Использование библиотек компьютерного зрения для упрощения количественного определения ядер

Summary

В этой статье описываются пошаговые методы автоматизации количественного определения ядер на основе изображений с помощью исполняемой программы с открытым исходным кодом, проверенной для диапазона плотности клеток. Эта программа предоставляет альтернативу, которая устраняет барьеры, связанные со стоимостью, доступностью для пользователей с ограниченными технологическими навыками и проверкой специфичных приложений, которая может ограничивать полезность существующих технологий.

Abstract

Анализ живых клеток и анализ клеток на основе изображений требуют нормализации данных для точной интерпретации. Обычно используемым методом является окрашивание и количественное определение ядер с последующей нормализацией данных до количества ядер. Это количество ядер часто выражается в виде количества клеток для одноядерных клеток. В то время как ручная количественная оценка может быть трудоемкой и отнимать много времени, доступные автоматизированные методы могут быть предпочтительными не для всех пользователей, могут не иметь проверки для этого конкретного приложения или могут быть непомерно дорогими. Здесь мы предоставляем пошаговые инструкции по получению количественных изображений ядер, окрашенных флуоресцентными красителями ДНК, и последующей количественной оценке ядер с помощью автоматизированного программного обеспечения для подсчета объектов, разработанного с использованием библиотек компьютерного зрения Python. Мы также проверяем эту программу в диапазоне плотностей клеток. Хотя точное время выполнения программы зависит от количества изображений и компьютерного оборудования, эта программа объединяет часы работы, подсчитывая ядра в секунды для выполнения программы. Хотя этот протокол был разработан с использованием изображений неподвижных, окрашенных клеток, изображения окрашенных ядер в живых клетках и иммунофлуоресцентные приложения также могут быть количественно оценены с помощью этой программы. В конечном счете, эта программа предоставляет вариант, который не требует высокой степени технологических навыков и является проверенной альтернативой с открытым исходным кодом, помогающей клеточным и молекулярным биологам оптимизировать свои рабочие процессы, автоматизируя утомительную и трудоемкую задачу количественного определения ядер.

Introduction

Функциональные эксперименты и эксперименты на основе изображений имеют решающее значение для понимания влияния экспериментальных методов лечения на биохимию и физиологию всей клетки. Корректная интерпретация данных экспериментов по клеточной биологии зависит от точности и воспроизводимости протокола эксперимента, включая нормализацию данных. Например, анализ потребления кислорода и скорости внеклеточного закисления в живых клетках на исходном уровне и после лечения специфическими препаратами позволяет оценить различные аспекты энергетического обмена ^1,2. Измерение активности ф....

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительные файлы можно найти по следующей ссылке https://osf.io/a2s4d/?view_only=2d1042eb8f7c4c4a84579fe4e84fb03c

1. Захват и сохранение изображений с помощью флуоресцентной микроскопии

1. Подготовьте образцы клеток или тканей для визуализации, включая окрашивание желаемым ДНК-красителем. Для получения использованных здесь изображений миобласты C2C12 (CRL-1772, American Type Culture Collection) выращивали в 6-луночных планшетах в течение 48-72 ч в стандартных условиях культивирования (5%_CO2, 37 °C, увлажненные), с 50 мМ EtOH⁶ или без него, и фиксировали в ледяном метаноле, как ....

Results

При каждом пакетном прогоне изображений создается: 1) набор файлов изображений с нанесенными контурами, показывающими контуры идентифицированных ядер (рисунок 5), и 2) файл .csv (электронная таблица), связывающий имена файлов изображений и связанные с ними счетчики. Просмотр контуров позволит пользователю визуально оценить качество подсчета. В частности, изображения, полученные в соответствии с разделом 1, должны иметь все (или почти все) ядра, окруженные спл.......

Discussion

Наша программа количественной оценки ядер имеет ряд преимуществ по сравнению с существующими вариантами: она требует лишь минимальных технологических навыков, проверена для конкретной задачи количественной оценки ядер и имеет открытый исходный код; Последнее позволяет преодолеть барьеры, связанные с затратами. В конечном счете, эта программа предоставляет клеточным и молекулярным биологам дополнительную возможность быстро и точно количественно определять ядра на изображениях, полученных .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Компьютер с доступом к файлу результатов из метода 2 или 3	-		см. шаг 2.6 (для метода 2) или шаг 3.3.9 или 3.4.9 (для метода 3)
Компьютер с доступом в Интернет, современный браузер	-		например, компьютер Google Chrome
с доступом в Интернет, современный браузер и ОС Windows	варьируется	Варьируется	Для Mac, Linux или другой ОС используйте метод 3
Компьютер с программным обеспечением для захвата изображений	Zeiss	AxioVision	Другое программное обеспечение приемлемо; должно быть совместимо с флуоресцентным микроскопом
Расположение файла для вывода (результаты электронной таблицы и контуры изображения)	-	-	Может быть новая, пустая папка
Флуоресцентный микроскоп	Zeiss	Axiovert 200M	Другие флуоресцентные микроскопы приемлемы; должны быть оснащены соответствующими фильтрующими кубами, желаемым объективом и камерой...
Папка, содержащая все изображения, подлежащие количественной оценке	-	-	См. шаг 1.12
Python версии 3.10 или выше		Python-Доступно	для бесплатной загрузки и установки по адресу https://www.python.org/downloads/
Образцы для визуализации		-	фиксированные или живые, окрашенные или противоокрашенные флуоресцентными красителями ДНК
Программное обеспечение для работы с электронными таблицами	Microsoft Excel		Аналогичное программное обеспечение для работы с электронными таблицами также приемлемо