Методическая статья

Флуоресцентное детектирование активности нуклеазы FEN1 и скрининг низкомолекулярных ингибиторов

DOI:

10.3791/67968

⸱

27 июня 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, 2Jiangsu Province Engineering Research Center of Molecular Target Therapy and Companion Diagnostics in Oncology, Suzhou Vocational Health College, 3Jiangsu Province Engineering Research Center of Development and Translation of Key Technologies for Chronic Disease Prevention and Control, Suzhou Vocational Health College

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает биохимический анализ гелеобразного сдвига для измерения активности FEN1 (Flap Endonuclease 1) и выработки ингибитора.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FEN1 (Flap Endonuclease 1) является ключевой ДНК-нуклеазой, участвующей в репликации ДНК и восстановлении повреждений, играя решающую роль в поддержании стабильности генома. Повышенный уровень активности FEN1 тесно связан с развитием различных видов рака, что делает FEN1 признанным биомаркером и мишенью для лечения рака легких, молочной железы и предстательной железы. Традиционные методы радиоизотопного мечения для определения активности нуклеазы FEN1 представляют собой проблемы с точки зрения удобства и безопасности. В данном исследовании субстрат фрагмента ДНК с лоскутной структурой был синтезирован in vitro. Этот субстрат помечен флуорофором на 5'-конце лоскута, что позволяет нуклеазе FEN1 специфически распознавать и расщеплять обозначенный участок. Затем активность FEN1 определяли путем детектирования сигнала флуорофора после гель-электрофореза. Этот метод позволяет быстро и эффективно оценить активность нуклеазы FEN1 и провести скрининг ее ингибиторов. Он обеспечивает чувствительный и специфический подход к анализу активности FEN1 и оценке эффективности низкомолекулярных ингибиторов. Кроме того, он вносит значительный вклад в исследования по восстановлению повреждений ДНК и развитию рака, предлагая новую стратегию для клинических исследований механизмов заболеваний и обнаружения генотоксических веществ.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Репликация ДНК не всегда безупречна и может быть нарушена как внутренними, так и внешними факторами. Следовательно, механизмы репликации ДНК и восстановления повреждений жизненно важны для выживания клеток и стабильности генома. В этом процессеважную роль играет специфичная для разветвления структуры человека эндонуклеаза FEN1 (Flap Endonuclease 1), являющаяся ядром ДНК 1,2,3.

FEN1 в первую очередь участвует в репликации ДНК и незаменим для созревания фрагментов Оказаки на отстающей цепи 4,5. Это обеспечивает эффективное развитие репликации ДНК и точное восстановление поврежденной ДНК. Тем не менее, аномальное повышение уровня FEN1 было тесно связано с развитием различных видов рака, таких как рак легких и молочной железы7. Таким образом, FEN1 не только необходим для репликации и восстановления ДНК, но и привлек значительное внимание в качестве биомаркера для диагностики рака и потенциальной терапевтической мишени 8,9. Обнаружение активности FEN1 имеет важное значение для ранней диагностики рака и для продвижения исследований в области таргетной терапии.

Учитывая важность FEN1 и необходимость изучения его активности для ранней диагностики рака и разработки таргетной терапии, основной целью метода, разработанного в этом эксперименте, было точное и эффективное измерение активности нуклеазы FEN1. Этот метод направлен на обеспечение надежной платформы для скрининга низкомолекулярных ингибиторов, нацеленных на FEN1. Достигая этих целей, исследование направлено на то, чтобы способствовать лучшему пониманию роли FEN1 в развитии рака и способствовать открытию новых терапевтических стратегий.

Существует множество методов обнаружения активности нуклеазы FEN1, каждый из которых имеет свои отличительные характеристики, принципы, преимущества, ограничения и применимые сценарии. Например, гель-электрофорез и методы разделения субстрата на основе ВЭЖХ обеспечивают интуитивно понятные результаты, но включают в себя громоздкие процедуры и низкую производительность10,11. Анализы флуоресцентной поляризации (FP) сталкиваются с трудностями при оценке активности FEN1 из-за интерференции от составной автофлуоресценции или рассеяния света, которые влияют на сигналы FP. Несмотря на то, что стратегии контрскрининга могут частично исключить ложноположительные результаты, примерно 15% первичных активных соединений все еще неправильно идентифицируются из-за технических помех12. Совместное использование флуоресцентных пар донор/гаситель (например, TAMRA/BHQ-2) и хемилюминесценции AlphaScreen имеет недостатки, такие как высокая стоимость синтеза сложных флуоресцентных субстратов с тройным лоскутом, что особенно ограничивает их полезность при крупномасштабном скрининге. Кроме того, двухлоскутная структура субстратов может препятствовать оптимальному связыванию с FEN1, снижая эффективность ферментативного расщепления и снижая чувствительность детектирования. Кроме того, этот подход в значительной степени опирается на специализированные приборы (например, ViewLux, EnVision), что ограничивает его применение в лабораториях с ограниченными ресурсами 13,14,15. Флуоресцентные методы детектирования, основанные на двухлоскутных гантелевидных нанозондах, функционализированных нанокластерами серебра (DNA-AgNCs), страдают от вариабельности от партии к партии из-за их зависимости от точного отжига и стадий зарождения in situ, что препятствует воспроизводимости и масштабируемости. Высокая стоимость и длительные процедуры еще больше ограничивают их практическое применение16.

В этой статье анализ, основанный на флуоресцентном мечении, разработан для устранения текущих технических ограничений и удовлетворения растущего спроса на более безопасные и доступные для пользователя методы изучения активности FEN1. Этот метод использует преимущества специфичности и высокой чувствительности флуоресцентного детектирования, а также возможности создания субстратов ДНК с определенными структурами, которые могут быть распознаны и расщеплены с помощью FEN1 (рис. 1). Этот метод оптимизирует экспериментальные процедуры, сохраняя при этом высокую точность оценки активности нуклеазы FEN1. По сравнению с традиционным гель-электрофорезом и методами на основе ВЭЖХ, он обеспечивает упрощенную работу и более быстрый оборот. В отличие от флуоресцентного поляризационного анализа, этот подход позволяет проводить быстрый качественный скрининг соединений, создавая эффективную стратегию для предварительной ферментативной оценки.

Этот метод подходит для изучения активности нуклеазы FEN1 в лабораторных условиях, где доступ к радиоактивным материалам ограничен. Он также хорошо подходит для скрининга большого количества низкомолекулярных ингибиторов за относительно короткое время, особенно когда требуется высокая чувствительность и специфичность. Тем не менее, он не идеален для исследований, требующих абсолютной количественной оценки с очень высокой точностью, или для лабораторий, в которых отсутствует базовое оборудование для детектирования флуоресценции и опыт в анализе флуоресцентных сигналов. Для исследований, посвященных приложениям in vivo , где на поведение FEN1 могут влиять сложные биологические факторы, не воспроизводимые в современных дизайнах анализов in vitro , может потребоваться дальнейшее уточнение или альтернативные методы.

Этот флуоресцентный анализ является высокочувствительным и специфичным, обеспечивая безопасный, удобный и эффективный инструмент для изучения активности FEN1 и разработки его ингибиторов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Реагенты и оборудование, использованные в данном исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Очистка экспрессии белка FEN1

  1. Очистка белка
    1. Удалите бактериальный материал, содержащий целевую плазмиду (см. Таблицу материалов), с температуры −80 °C. Разморозьте при комнатной температуре и инокулируйте 200 мкл из замороженных микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 мл в среду объемом 20 мл ЛБ, содержащую 50 мкг/мл канамицина, с помощью наконечника для дозатора объемом 200 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Штамм E . coli BL21(DE3)-FEN1.
    2. Инкубировать при 37 °C с встряхиванием при 160 об/мин в течение 12 часов.
    3. Перенесите бактериальную суспензию в колбу Эрленмейера объемом 200 мл, содержащую среду LB с добавлением 50 мкг/мл канамицина. Продолжайте инкубацию при 37 °C с встряхиванием при 160 об/мин в течение 2-3 часов.
    4. Когда OD600 культуры достигнет примерно 0,6, добавьте 2 мл IPTG (конечная концентрация: 1 мМ). Продолжайте инкубацию при 25 °C, 160 об/мин в течение 10 часов.
    5. Перенесите индуцированную культуру в предварительно взвешенную центрифужную пробирку объемом 50 мл. Центрифугировать при 4 °C и 2500 × г в течение 15 мин. Выбросьте надосадочную жидкость. Взвесьте трубку, содержащую гранулы, и вычтите вес пустой трубки, чтобы рассчитать массу гранул.
    6. Добавьте 7 мл буфера для лизиса на грамм гранулы влажных клеток. С помощью пипетки тщательно суспендируйте гранулу путем пипетирования вверх и вниз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер для лизиса (всего 10 мл) содержит 20 мМ Tris-HCl, 250 мМ NaCl, 2% Triton X-100 и ddH2O. Выполните этот этап в вытяжном шкафу, чтобы обеспечить безопасное обращение с химическими реагентами.
    7. Перенесите бактериальную суспензию в буфере для лизиса в морозильную камеру при температуре −80 °C и заморозьте на ночь. На следующий день разморозьте суспензию в шейкере при температуре 4 °C в течение 1 ч для повышения эффективности лизиса.
    8. Лизируйте клетки с помощью ультразвука при мощности 75% в течение 45 мин. Центрифугируйте лизат при 12 000 × г в течение 20 минут при 4 °C, чтобы отделить надосадочную жидкость от гранул.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если лизат остается мутным, увеличьте объем буфера для лизиса или повторите циклы замораживания-оттаивания. Также может быть добавлен ингибитор нуклеазы для сохранения целостности белка и предотвращения деградации.
    9. Осветленную надосадочную жидкость нанести вдоль стенки пробирки, содержащей приготовленную смолу для очистки белка. Промойте 10 мл элюирующего буфера, чтобы удалить неспецифически связанные белки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Элюирующий буфер содержит 20 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 250 мМ NaCl, 2% Triton X-100, 200 мМ имидазола и дистиллированную воду.
    10. Разбавьте белок FEN1, добавив 5 мл элюирующего буфера вдоль внутренней стенки пробирки.
  2. Идентификация белков-мишеней методом быстрого окрашивания бриллиантовым синим цветом
    1. Приготовьте гели SDS-PAGE с использованием 12% разделительного геля и 5% укладывающего геля в соответствии с ожидаемым размером FEN1.
    2. Смешайте образец целевого белка и стандартный BSA с буфером для образца 5× в соотношении 1:4. Нагрейте смесь до 95 °C в течение 5 минут, чтобы полностью денатурировать белки.
    3. Загрузите по 20 мкл каждого из образцов стандартного и денатурированного белка BSA в отдельные лунки геля SDS-PAGE.
    4. Подключите аппарат для электрофореза. Установите напряжение на 90 В и работайте 1 час 40 минут.
    5. После электрофореза переложите гель в емкость для окрашивания. Смойте деионизированной водой, затем добавьте 30 мл раствора для окрашивания белка и окрашивайте на 25 минут. Восстановите раствор для окрашивания, смойте гель 20 мл деионизированной воды и обесцвечивайте в течение ночи на горизонтальном шейкере.
    6. После обесцвечивания поместите гель на прозрачную пластиковую пластину и наблюдайте за белковыми полосами под белым светом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если полосы слабые или концентрация белка низкая, сконцентрируйте образец с помощью ультрафильтрационных пробирок. На этом этапе удаляется избыток растворителя и мелких молекул, улучшая концентрацию белка и обеспечивая точный анализ в последующих экспериментах.

2. Препарат ДНК-меченого субстрата FEN1 TAMRA

  1. Препарат ДНК-меченого субстрата TAMRA
    1. Проектируйте олигонуклеотидные цепи ДНК на основе специфической активности расщепления FEN1, ссылаясь на опубликованные методы17 (см. Таблицу 1). 5'-конец последовательности D1 модифицируют флуоресцентной меткой TAMRA.
    2. Добавьте смешанные одноцепочечные олигонуклеотиды ДНК в 10 мкл отжигающего буфера в следующих объемах: 5 мкл D1 (10 пмоль/мкл), 10 мкл T1 (10 пмоль/мкл) и 7,5 мкл U2 (10 пмоль/мкл). Добавьте деионизированную воду, чтобы довести общий объем до 50 μл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер для отжига содержит 100 мМ Tris-HCl (pH 7,5) и 10 мМ MgCl2.
    3. Нагрейте реакционную смесь в металлической ванне при 100 °C в течение 1 минуты, затем немедленно перенесите ее до 72 °C на 10 минут18 минут.
      Примечание: Конечный субстрат ДНК имеет длину 80 нуклеотидов. Высокая начальная температура (100 °C) обеспечивает денатурацию, а температура отжига (72 °C) способствует точному спариванию прядей.
    4. Выключите источник тепла и дайте раствору постепенно остыть до комнатной температуры, образуя полный двухцепочечный субстрат ДНК.
  2. Анализ ДНК-субстрата, меченный TAMRA
    1. Приготовьте 12% денатурирующий полиакриламидный гель, смешав 4,8 мл 30% акриламида (29:1), 4,32 мл 6 М мочевины, 2,4 мл 5× TBE, 50 мкл 10% APS, 5 мкл TEMED и 0,48 мл деионизированной воды. Тщательно перемешайте для приготовления геля.
    2. Поместите гель в духовку при температуре 37 °C на 30 минут для застывания.
    3. Для обнаружения пипетку 2 мкл синтезированной ДНК-субстрата в 18 мкл дистиллированной воды и добавьте 7,7 мкл стоп-буфера.
    4. Для справки пипетку 2 мкл D1, меченного TAMRA, в 18 мкл дистиллированной воды и добавьте 7,7 мкл стоп-буфера.
    5. Загрузите 20 μL каждого подготовленного образца в гель и выполните электрофорез SDS-PAGE для анализа формирования субстрата ДНК.

3. Анализ активности нуклеазы FEN1

  1. Анализ активности фермента FEN1
    1. Приготовьте 20 мкл реакционной смеси, соединив 2 мкл субстрата ДНК с нуклеазой FEN1 в реакционном буфере.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Реакционный буфер состоит из 100 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 200 мМ MgCl2, 2 мМ DTT, 0,2 мг/мл BSA и деионизированной воды.
    2. Инкубировать реакционную смесь при 37 °C в металлической ванне в течение 15 минут.
    3. Завершите реакцию, добавив 20 мкл 2× завершающего буфера.
    4. Загрузить 20 мкл прореагировавшего образца на заранее приготовленный 12% денатурирующий полиакриламидный гель и провести электрофорез при напряжении 100 В в течение 60 мин.
    5. После электрофореза визуализируйте результаты с помощью системы флуоресцентной визуализации (путь 600).

4. Скрининг низкомолекулярных ингибиторов нуклеазы FEN1

  1. Скрининг низкомолекулярных ингибиторов
    1. С помощью пипетки переведите 2 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
    2. Добавьте в пробирку 2 мкл нуклеазы FEN1 и 10 мкл 2× реакционного буфера.
    3. Тщательно перемешайте и выдержите смесь на льду в течение 10 минут.
    4. Добавьте 2 μL подложки ДНК и 4 μL деионизированной воды, тщательно перемешайте, чтобы довести общий объем реакции до 20 μL.
    5. Готовят рабочий разведитель ингибитора нуклеазы FEN1, FEN1-IN-4, выполняя двукратное серийное разведение 1 М стокового раствора в ДМСО.
    6. Пипетка 2 мкл нуклеазы FEN1 (0,03 мкг/мкл) и 2 мкл разбавленного ингибитора FEN1-IN-4 в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Добавьте 10 мкл 2× реакционного буфера и 4 мкл деионизированной воды. Аккуратно перемешайте и выдерживайте на льду в течение 10 минут, чтобы обеспечить достаточное взаимодействие между ингибитором и ферментом.
    7. Добавьте в пробирку 2 мкл субстрата ДНК, чтобы получить конечную реакционную смесь объемом 20 мкл.
    8. Инкубировать реакцию при 37 °C в металлической ванне в течение 15 минут.
    9. Завершите реакцию, добавив 20 мкл 2× завершающего буфера.

5. Оценка ингибирующей активности низкомолекулярного ингибитора FEN1--IN-4

  1. С помощью микропипетки возьмите 10 мкл 2× реакционного буфера и добавьте его в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
  2. Добавьте 2 мкл нуклеазы FEN1 в концентрации 0,03 мкг/мкл, а также 2 мкл ингибитора FEN1 FEN1-IN-4 в другой концентрации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Множественные градиенты концентрации должны быть установлены в соответствии с экспериментальными требованиями.
  3. Добавьте 4 мкл деионизированной воды и тщательно перемешайте раствор. Поместите микроцентрифугу объемом 1,5 мл на лед и инкубируйте в течение 10 минут.
  4. Добавьте в пробирку 2 мкл двухцепочечного субстрата ДНК, чтобы получить реакционную систему объемом 20 мкл.
  5. Поместите пробирку EP в металлическую ванну с температурой 37 °C на 15 минут.
  6. После завершения реакции добавьте 20 мкл 2× стоп-буфера в реакционную смесь, чтобы завершить реакцию.
  7. Наблюдайте за результатами с помощью устройства флуоресцентной визуализации и постройте кривую IC50 19.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количественное определение интенсивности флуоресценции проводили с использованием Fiji/ImageJ20 с последующим статистическим анализом и визуализацией с помощью программного обеспечения для построения графиков и анализа21.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Как показано на рисунке 2A, окрашивающий реагент связывается с белком, в результате чего белок появляется в виде синей полосы на геле. Первая полоса содержит меченый белок, используемый в качестве эталона молекулярной массы, в котором стандартная полоса белка BSA соответствует молекулярной массе 70 кДа, а полоса белка нуклеиновой кислоты FEN1 соответствует молекулярной массе 45 кДа. Результаты эксперимента показали, что нуклеаза FEN1 выглядела в виде прозрачной полосы примерно при 45 кДа, чт...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ активности нуклеазы FEN1 и скрининг низкомолекулярных ингибиторов занимают центральное место в исследованиях восстановления повреждений ДНК и развития рака. По сравнению с традиционными методами радиоактивного мечения, данный метод представляет собой экономичную, эффективную, простую в эксплуатации и безопасную альтернативу. Кроме того, в отличие от флуоресцентных взрывных анализов FEN1, этот подход обеспечивает более интуитивную визуализацию расщепления субстрата, тем самым позво...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Инновационной исследовательской группой по науке и технологиям Высшего учебного заведения Цзянсу (2021 г.), Программой Исследовательского центра инженерных технологий Профессионального колледжа Цзянсу (2023 г.), Ключевой технологической программой технологических проектов по обеспечению средств к существованию народа Сучжоу (SYWD2024099), Проектом Государственной ключевой лаборатории радиационной медицины и защиты Университета Сучжоу (GZK12023013), Программами Профессионального медицинского колледжа Сучжоу (SZWZYTD202201, SZWZYTD202205) и проект Цин-Лань провинции Цзянсу в Китае (2021, 2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1 м Tris-HCLБейотимСТ774
30% Acr-Bis (29:1)БейотимST003-500мл
5М NaclБейотимСТ347
BeyoBlue PlusБейотимP0003S
БЛ21(ДЭ3)-ФЕН1ВазимеС504-Ф1
БСАБейотимП0007
Шейкер для обесцвечиванияКилин-БеллТС-100
DL-дитиотреитолБейотимСТ041
Инкубатор для сухой ванныЖУЙЧЭНDH200
Аппарат для электрофорезаБэй цзин Люи БиотехнологииДДИ-6Д
ФЕН1-В-4ТаргетМОЛТ8545
ИПТГТакаба9030
Канамицин СлуфатБиошарпБС152
Лабораторная центрифугаТермоСЛ 16Р
LB БульонСоларбиоЛ8291
Ni-NTA His Bind Смола7se биотехPANF001-001С
ФК «Одиссей»ОДИССЕЯЛИТИЙ-КОР
SDS-СТРАНИЦАБейотимП0015Л
Триион-х-100СюаньеС15022

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Xu, S., et al. Novel cell-virus-virophage tripartite infection systems discovered in the freshwater lake Dishui Lake in Shanghai, China. J Virol. 94 (11), e00149(2020).
  2. Mougari, S., Sahmi-Bounsiar, D., Levasseur, A., Colson, P., La Scola, B. Virophages of giant viruses: An update at eleven. Viruses. 11 (8), 733(2019).
  3. Paez-Espino, D., et al. Diversity, evolution, and classification of virophages uncovered through global metagenomics. Microbiome. 7 (1), 157(2019).
  4. Zheng, L., et al. Functional regulation of FEN1 nuclease and its link to cancer. Nucleic Acids Res. 39 (3), 781-794 (2011).
  5. Yang, F., Hu, Z., Guo, Z. Small-molecule inhibitors targeting FEN1 for cancer therapy. Biomolecules. 12 (7), 946(2022).
  6. Wang, Z., et al. Inhibition of FEN1 promotes DNA damage and enhances chemotherapeutic response in prostate cancer cells. Med Oncol. 40 (8), 242(2023).
  7. Abdel-Fatah, T. M., et al. Genomic and protein expression analysis reveals flap endonuclease 1 (FEN1) as a key biomarker in breast and ovarian cancer. Mol Oncol. 8 (7), 1326-1338 (2014).
  8. Guo, E., et al. FEN1 endonuclease as a therapeutic target for human cancers with defects in homologous recombination. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (32), 19415-19424 (2020).
  9. Zhao, E., Zhou, C., Chen, S. Flap endonuclease 1 (FEN1) as a novel diagnostic and prognostic biomarker for gastric cancer. Clin Res Hepatol Gastroenterol. 45 (1), 101455(2021).
  10. Finger, L. D., et al. The 3'-flap pocket of human flap endonuclease 1 is critical for substrate binding and catalysis. J Biol Chem. 284 (33), 22184-22194 (2009).
  11. Liu, R., Qiu, J., Finger, L. D., Zheng, L., Shen, B. The DNA-protein interaction modes of FEN-1 with gap substrates and their implication in preventing duplication mutations. Nucleic Acids Res. 34 (6), 1772-1784 (2006).
  12. McWhirter, C., et al. Development of a high-throughput fluorescence polarization DNA cleavage assay for the identification of FEN1 inhibitors. J Biomol Screen. 18 (5), 567-575 (2013).
  13. Dorjsuren, D., Kim, D., Maloney, D. J., Wilson, D. M. 3rd, Simeonov, A. Complementary non-radioactive assays for investigation of human flap endonuclease 1 activity. Nucleic Acids Res. 39 (2), e11(2011).
  14. Van Pel, D. M., et al. An evolutionarily conserved synthetic lethal interaction network identifies FEN1 as a broad-spectrum target for anticancer therapeutic development. PLoS Genet. 9 (1), e1003254(2013).
  15. Tumey, L. N., et al. The identification and optimization of a N-hydroxy urea series of flap endonuclease 1 inhibitors. Bioorg Med Chem Lett. 15 (2), 277-281 (2005).
  16. Tang, Y., Wei, W., Liu, Y., Liu, S. Fluorescent assay of FEN1 activity with nicking enzyme-assisted signal amplification based on ZIF-8 for imaging in living cells. Anal Chem. 93 (11), 4960-4966 (2021).
  17. Liu, S., et al. fragment maturation involves α-segment error editing by the mammalian FEN1/MutSα functional complex. EMBO J. 34 (13), 1829-1843 (2015).
  18. Zheng, L., Dai, H., Qiu, J., Huang, Q., Shen, B. Disruption of the FEN-1/PCNA interaction results in DNA replication defects, pulmonary hypoplasia, pancytopenia, and newborn lethality in mice. Mol Cell Biol. 27 (8), 3176-3186 (2007).
  19. Hilda, S., et al. Alginate-based 3D cell culture technique to evaluate the half-maximal inhibitory concentration: An in vitro model of anticancer drug study for anaplastic thyroid carcinoma. Thyroid Res. 14 (1), 10(2021).
  20. Nadine, S. Microstructure analysis of polymer amended fluid fine tailings using Fiji-ImageJ image analysis software. , Carleton University Theses and Dissertations. (2022).
  21. Pablo, T. Quantifications figures 2-6 & supplemental fig. 1 (GraphPad Prism 8.1 files). Figshare. , (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи