytoscape для построения диаграммы сети PPI, и были определены потенциальные ключевые мишени для лечения YHT DKD, включая AKT, IL-1 β, CASP3, APOE и JUN (рис. 4C). Анализ функционального обогащения GO дал в общей сложности 1246 пунктов, указывающих на то, что YHT может оказывать терапевтическое воздействие на DKD, регулируя биологические процессы, такие как реакция на гормон, и молекулярные функции, включая активность гомодимеризации белка и активность оксидоредуктазы, а также клеточные компоненты, такие как мембранные рафты и мембранные микродомены (рисунок 4D).). В общей сложности было получено 263 результата обогащения KEGG, в основном с участием сигнального пути AGE-RAGE в диабетических комплексах, алкогольной болезни печени, пути липидного и атеросклероза. На основе P-значения были выбраны первые 10 результатов для построения пузырьковой диаграммы визуализации KEGG (рис. 4E). Сигнальный путь AGE-RAGE сильно обогащен диабетическими комплексами, и несколько основных мишеней в PPI, таких как PI3K, AKT и IL-1β, обогащены этим путем. Поэтому этот сигнальный путь был выбран для последующей валидации.

Ослабление повреждения подоцитов путем ингибирования сигнального пути PI3K/AKT/NF-κB
Уровни экспрессии генов и белков, связанных с сигнальным путем PI3K/AKT/NF-κB, были дополнительно изучены с помощью ПЦР и WB. Результаты ПЦР показали, что относительные уровни экспрессии мРНК Pi3k, Akt, Nf-κb и Il-1β в группе MOD были значительно повышены по сравнению с группой CON и значительно снизились после введения YHT (рис. 5A-D). Результаты WB показали, что относительные уровни белка P-PI3K, P-AKT, P-NF-κB и IL-1β также были значительно повышены в группе MOD по сравнению с группой CON, в то время как они были значительно снижены после введения YHT (рис. 5E-I). Эти результаты также свидетельствуют о том, что YHT может ингибировать сигнальный путь PI3K/AKT/NF-κB за счет ослабления повреждения подоцитов у мышей с ДБК.

figure-results-1
Рисунок 1: Улучшение уровня глюкозы в крови, функции печени и почек, а также нарушения липидного обмена у мышей с ДБЗ. Влияние YHT на (А) случайный уровень глюкозы в крови; (B-D) функция почек, включая 24-часовое содержание белка в моче, креатинина крови и азота мочевины; (E-G) функция печени, включая сывороточный альбумин, аланинаминотрансферазу и аспартатаминотрансферазу; и (H,I) регуляция липидного обмена, включая общий холестерин и триглицериды. Данные выражены в виде средних значений ± стандартных отклонений шести независимых выборок, по сравнению с пустой группой *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, и по сравнению с модельной группой #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001, эти статистические обозначения используются последовательно на всех рисунках. Сокращения: YHT = yinhuo Tang; ДБП = диабетическая болезнь почек; ALB = альбумин; АЛТ = аланинаминотрансфераза; AST = аспартатаминотрансфераза; TC = общий холестерин; TG = триглицериды; CON = контрольная группа; MOD = модельная группа; POS = валсартан Положительная контрольная группа; YH-L = низкодозированная группа YHT; YH-M = группа средних доз YHT; YH-H = высокодозированная группа YHT. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Улучшение гистопатологического повреждения почек у мышей с ДБК. (A,B) Гистология почек с помощью окрашивания H&E и PAS (масштабная линейка = 20 мкм); (C) окрашивание по Массону для наблюдения за степенью фиброза почек и (D) полуколичественный анализ с использованием программного обеспечения ImageJ; (Э-Г) Полуколичественный анализ относительных уровней экспрессии COI-I и α-SMA в тканях почек с использованием программного обеспечения IHC и ImageJ (масштабная линейка = 20 мкм). Сокращения: YHT = yinhuo Tang; ДБП = диабетическая болезнь почек; H&E = окрашивание гематоксилином и эозином; PAS = периодическое окрашивание кислотой-Шиффа; COI-I = коллаген I типа; α-СМА = α-актин гладкой мускулатуры; CON = контрольная группа; MOD = модельная группа; POS = валсартан Положительная контрольная группа; YH-L = низкодозированная группа YHT; YH-M = группа средних доз YHT; YH-H = высокодозированная группа YHT. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Ослабление повреждения подоцитов у мышей с DKD. (A-C) IHC обнаружил относительные уровни экспрессии CD2AP и WT-1 в почечных тканях (масштабная линейка = 20 мкм); (Д,Э) ПЦР выявляла относительную экспрессию мРНК CD2AP и WT-1 в почечных тканях, а полуколичественный анализ проводили с помощью программного обеспечения Image J; (Ф-Н) WB определил относительные уровни экспрессии белка CD2AP и WT-1 в почечных тканях, и был проведен полуколичественный анализ с помощью программного обеспечения ImageJ. количественный анализ с использованием программного обеспечения Image J. Сокращения: YHT = yinhuo Tang; ДБП = диабетическая болезнь почек; ИГХ = иммуногистохимия; WB = вестерн-блоттинг; CD2AP = CD2-ассоциированный белок; WT-1 = опухоль Вильмса 1; CON = контрольная группа; MOD = модельная группа; POS = валсартан Положительная контрольная группа; YH-L = низкодозированная группа YHT; YH-M = группа средних доз YHT; YH-H = высокодозированная группа YHT. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Сетевой фармакологический анализ YHT для лечения DKD. (A) Активный ингредиент-целевой участок заболевания YHT для лечения DKD. (Б) Диаграмма Венна пересекающихся целей YHT и DKD. Оранжевым цветом обозначено количество релевантных целей для DKD; зеленым цветом обозначено количество терапевтических мишеней активных ингредиентов YHT; а пересекающаяся часть представляет количество пересекающихся целей (количество целей YHT для DKD). (C) Сетевая диаграмма PPI пересекающихся целей YHT и DKD. (D) Анализ обогащения ГО 10 наиболее важных мишеней YHT для лечения ДБЗ. (E) Анализ обогащения KEGG 10 наиболее важных мишеней для лечения YHT ДБЗ. Сокращения: YHT = yinhuo Tang; ДБП = диабетическая болезнь почек; ИПП = белок-белковое взаимодействие; GO = Онтология генов; KEGG = Киотская энциклопедия генов и геномов; CON = контрольная группа; MOD = модельная группа; POS = валсартан Положительная контрольная группа; YH-L = низкодозированная группа YHT; YH-M = группа средних доз YHT; YH-H = высокодозированная группа YHT. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Ослабление повреждения подоцитов путем ингибирования сигнального пути PI3K/AKT/NF-κB. (А-Г) ПЦР для определения относительной экспрессии мРНК Pi3k, Akt, Nf-κb и Il-1β в почечных тканях. (И-И) WB для определения относительных уровней экспрессии белков P-PI3K, P-AKT, P-NF-κB и IL-1β в почечных тканях, а также полуколичественный анализ проводили с помощью программного обеспечения ImageJ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Состав Yinhuo Tang. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Подробная информация о праймерах qRT-PCR. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Обсуждение

Одним из важнейших шагов в этом протоколе является использование сетевой фармакологии для идентификации активных компонентов YHT и прогнозирования их взаимодействия с мишенями, связанными с DKD. Этот шаг включает в себя анализ крупномасштабных биологических данных с использованием инструментов биоинформатики, таких как базы данных (например, TCMSP, DrugBank и GeneCards), чтобы составить карту молекулярных путей и потенциальных биологических сетей, затронутых YHT. За этим предсказанием последовала экспериментальная проверка на животных моделях ДБЗ, где были проверены гипотетические эффекты YHT на эти пути. Интеграция вычислительных прогнозов с данными является важнейшим аспектом нашего подхода, поскольку она повышает надежность наших выводов и устраняет разрыв между теоретическими прогнозами и практическими результатами. Кроме того, использование животных моделей является еще одним важным шагом в валидации терапевтических эффектов YHT. ДБП у животных точно имитирует прогрессирование заболевания человека, что позволяет эффективно оценить влияние YHT как на повреждение клубочков, так и на фиброз почек. Тщательный мониторинг маркеров функции почек, таких как Scr, BUN и протеинурия, наряду с гистопатологическими оценками, имеет важное значение для оценки терапевтической эффективности YHT.

Несмотря на то, что наш протокол сочетает в себе мощные вычислительные и экспериментальные методы, у него есть несколько ограничений. Во-первых, подход сетевой фармакологии в значительной степени опирается на имеющиеся данные в общедоступных базах данных, и могут быть предвзятости или отсутствовать информация относительно определенных компонентов YHT или путей, связанных с DKD. Несмотря на то, что мы сделали перекрестные ссылки на несколько баз данных, чтобы решить эту проблему, некоторые важные взаимодействия все еще могут быть упущены из виду. Во-вторых, в этом исследовании изучался только механизм YHT в снижении повреждения подоцитов на экспериментальном уровне животных, и для подтверждения экспериментальных результатов необходимы клеточные эксперименты и клинические исследования на больших выборках. Наконец, сетевая фармакология показала, что лечение ДБП с помощью YHT также связано с алкогольной болезнью печени, липидным обменом и атеросклерозом, а также регуляцией липолиза в адипоцитах. Это исследование только подтвердило, может ли модуляция сигнального пути PI3K/AKT/NF-κB с помощью YHT задерживать прогрессирование DKD; Результаты нуждаются в дальнейшем изучении.

Сигнальный путь PI3K/AKT/NF-κB является важным внутриклеточным сигнальным путем, участвующим в регуляции различных биологических процессов, таких как рост клеток, пролиферация, выживание и воспалительныереакции. Исследования показали, что он играет важную роль в прогрессировании повреждения педикулоцитов23,24. NF-κB является важным компонентом нисходящего пути PI3K/Akt и участвует в передаче различных внутриклеточных сигналов и экспрессии нескольких генов. Ингибирование сигнального пути PI3K/AKT приводит к деградации ингибирующего белка NF-κB IκB, что, в свою очередь, приводит к фосфорилированию NF-κB и его вступлению в ядро, а также к продукции различных хемокинов и воспалительных факторов, приводящих к повреждению подоцитов и интерстициальному фиброзу почек25. Некоторые исследования показали, что ингибирование активации сигнального пути PI3K/AKT/NF-κB может эффективно подавлять воспалительные реакции и фиброз почек, тем самым задерживая прогрессирование DKD26.

Исследования показали, что нарушения липидного обмена играют значительную роль в возникновении и прогрессировании DKD27,28. У пациентов с ДБП часто наблюдаются нарушения липидного обмена, включая повышенный уровень ЛПНП, ТГ и накопления жирных кислот. Эти аномалии тесно связаны с патологическими изменениями, такими как гломерулосклероз и тубулоинтерстициальный фиброз29,30. Исследования показывают, что нарушения липидного обмена могут способствовать прогрессированию ДБЗ по нескольким сигнальным путям 31,32. Во-первых, сигнальный путь mTOR является ключевым путем в регуляции липидного обмена; Его гиперактивация приводит к повреждению подоцитов и протеинурии33,34. Среда с высоким содержанием жиров может способствовать накоплению липидов по оси PI3K/AKT/mTOR, вызывая апоптоз подоцитов и в конечном итоге усугубляя ухудшение функции почек 35,36,37. Во-вторых, АМФ-активируемая протеинкиназа (АМФК), важнейший регулятор клеточного энергетического метаболизма, защищает почки от метаболических нарушений, способствуя окислению жирных кислот, ингибируя синтез липидов и снижая липотоксичность 38,39,40. Инактивация АМФК считается важным механизмом прогрессирования ДБК. Активаторы АМФК, такие как метформин, продемонстрировали значительные ренопротекторные эффекты и представляют собой перспективную терапевтическую мишень для ДБД41.

Наконец, исследования показали, что рецепторы, активируемые пролифератором пероксисом, α/γ (PPARα/γ) играют важную роль в регулировании липидного обмена и DKD 42,43. Активация PPARα способствует окислению жирных кислот и снижает накопление липидов в почках, в то время как PPARγ улучшает чувствительность к инсулину и оказывает противовоспалительное действие44,45. Агонисты PPAR, такие как фибраты, показали потенциальные клинические преимущества в снижении протеинурии у пациентов с ДБП46. В заключение следует отметить, что нарушения липидного обмена влияют на патологическое прогрессирование ДБП по нескольким сигнальным путям. Взаимодействия между этими путями образуют сложную патологическую сеть. Нацеливание на метаболизм липидов может обеспечить новые терапевтические стратегии для ДБД.

Семейство каспаз (CASP), семейство цистеин-специфичных протеаз, представляет собой группу протеаз, которые широко распространены в клетках и в основном участвуют в регуляции апоптоза и воспалительных реакций47,48. Члены семейства CASP имеют структурное сходство и обычно существуют в виде зимогенов, которые активируются через каскад реакций, тем самым запуская апоптоз, пироптоз идругие процессы запрограммированной гибели клеток. Среди них CASP3, член семейства каспаз (CASP) с консервативной структурой, обычно присутствующей в виде зимогена, является ключевой протеазой в фазе выполнения апоптоза, которая катализирует расщепление специфических клеточных белков, тем самым играя решающую роль в регулировании нормального роста клеток и поддержании внутреннего гомеостаза50,51. Каспаза-8 выступает инициатором каскадов апоптоза и участвует в модуляции воспалительных реакций за счет активации NPK, который является ключевым фактором регуляции клеточного роста. Каспаза-8 выступает в качестве инициатора апоптотического каскада, а также участвует в регуляции воспалительной реакции, активируя воспалительные везикулы, такие как NLRP1 и NLRP3, тем самым запуская клеточный пироптоз52. Основываясь на важной роли сигнального пути CASP в опосредовании апоптоза и пироптоза в клетках на ножке, в будущем необходимы дальнейшие углубленные исследования взаимоотношений между YHT, CASP3/8, клетками на ножке и DKD.

По сравнению с традиционными подходами к разработке лекарств, которые обычно подчеркивают четко определенные механизмы с одной мишенью для обеспечения ясности и предсказуемости регулирования, наша стратегия, основанная на сетевой фармакологии, позволяет систематически исследовать многоцелевые взаимодействия, присущие составам ТКМ, таким как YHT. В то время как эта сложность отражает целостную природу ТКМ и ее потенциальную терапевтическую широту, она также подчеркивает проблему непреднамеренных побочных эффектов, которые требуют тщательной проверки и интерпретации. Рассматривая многоцелевой и многоканальный характер действия YHT, мы обеспечиваем более целостное понимание его терапевтических эффектов при лечении ДБЗ. Кроме того, сетевая фармакология позволяет прогнозировать потенциальные лекарственные взаимодействия и побочные эффекты, что имеет решающее значение для обеспечения безопасности и эффективности многокомпонентной терапии. Современные методы лечения ДБЗ в основном сосредоточены на управлении симптомами или замедлении прогрессирования, а не на устранении основных механизмов заболевания. Интегрируя современные инструменты биоинформатики с экспериментальной валидацией, это исследование подчеркивает важность системной биологии в повышении эффективности ТКМ, особенно при хронических заболеваниях, таких как ДБЗ.

В перспективе этот метод имеет значительные перспективы для расширения сферы применения сетевой фармакологии в исследованиях ТКМ, особенно в лечении сложных заболеваний, таких как ДБП. Наш подход может быть применен для изучения других формул ТКМ или отдельных трав на предмет их терапевтического потенциала в лечении заболеваний почек, сердечно-сосудистых заболеваний и метаболических нарушений. Кроме того, эта методология может быть расширена для исследования перепрофилирования лекарств путем выявления новых применений существующих препаратов в лечении ДБЗ. Еще одно потенциальное применение нашего подхода лежит в персонализированной медицине. Объединяя данные, специфичные для пациента, сетевая фармакология может быть использована для адаптации стратегий лечения ТКМ на основе индивидуальных молекулярных профилей, повышая эффективность лечения и сводя к минимуму побочные эффекты.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

Работа выполнена при поддержке Фонда естественных наук провинции Цзилинь (No20210101201JC).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Безводный этанолКитайская национальная фармацевтическая группа Chemical Reagent Co., Ltd10009218
Экспериментальный центр на животныхЧанчуньский университет традиционной китайской медициныSYXK (JI) 2023-0014
База данных BATMAN-TCMhttp://bionet.ncpsb.org/batmantcm--
-Набор для анализа белка BCASolarbioPC0020
Блокирующий буферBeyotimeP0023B
Керамические горшкиMideaMD-DG30E103
Система хемилюминесцентной визуализацииHangzhou Shenhua Technology Co., LtdSH-523
ХлороформКитайская национальная фармацевтическая группа Chemical Reagent Co., Ltd10006818
программное обеспечение Cytoscape 3.8.0-
Набор реагентов DABServicebioG1212-200T
db/db мышиNanjing Junke Biological limited companySCXK (Su) 2020-009
ECL субстрат растворaffinityKF8003
Электрическая водяная баня постоянной температурыFisaff Instrument (Hebei) Co., LtdDK-20000-IIIL
Электрофорез Электрофорез Источник питания ПекинLongfang Technology Co., LtdLF-600S
Гомогенизатор стеклаSolarbioYA0852
Стеклянная горкаNantong Meiweide Life Science Co., LtdPC2-301
Козий антикролик IgG HRP (вторичное антитело)AffinityS00011:3000 для IHC, 1:10000 для WB
HematoxylinWuhan Lingsi Biotechnology Co., LtdG1140
Высокоскоростная рефрижераторная центрифуга Hunan Kecheng Instrument Equipment Co., LtdH1-16KR
HiScript II Q RT SuperMix для qPCR (+gDNA wiper)VAZYMER223-01
Горизонтальный шейкерJiangsu Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., LtdTS-1
Система визуализацииNikonNikon DS-U3
Интеллектуальная цифровая магнитная нагревательная мешалкаHangzhou Miou Instrument Co., LtdTP-350E +
IsopropanolChina National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd80109218
маркер (20-120KD)GenScriptM00521
Набор для окрашивания MassonBASOBA4079B
Медицинская марляJianerkang Medical--платформа
Metascapehttp://metascape.org/gp/index.html--Methanol
Thermo67-56-1
Микробиологический веб-сайтhttp://www.bioinformatics.com.cn/--микроскоп
NikonECLIPSE Ci
микроволновая печьGalanz Microwave Oven Electrical Appliance Co., LtdP70D20TL-P4
Многообразный тканевый измельчитель ШанхайJingxin Industrial Development Co., LtdTissuelyser-24L
Многофункциональные аналитические электронные весыChangzhou Lucky Electronic Equipment Game CompanyFA1204
Нейтральная смолаWuhan Lingsi Biotechnology Co., LtdG8590
Нормальная козья сывороткаSolarbioSL038
печьShanghai Huitai Instrument Manufacturing Co., LtdDHG-9140A
Пальмовая центрифугаWuhan Lingsi Biotechnology Co., LtdD1008E
PAS набор для окрашиванияBASOBA4114B
патологический слайсерShanghai Leica Instrument Co., LtdRM2016
PBSSolarbioP1020
PCR инструментHangzhou Miou Instrument Co., LtdPR-96
Пистолет-пипеткаDragonKE0003087/KA0056573
Буфер для разведения первичных антителBeyotimeP0023A
Комплекс ингибиторов протеинфосфатазыMeilunbioMB12707-1
PVDF мембрана (0,22 μ m)SolarbioISEQ00010
Быстрый разбавитель первичных/вторичных антителSolarbioA1811
Rabbit anti-CD2APAffinityDF22981:200 для ИГХ, 1:1000 для WB
Rabbit anti-COI-IAffinityDF121491:200 для ИГХ, 1:1000 для WB
Rabbit анти-IL-1&бета;AffinityAF51031:1000 для WB
Rabbit anti-P-AKTAffinityAF00161:1000 для WB
Rabbit anti-P-NF-Κ bAffinityAF32191:1000 для WB
Rabbit anti-P-PI3KAffinityAF32421:1000 для WB
Rabbit anti-WT-1AffinityDF63311:200 для IHC, 1:1000 для WB
Rabbit anti-α-SMAAffinityAF10321:200 для IHC, 1:1000 для WB
Rabbit anti-β-ActinAffinityAF70181:1000 для WB
Система для ПЦР в реальном времениABIQuantStudio 6
RIPA Lysis BufferMeilunbioMA0151
РНКаза без РНКазы ddH2OSolarbioR1600
Вторичный буфер для разбавления антителBeyotimeP0023D
Слайд и покровное стеклоJiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd10212432C
SPSS 26.0 программное обеспечение----Веб-сайт
базы данных строк https://cn.string-db.org/--Сверхчистый
водный приборZhiang Instrument (Shanghai) Co., LtdClever-S15
Taq Plus ДНК-полимеразаTIANGENET105-02
база данных TCMSP https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php--
Измельчитель тканейBeautiful WallMB-96
TrizolAmbion15596-026
Tween 20Китайская национальная фармацевтическая группа Chemical Reagent Co., Ltd30189328
Ультра микро УФ видимый спектрофотометрHangzhou Miou Instrument Co., LtdND-100
База данных белков Uniprothttps://www.uniprot.org-
-Вертикальный оптический микроскопNikonEclipse CI
Набор для тестирования белка мочевого пузыряNanjing Jiancheng Bioengineering Research InstituteC035-2
вакуумный лиофилизаторNingbo Xinzhi Biotechnology Co.A01-1-NA0959
Вертикальный резервуар для электрофорезаПекин 61 Завод инструментовDYCZ-24DN
Вихревой смесительWuhan Lingsi Biotechnology Co., LtdMX-F
Западный блокирующий буферSolarbioSW3010
ксилолКитайская национальная фармацевтическая группа Химический реагент Co., Ltd10023418
YihongУхань Линси Биотехнология Ко., ЛтдE8090

Ссылки

  1. Naaman, S. C., Bakris, G. L. Diabetic nephropathy: Update on pillars of therapy slowing progression. Diabetes Care. 46 (9), 1574-1586 (2023).
  2. Glastras, S. J., Pollock, C. A. Targeted identification of risk and treatment of diabetic kidney disease. Nat Rev Nephrol. 20 (2), 75-76 (2024).
  3. Gregory, G. A., et al. Global incidence, prevalence, and mortality of type 1 diabetes in 2021 with projection to 2040: a modelling study. Lancet Diabetes Endocrinol. 10 (10), 741-760 (2022).
  4. Rao, B. V., Tan, S. H., Candasamy, M., Bhattamisra, S. K. Diabetic nephropathy: An update on pathogenesis and drug development. Diabetes Metab Syndr. 13 (1), 754-762 (2019).
  5. Guo, M., He, F., Zhang, C. Molecular therapeutics for diabetic kidney disease: An update. Int J Mol Sci. 25 (18), 10051(2024).
  6. Shen, S., et al. Advances in traditional Chinese medicine research in diabetic kidney disease treatment. Pharm Biol. 62 (1), 222-232 (2024).
  7. Han, C., et al. Yi-Shen-Hua-Shi granule ameliorates diabetic kidney disease by the "gut-kidney axis". J Ethnopharmacol. 10 (307), 116257(2023).
  8. Ma, X., et al. Advances in oxidative stress in pathogenesis of diabetic kidney disease and efficacy of TCM intervention. Ren Fail. 45 (1), 2146512(2023).
  9. Liu, M., et al. A systematic review on polysaccharides from Morinda officinalis How: Advances in the preparation, structural characterization and pharmacological activities. J Ethnopharmacol. 28 (328), 118090(2024).
  10. Zhang, X., et al. Network pharmacology-based identification of key pPharmacological mechanism of Shen-qi-di-huang decoction acting on uremia. Altern Ther Health Med. 30 (1), 44-50 (2024).
  11. Linlin, Z., et al. A multi-target and multi-channel mechanism of action for Jiawei Yinhuo Tang in the treatment of social communication disorders in autism: Network pharmacology and molecular docking studies. Evid Based Complement Alternat Med. 8 (2022), 4093138(2022).
  12. Husain, S. Role of podocyte in kidney disease. Front Biosci (Landmark Ed). 29 (7), 250(2024).
  13. Pavenstädt, H., Kriz, W., Kretzler, M. Cell biology of the glomerular podocyte. Physiol Rev. 83 (1), 253-307 (2003).
  14. Torban, E., et al. From podocyte biology to novel cures for glomerular disease. Kidney Int. 96 (4), 850-861 (2019).
  15. Yue, J. I., et al. Acupuncture improve proteinuria in diabetic kidney disease rats by inhibiting ferroptosis and epithelial-mesenchymal transition. Heliyon. 10 (13), e33675(2024).
  16. Liu, X. Q., et al. Wogonin protects glomerular podocytes by targeting Bcl-2-mediated autophagy and apoptosis in diabetic kidney disease. Acta Pharmacol Sin. 43 (1), 96-110 (2022).
  17. Nogales, C., et al. Network pharmacology: curing causal mechanisms instead of treating symptoms. Trends Pharmacol Sci. 43 (2), 136-150 (2022).
  18. Zhang, P., et al. Network pharmacology: towards the artificial intelligence-based precision traditional Chinese medicine. Brief Bioinform. 25 (1), bbad518(2023).
  19. Zhao, L., et al. Network pharmacology, a promising approach to reveal the pharmacology mechanism of Chinese medicine formula. J Ethnopharmacol. 12 (309), 116306(2023).
  20. Meek, R. L., et al. Glomerular cell death and inflammation with high-protein diet and diabetes. Nephrol Dial Transplant. 28 (7), 1711-1720 (2013).
  21. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protoc. 2008, (2008).
  22. Yusuf, J. A., et al. Molecular mechanism underlying stress response and adaptation. Prog Brain Res. 291, 81-108 (2025).
  23. Yu, M., et al. Baicalein increases cisplatin sensitivity of A549 lung adenocarcinoma cells via PI3K/Akt/NF-κB pathway. Biomed Pharmacother. 12 (90), 677-685 (2017).
  24. Chen, H., et al. The PI3K/AKT pathway in the pathogenesis of prostate cancer. Front Biosci (Landmark Ed). 21 (5), 1084-1091 (2016).
  25. Wang, J., et al. Critical roles of PI3K/Akt/NF-κB survival axis in angiotensin II-induced podocyte injury. Mol Med Rep. 20 (6), 5134-5144 (2019).
  26. Zhang, S. J., et al. Integrated network pharmacology analysis and experimental validation to elucidate the mechanism of acteoside in treating diabetic kidney disease. Drug Des Devel Ther. 12 (18), 1439-1457 (2024).
  27. Rong, J., et al. Mechanisms of hepatic and renal injury in lipid metabolism disorders in metabolic syndrome. Int J Biol Sci. 20 (12), 4783-4798 (2024).
  28. Bi, Z., et al. Development of a clinical prediction model for diabetic kidney disease with glucose and lipid metabolism disorders based on machine learning and bioinformatics technology. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 28 (3), 863-878 (2024).
  29. Wei, L., Gao, J., Wang, L., Tao, Q., Tu, C. Multi-omics analysis reveals the potential pathogenesis and therapeutic targets of diabetic kidney disease. Hum Mol Genet. 33 (2), 122-137 (2024).
  30. Vartak, T., Godson, C., Brennan, E. Therapeutic potential of pro-resolving mediators in diabetic kidney disease. Adv Drug Deliv Rev. 178 (4), 113965(2021).
  31. Liu, S., et al. Renal tubule ectopic lipid deposition in diabetic kidney disease rat model and in vitro mechanism of leptin intervention. J Physiol Biochem. 78 (2), 389-399 (2022).
  32. Tang, C., et al. Fenofibrate attenuates renal tubular cell apoptosis by up-regulating MCAD in diabetic kidney disease. Drug Des Devel Ther. 17 (2), 1503-1514 (2023).
  33. Lu, H. T., et al. Unraveling DDIT4 in the VDR-mTOR pathway: a novel target for drug discovery in diabetic kidney disease. Front Pharmacol. 15 (10), 1344113(2024).
  34. Tang, G., et al. Clinical efficacies, underlying mechanisms and molecular targets of Chinese medicines for diabetic nephropathy treatment and management. Acta Pharm Sin B. 11 (9), 2749-2767 (2021).
  35. Zhang, P., et al. Huaiqihuang (HQH) protects podocytes from high glucose-induced apoptosis and inflammation response by regulating PI3K/AKT/mTOR pathway. Arch Physiol Biochem. 11 (27), 1-8 (2024).
  36. Zhaoan, G., et al. Qizhi Jiangtang capsule activates podocyte autophagy in diabetic kidney disease by inhibiting phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin pathways. J Tradit Chin Med. 43 (4), 667-675 (2023).
  37. Jin, D., et al. Jiedu Tongluo Baoshen formula enhances podocyte autophagy and reduces proteinuria in diabetic kidney disease by inhibiting PI3K/Akt/mTOR signaling pathway. J Ethnopharmacol. 293 (3), 115246(2022).
  38. Zhou, Y., et al. Metrnl alleviates lipid accumulation by modulating mitochondrial homeostasis in diabetic nephropathy. Diabetes. 72 (5), 611-626 (2023).
  39. Shao, M., et al. Canagliflozin regulates metabolic reprogramming in diabetic kidney disease by inducing fasting-like and aestivation-like metabolic patterns. Diabetologia. 67 (4), 738-754 (2024).
  40. Tian, S., et al. GLP-1 receptor agonists alleviate diabetic kidney injury via β-klotho-mediated ferroptosis inhibition. Adv Sci (Weinh). 12 (4), e2409781(2024).
  41. Song, Y., et al. Identification of circular RNAs and functional competing endogenous RNA networks in human proximal tubular epithelial cells treated with sodium-glucose cotransporter 2 inhibitor dapagliflozin in diabetic kidney disease. Bioengineered. 13 (2), 3911-3929 (2022).
  42. Fan, Y., et al. Identification of potential key lipid metabolism-related genes involved in tubular injury in diabetic kidney disease by bioinformatics analysis. Acta Diabetol. 61 (8), 1053-1068 (2024).
  43. Pan, S., et al. A comprehensive weighted gene co-expression network analysis uncovers potential targets in diabetic kidney disease. J Transl Int Med. 10 (4), 359-368 (2023).
  44. Chen, Y., et al. Curcumin targets CXCL16-mediated podocyte injury and lipid accumulation in diabetic kidney disease treatment. Arch Pharm Res. 47 (12), 924-939 (2024).
  45. Liu, K., et al. Design, synthesis, and biological evaluation of a novel dual peroxisome proliferator-activated receptor alpha/delta agonist for the treatment of diabetic kidney disease through anti-inflammatory mechanisms. Eur J Med Chem. 218 (5), 113388(2021).
  46. Kitada, M., Kanasaki, K., Koya, D. Clinical therapeutic strategies for early stage of diabetic kidney disease. World J Diabetes. 5 (3), 342-356 (2014).
  47. Galluzzi, L., Kepp, O., Kroemer, G. Caspase-3 and prostaglandins signal for tumor regrowth in cancer therapy. Oncogene. 31 (23), 2805-2808 (2012).
  48. Li, L., Wang, S., Zhou, W. Balance cell spoptosis and pyroptosis of caspase-3-activating chemotherapy for better antitumor therapy. Cancers (Basel). 15 (1), 26(2022).
  49. Fan, T. J., et al. Caspase family proteases and apoptosis. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 37 (11), 719-727 (2005).
  50. Asadi, M., et al. Caspase-3: Structure, function, and biotechnological aspects. Biotechnol Appl Biochem. 69 (4), 1633-1645 (2022).
  51. Eskandari, E., Eaves, C. J. Paradoxical roles of caspase-3 in regulating cell survival, proliferation, and tumorigenesis. J Cell Biol. 221 (6), e202201159(2022).
  52. Pang, J., Vince, J. E. The role of caspase-8 in inflammatory signalling and pyroptotic cell death. Semin Immunol. 42 (70), 101832(2023).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CD2APWT 1PI3K AKT NF B
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи