Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оптимизированный рабочий процесс для итеративного отбеливания расширяет возможности мультиплексной визуализации высокоавтофлуоресцентных клинических образцов

1.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67980

⸱

11 июля 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Critical Care Medicine and Pulmonary Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Lymphocyte Biology Section and Center for Advanced Tissue Imaging, Laboratory of Immune System Biology, NIAID, NIH, 3Leica Microsystems Inc., 4T Lymphocyte Biology Section, Laboratory of Parasitic Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Disease, National Institutes of Health

В этой статье

Краткое содержание

Реализация недорогого, универсального метода фотооблучения с помощью ручного метода КОЗЫРЬ позволяет получить оптимальную визуализацию тканей человека со значительной нативной автофлуоресценцией. В этом протоколе подробно описывается, как получить мультиплексные изображения целиком предметного стекла из архивных клинических образцов с помощью инвертированного микроскопа, широко доступных реагентов и программного обеспечения с открытым исходным кодом для выравнивания и обработки изображений.

Аннотация

Распространенность легочных заболеваний, вызванных нетуберкулезными микобактериями (НТМ), растет во всем мире. Несмотря на то, что НТМ-индуцированное заболевание легких часто проявляется бронхоэктазами, узелками в легких и полостными заболеваниями, реакция организма, связанная с этими различными моделями повреждения легких, не была хорошо описана in situ. Мы стремились оценить механизмы НТМ-индуцированной патологии путем проведения глубокого фенотипического анализа популяций иммунных клеток в легочной ткани у лиц с заболеванием НТМ в сравнении с золотым стандартом гранулематозного воспаления, туберкулезного (ТБ) заболевания легких.

Фиксированные формалином, залитые парафином (FFPE) легочные блокады пациентов с диссеминированным NTM, легочным NTM или легочным туберкулезом были разделены и окрашены после модифицированной версии метода визуализации Iterative Bleaching Extends multi-pleXity (IBEX). Оптимизация метода IBEX в первую очередь потребовалась для решения проблемы значительной эндогенной флуоресценции участков легких из-за высокой плотности коллагена, эластина и эритроцитов, присущих легочной ткани, которая ухудшается из-за сохранения FFPE и возраста блоков FFPE. В этом протоколе мы подробно описываем протокол фотооблучения и модифицированный метод извлечения антигена, который снижает автофлуоресценцию клинически архивированных образцов.

Кроме того, мы предоставляем рекомендации по проектированию панелей антител, включая общие проблемы, такие как перекрестная реактивность, потеря эпитопов после фотооблучения, спектральное перекрытие между соседними флуорофорами и низкое соотношение сигнал/шум для определенных мишеней. Для обеспечения эффективной визуализации целых срезов легочной ткани предметные стекла были визуализированы с помощью широкопольного микроскопа и обработаны с помощью программного обеспечения с открытым исходным кодом для улучшения качества изображения. В совокупности этот рабочий процесс решает важнейшую задачу, документируя, как получить мультиплексированные изображения с высоким разрешением и цельным слайдом из сложных образцов с использованием широко доступных инструментов и реагентов. Помимо количественной визуализации клинических образцов, эти методы могут быть применены к различным типам образцов для преодоления как эндогенных, так и экзогенных источников флуоресценции.

Введение

Туберкулез (ТБ) является одной из основных причин смертности, ежегодно от туберкулеза умирает около 1,3 миллионачеловек1. Несмотря на то, что туберкулез не так смертелен, в последние годы наблюдается значительный рост легочных инфекций и последующих заболеваний, вызванных нетуберкулезными микобактериями (НТМ)2. На тканевом уровне иммунный ответ хозяина на легочную инфекцию Mycobacterium tuberculosis (Mtb) хорошо изучен и включает образование гранулем, гетерогенных агрегатов лимфоцитов, дендритных клеток, макрофагов и нейтрофилов3. В то время как гранулематозное воспаление также является фундаментальной особенностью иммунитета хозяина к инфекции NTM, популяции иммунных клеток и пространственные характеристики этого ответа остаются недостаточно изученными. Получение детального представления о тканевых компонентах иммунопатологии в сравнении с заживлением ран имеет решающее значение для разработки методов лечения (например, терапии, направленной на хозяина) и профилактических (т.е. вакцин) терапевтических стратегий.

В этом исследовании наша команда имела доступ к редким архивным клиническим образцам, полученным во время резекции легкого или вскрытия у пациентов с инфекцией Mtb или NTM. Большинство из этих образцов были старше 10 лет и были сохранены в виде фиксированных формалином и залитых парафином образцов (FFPE), что ограничивает их использование гистологическими анализами. Чтобы преодолеть маркерные ограничения традиционной иммуногистохимии (ИГХ) и иммунофлуоресцентной (ИФ) визуализации, мы использовали метод Iterative Bleaching Extends multi-pleXity (IBEX), метод визуализации с открытым исходным кодом с высокой мультиплексностью 4,5. Распространение метода IBEX на образцы FFPE легких человека потребовало значительной оптимизации из-за высоких уровней эндогенной флуоресценции, что является хорошо описанным препятствием для визуализации на основе мультиплексных антител6.

Здесь мы приводим подробный протокол снижения аутофлуоресценции с помощью метода фотооблучения, оптимизированного для участков ткани FFPE легких 7,8. Важно отметить, что в описанном здесь методе используется недорогой, широко доступный световой бокс, который может быть расширен на другие образцы с высокой автофлуоресценцией. В дополнение к снижению аутофлуоресценции перед получением изображения, мы предоставляем рекомендации по проектированию панелей антител, таким как сопряжение маркеров с низкой распространенностью с яркими флуорофорными метками, оценка влияния фотооблучения на мечение антител и амплификация вторичными антителами в каналах с высокой эндогенной флуоресценцией. В среднем мы обрабатывали пять предметных стекол, соответствующих одному срезу ткани, каждый в диапазоне от 37 до 114мм2. Наконец, мы покажем, как получать изображения всего слайда с помощью широкоугольного инструмента. Таким образом, в этом протоколе описывается внедрение IBEX в архивные клинические образцы, а также предлагаются рекомендации по устранению проблем, часто возникающих при визуализации образцов с высокой автофлуоресцентностью.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Архивные срезы аутопсии и хирургической резекции легочной ткани были собраны в соответствии с протоколом 09-H-0172 (NCT00943514) «Естественная история бронхоэктазов» в лаборатории патологии Клинического центра Национального института здравоохранения. Этот протокол был одобрен IRB, и участники дали информированное согласие.

1. Автоматизированный забор антигена

ПРИМЕЧАНИЕ: Депарафинизацию и извлечение антигена проводили с использованием автоматизированной исследовательской платформы окрашивания (рис. 1). В предыдущей работе было установлено, что подход с двойным извлечением антигена, состоящий из 30 минут с раствором для извлечения эпитопа pH 6 на основе цитрата (ER1), а затем 30 минут с раствором для извлечения эпитопа pH 9 (ER2) на основе EDTA, дал наилучшие результаты иммуномаркировки для тканей FFPE9. Сопоставимые результаты могут быть получены с помощью ручной депарафинизации и двойного извлечения антигена с использованием других описанных методов и поддержки, предоставленной сообществом IBEX Imaging Community10,11.

  1. Соберите слайды и автоматизированные материалы для извлечения антигенов (обложки слайдов, система обнаружения исследований, раствор для извлечения эпитопов pH 6 на основе цитрата (ER1), раствор для извлечения эпитопов pH 9 на основе EDTA (ER2) и т. д.).
  2. Включите прибор, дайте ему инициализироваться в течение 20 минут, поместите исследовательский манипулятор в прибор и вставьте контейнеры с реагентами в нижнюю часть аппарата.
  3. Откройте программу, нажмите кнопку «Настройка слайдов », выберите «Добавить исследование» и придумайте новое имя для исследования.
  4. Выберите «Добавить слайд» и пометьте слайды нужным образом.
  5. Чтобы следовать этому протоколу, выполните протокол выпечки и депарафинизации с протоколом HIER , состоящим из 30 минут ER1 и 30 минут ER2.
  6. Распечатайте этикетки и разместите их поверх слайдов. Снимите черную подставку для слайдов с инструмента и поместите интересующие вас слайды на стойку. Поместите прозрачные крышки слайдов на каждый слайд, верните штатив для слайдов к прибору и нажмите кнопку под штативом, чтобы предложить инструменту выполнить сканирование штрихкодов слайдов.
  7. Выберите play | ok и дайте начать автоматический поиск антигенов с приблизительной продолжительностью 3 часа.

2. Мечение антител перед фотооблучением

  1. После того, как забор антигена будет завершен, погрузите предметные стекла в PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые эпитопы чувствительны к фотооблучению и разрушаются после ночного воздействия светодиода. Чувствительные эпитопы должны быть определены опытным путем, и при их обнаружении на этом этапе должна произойти иммуномаркировка этих эпитопов. Убедитесь, что предметное стекло всегда остается влажным после забора антигена.
  2. Снимите одну горку с PBS и высушите все излишки PBS на предметном стекле с помощью безворсовой салфетки; Будьте осторожны, не прикасайтесь к ткани. Нарисуйте границу вокруг ткани с помощью гидрофобной ручки. Повторите этот процесс для всех оставшихся слайдов. Дайте гидрофобному барьеру высохнуть в течение 10 минут.
  3. Подготовьте камеру для увлажнения слайдов, налив небольшое количество воды на дно каждой лунки. Поместите предметные стекла в камеру влажности слайдов. Отведите PBS от ткани, не касаясь непосредственно образца ткани.
  4. Добавьте 200 μL блокирующего буфера (Таблица материалов) к каждому слайду. Поместите камеру влажности Slide в ненагреваемую научную микроволновую печь с механизмом поддержания постоянной температуры.
  5. Блокируйте мечение неспецифических антител с помощью следующей программы, установленной ранее4: программа 2-1-2-1-2-1-2, где «2» обозначает 2 мин при 100 Вт , а «1» обозначает 1 мин при 0 Вт. Выполните вышеуказанную программу один раз для блокировки. Если этот инструмент недоступен, заблокируйте участки ткани (5-10 мкм) на 1 ч при 37 °C, как описано ранее5.
  6. Создать раствор для окрашивания первичных антител #1 (Цикл 1) (Таблица материалов) во время инкубации блокирующего буфера. Готовьте смеси антител в соответствии с Таблицей материалов. Осторожно перемешайте коктейль антител и уменьшите смесь антител с помощью миницентрифуги при температуре 2 680 × г в течение 30 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот окрашивающий раствор содержит 1:5000 разведения Hoechst, которого должно быть достаточно на протяжении двухтактного эксперимента. Пользователям может потребоваться титрование антител Хёхста и других антител для получения оптимальных результатов для своих тканей и конфигурации визуализации.
  7. После завершения цикла извлеките камеру Slide Moisture Chamber из микроволновой печи и удалите блокирующий буферный раствор из каждой ткани. Добавьте 200 мкл раствора для окрашивания первичных антител #1 (Цикл 1) (Таблица материалов) на каждое слайдовое стекло. Поместите камеру со слайдами обратно в микроволновую печь и запустите программу первичного антитела в течение примерно 30 минут: дважды выполните программу 2-1-2-1-2-2-1-2 для мечения первичным антителом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь 200 мкл раствора первичного антитела является приблизительной. Используйте достаточный объем раствора, чтобы покрыть всю поверхность участка ткани.
  8. После того, как этап первичного мечения антител будет завершен, промойте каждое предметное стекло 1000 мкл PBS, наклонив предметное стекло вертикально, пипетируя PBS на ткани и позволяя PBS стечь. Повторите этот шаг 3-5 раз.
  9. Отвести излишки PBS и зафиксировать предметные стекла 1% параформальдегидом (PFA) на 10 минут при комнатной температуре в камере влажности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксация PFA может маскировать эпитопы, предотвращая связывание антителами намеченных мишеней. При создании панели антител в первый раз мы рекомендуем оценить влияние щадящей фиксации (1% PFA в течение 10 мин) путем сравнения схемы мечения участков ткани, обработанных с фиксатором или без него, до иммуномечения. Если антитело чувствительно к фиксации PFA на 1%, то переместите это антитело до этапа постфиксации.
  10. Тщательно промойте предметные стекла 1 000 μл PBS 3-5x. Оставьте PBS на ткани до этапа фотооблучения.

3. Фотооблучение тканей

  1. Чтобы подготовить коробку для фотооблучения (рис. 2), приобретите светодиодную лампу мощностью 150 Вт, светодиодную лампу RGBW мощностью 40 Вт, большой пластиковый контейнер (объемом 20 галлонов [75,71 л] или более), свежий 1x PBS и чашку Петри.
  2. Поместите чашку Петри в центр лампы мощностью 150 Вт и заполните ее 1x PBS. Используйте достаточный объем для погружения слайдов в PBS. Выполняйте процесс фотооблучения в холодном помещении, чтобы свести к минимуму выделение тепла от ламп.
  3. Извлеките предметные стекла из камеры влажности слайдов и поместите их в чашку Петри, убедившись, что все слайды погружены в PBS.
  4. Поместите лампу мощностью 40 Вт прямо на чашку Петри так, чтобы источник света был обращен к горкам. Перед установкой убедитесь, что лампа мощностью 40 Вт настроена на красный свет .
  5. Включите лампы мощностью 150 Вт и 40 Вт. Накройте установку для фотооблучения крышкой пластикового контейнера. Удерживайте лампу мощностью 40 Вт на красном свете в течение 2 часов, затем переключитесь на зеленый свет с помощью прилагаемого пульта дистанционного управления на оставшиеся 16 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно проводить фотооблучение при температуре около 4 °C, чтобы предотвратить нежелательное тепловое искажение ткани предметного стекла. Точка паузы: фотооблучение может быть выполнено в течение ночи, а протокол может быть возобновлен на следующее утро.

4. Мечение антителами после фотооблучения

  1. Выньте предметные стекла из чашки Петри и погрузите их в 1x PBS в банку Coplin, коническую пробирку объемом 50 мл или ведро из системы окрашивания предметных стекол. Приготовьте раствор для окрашивания первичных антител #2 (Цикл 1) (Таблица материалов) в рекомендуемых разведениях (Таблица 1). Используйте 200 мкл раствора для каждого предметного стекла.
  2. Удалите излишки PBS с каждого отдельного предметного стекла безворсовой салфеткой, убедившись, что область вокруг ткани высушена, не касаясь самой ткани. Поместите предметные стекла в камеру влажности слайдов.
  3. Аккуратно нанесите вихревой раствор для окрашивания первичных антител #2 (цикл 1) и добавьте 200 мкл на каждое предметное стекло, убедившись, что вся ткань покрыта.
  4. Поместите камеру влажности с предметными стеклами обратно в микроволновую печь и запустите программу первичного антитела в течение примерно 30 минут, как описано в шаге 2.7
  5. Во время мечения первичных антител приготовьте раствор для окрашивания вторичных антител #1 (цикл 1) (Таблица материалов).
  6. После того, как программа микроволновой печи будет завершена, снимите камеру влажности предметного стекла и промойте каждое слайд 3-5 раз 1 000 μл 1x PBS.
  7. Удалите излишки PBS с каждого отдельного предметного стекла безворсовой салфеткой, нанесите вихревой раствор для окрашивания вторичных антител и добавьте 200 μL в каждое стекло.
  8. Поместите камеру Slide Moisture Chamber в микроволновую печь и запустите программу вторичного антитела: программу 2-1-2-1-2-2-2, где «2» обозначает 2 мин при 100 Вт, а «1» обозначает 1 мин при 0 Вт. Выполните вышеуказанную программу один раз для вторичного мечения антител.
  9. Тщательно промойте предметные стекла 3-5 раз 1 мл 1x PBS и удалите излишки PBS с каждого предметного стекла.
  10. Добавьте первичный раствор для окрашивания антител #3 (цикл 1), содержащий непосредственно конъюгированные антитела, на каждое предметное стекло. Проводите окрашивание антител с использованием микроволновой печи или альтернативы (1 ч при 37 °C), как описано в шаге 2.7.
  11. Промойте предметные стекла еще раз 3-5 раз 1 мл 1x PBS и тщательно смойте излишки PBS с каждого предметного стекла.
  12. Добавьте 30 μL монтажного материала непосредственно на каждый участок ткани и наложите покровное стекло, покрывающее весь участок ткани. Осмотрите предметное стекло на наличие пузырьков воздуха и слегка надавите на него по периметру предметного стекла. Повторите процесс для остальных слайдов.
  13. Удалите излишки монтажного материала с помощью безворсовой салфетки и используйте средство для чистки оптических линз, чтобы удалить остатки, оставшиеся на поверхности покровного стекла. Дайте всем предметным стеклам застыть в течение 10-15 минут при комнатной температуре, прежде чем выполнять получение изображения на микроскопе.

5. Настройка микроскопии и получение изображений

  1. Включите широкопольный микроскоп и источник света LED8; Запустите программное обеспечение. Выберите объектив (в данном случае сухой объектив 20x/0.8). Переведите камеру в 16-битный режим во вкладке конфигурации . Выберите необходимые каналы на основе флуорофоров, присутствующих в панелях антител (дополнительные рекомендации см. в таблице 1 ).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для рассматриваемого микроскопа указаны следующие шаги. Можно было бы использовать эквивалентный широкопольный микроскоп с сопоставимым источником света и фильтрующими кубами для возбуждения и излучения нескольких флуорофоров, а также прецизионный столик.
  2. Непосредственно перед съемкой очистите покровное стекло очистителем объектива и бумагой для объектива. Перед визуализацией визуально осмотрите покровное стекло и удалите пыль или ворсинки с поверхности. Плотно расположите предметное стекло в верхнем левом углу (или эквиваленте) сценической вставки, чтобы ткань была последовательно расположена в плоскости XY (что имеет решающее значение для выравнивания циклических изображений).
  3. Настройте параметры сбора данных, создав канал , соответствующий каждому флуорофору, входящему в панель антител. Выберите соответствующий фильтрующий куб и светодиод для каждого флуорофора. Отрегулируйте интенсивность каждого светодиода и время экспозиции для каждого канала. В таблице 1 приведен список используемых здесь настроек изображения.
  4. Перед получением изображения выберите канал Хёхста и включите параметр Связанное затенение. Используйте мастер Связанное затенение, чтобы установить это значение для выбранной цели.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе подробно описано, как выполнять целые слайдовые изображения путем получения больших сканов плитки. Связанное затенение или коррекция затенения необходимы для устранения неравномерного освещения на мозаичных изображениях.
  5. В программном обеспечении нажмите кнопку « Прямой эфир», чтобы визуализировать канал Хёхста. Используйте ручку грубого фокуса, чтобы сфокусировать участок ткани.
  6. Выберите каждый флуоресцентный канал и оцените срез ткани на предмет ожидаемого характера окрашивания для всех флуоресцентно меченых антител в цикле.
  7. Выберите «Навигатор» в программном обеспечении. Используя канал Хёхста и спиральную функцию в Navigator, нанесите на карту весь участок ткани или область интереса для изображения. Если на одном слайде будет отображаться несколько срезов ткани, повторите этот шаг, чтобы создать карту ткани с помощью Navigator.
  8. Определите ROI для отображения с помощью многоугольника, волшебной палочки или других инструментов выбора ROI в Navigator. Тщательно нарисуйте контур ткани, чтобы захватить как можно меньше плиток, необходимых для покрытия желаемой рентабельности инвестиций. Удалите лишние плитки, чтобы сократить общее время сбора.
  9. После создания ROI просмотрите и отрегулируйте настройки канала, чтобы свести к минимуму насыщение пикселей и оптимизировать соотношение сигнал/шум. Выберите таблицу поиска тепловой карты в окне отображения изображения. Цвета обозначают уровень заливки пикселей, а красный, оранжевый, желтый и белый указывают на более заметные вариации интенсивности; Синие пиксели обозначают насыщенные пиксели. Чтобы избежать потери информации и ухудшения качества изображения, уменьшите время экспозиции, чтобы свести к минимуму количество насыщенных (синих) пикселей.
  10. В приложении «Навигатор» используйте инструмент «Карта фокусировки » для создания топографической карты ткани. Устанавливайте точку карты фокусировки каждые 3-4 поля зрения для больших плиток или неровных образцов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение для сканирования больших плиток, необходимых для визуализации всего слайда. В целом, качество изображения масштабируется в зависимости от количества выбранных точек карты фокусировки; Однако этот процесс может занять довольно много времени, особенно при сканировании больших плиток.
    1. Создавайте точки карты фокусировки в том порядке, в котором они будут сканироваться микроскопом. Чтобы сопоставить порядок сканирования фрагментов микроскопа, на который указывает ссылка, выберите «Точки карты фокусировки» вдоль змеевидной траектории, которая совпадает с траекторией, используемой микроскопом.
    2. Установите первую точку карты фокусировки с помощью ручной фокусировки. Используйте автофокусировку для оставшихся точек карты фокусировки. Сядьте и посмотрите, чтобы убедиться, что выбран оптимальный фокус для каждой точки карты фокусировки. При необходимости вручную настройте точки карты фокусировки. Увеличьте диапазон, используемый для поиска каждой точки карты фокусировки для неровностей или больших тканей.
  11. Настройте обработку с использованием следующих параметров: Small Volume Computational Clearing (SVCC) с показателем преломления (RI), установленным в соответствии с монтажной средой (здесь 1.4); Прочность установлена на 98%, а размер элемента установлен на 2000 нм для мембранных маркеров или 3000 нм для ядерных маркеров. Запустите протокол вычислительной очистки во время получения изображения.
  12. Запустите сканирование плитки. Запишите номер плитки и поддерживайте постоянный ROI на протяжении всех циклов.
  13. После получения изображения объедините очищенные с помощью вычислений изображения с помощью функции «Объединение мозаики » на вкладке «Процесс » с выбранной опцией «Сглаживание ». Визуально осмотрите каждое изображение на наличие ошибок сшивки и повторите слияние мозаики с новыми параметрами, если присутствуют ошибки мозаики.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Плохо выровненные изображения будут препятствовать регистрации итеративно полученных изображений.
  14. При необходимости используйте модуль «Разделение красителей » для компенсации спектрального перелива между каналами, как описано ранее5.

6. Циклы инактивации красителя, мечения антител и получения изображения

  1. После завершения получения изображения погрузите предметные стекла в коническую пробирку объемом 50 мл со стерильным 1x PBS до тех пор, пока покровные стекла не упадут. Если покровное стекло не отпадает, проведите PBS прямо над предметным стеклом или осторожно снимите его с помощью пинцета.
  2. Приготовьте раствор боргидрида лития (LiBH4), отмерив 3-5 мг порошка в пластиковой лодке для взвешивания. Добавьте diH2O в соотношении 1:1 непосредственно в порошок (например, 3,2 мг LiBH4 и 3,2 мл diH2O) и гомогенизируйте раствор с помощью пипетки. С помощью шприца пропустите раствор через фильтр 0,2 мкм в коническую пробирку объемом 50 мл и запишите концентрацию и точное время создания раствора. Дайте раствору поинкубироваться при комнатной температуре в течение 3-5 минут, пока по всему раствору не будут видны крупные пузырьки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем использовать раствор для инактивации красителя в течение 4 часов после приготовления. ВНИМАНИЕ: Выполните следующие действия в вытяжном шкафу для химических веществ и используйте соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ). В результате этой реакции может образовываться газообразный водород, который легко воспламеняется. Важно всегда работать с небольшими дозами LiBH4 (<10 мг). Для получения дальнейших рекомендаций посмотрите обучающие видеоролики о том, как безопасно подготовить LiBH4 в базе знаний IBEX10,11.
    Замените флакон LiBH4 через 4 недели использования из-за снижения эффективности отбеливания после многократного воздействия воздуха. Мы рекомендуем покупать небольшие аликвоты LiBH4 (1 грамм).
  3. Снимите каждое слайд с замачивания 1x PBS, смойте излишки PBS безворсовой салфеткой и поместите его в камеру для увлажнения слайда.
  4. Обрабатывайте каждое непокрытое предметное стекло LiBH4 в течение 30 минут, нанося раствор пипетированием непосредственно на предметное стекло с достаточным объемом, чтобы покрыть ткань. Удалите старый раствор LiBH4 с каждого предметного стекла и обновите его новой аликвотой LiBH4 через 10 минут и 20 минут из того же исходного раствора LiBH4 .
  5. Тщательно вымойте слайды 3-5 раз с 1x PBS. Используйте быструю замену PBS, замачивая слайды на 1 минуту за стирку.
  6. Чтобы получить изображение для вычитания фона, поместите новый покровный лист на каждый слайд, как описано в шагах 4.12-4.13, и получите изображения инактивации ткани после окрашивания. Создайте новый проект для изображения с вычитанием фона и повторите шаги 5.2-5.14 для получения изображения. Изображение с использованием того же количества плиток, каналов, настроек канала и поля зрения, что и для изображения цикла 1. Сохраняйте точки карты фокусировки в тех же углах обзора, но используйте автофокус для настройки каждой точки карты фокусировки для этого нового изображения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте канал, содержащий повторяющийся реперный маркер (Hoechst), для идентификации уникальных структур (ядерных форм), присутствующих на «живом» изображении (например, на фоновом изображении с вычитанием) и на предыдущем изображении (цикл 1).
  7. Чтобы свести к минимуму неспецифические флуоресцентные сигналы от биотинилированных антител во втором цикле антител, проводят блокирование авидина и биотина.
    1. Удалите излишки PBS и нанесите блокирующий раствор авидина на каждое предметное стекло при комнатной температуре в течение 15 минут.
    2. Вымойте слайды 3-5 раз с 1x PBS и удалите излишки PBS после завершения стирки.
    3. Нанесите раствор для блокировки биотина на каждую горку при комнатной температуре в течение 15 минут и промойте слайды 3-5 раз 1x PBS, как в шаге 6.7.2.
  8. Подготовка нового блокирующего буфера, не содержащего BSA (цикл 2) (Таблица материалов) для
    Раствор для окрашивания первичными антителами #4 (цикл 2) и раствор для окрашивания вторичными антителами #2 (цикл 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти решения не потребуют бычьего сывороточного альбумина, потому что БСА может нарушить стадию блокировки авидина/биотина.
  9. Разведите первичные антитела в рекомендованных производителем концентрациях в растворе для окрашивания первичных антител #4 (цикл 2). Аккуратно смешайте этот раствор и добавьте его на каждое предметное стекло в камере влажности, убедившись, что ткань полностью покрыта первичным раствором антитела. Поместите камеру влажности с предметными стеклами в микроволновую печь и запустите программу первичного антитела в течение примерно 30 минут, как описано в шаге 2.7-2.8.
  10. Выполните мечение вторичных антител с помощью раствора для окрашивания вторичных антител #2 (цикл 2), как описано в шагах 4.6-4.9. После того, как окрашивание будет завершено, наденьте новый покровный лист на каждое предметное стекло, как описано ранее в шагах 4.12-4.13. Поместите предметное стекло обратно на предметный столик микроскопа и переместите предметное стекло так, чтобы оно находилось в той же плоскости XY для предыдущих изображений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте канал, содержащий повторяющийся реперный маркер (Hoechst) для идентификации уникальных структур (ядерных форм), присутствующих на «живом» изображении (например, цикл 2) и предыдущем изображении (цикл 1).
  11. Создайте новый проект для образа цикла 2 и повторите шаги 5.2-5.14 для получения образа цикла 2. Изображение с использованием того же количества плиток, каналов, настроек канала и поля зрения, что и для изображения цикла 1. Сохраняйте точки карты фокусировки в тех же углах обзора, но используйте автофокус для настройки каждой точки карты фокусировки для этого нового изображения. После получения изображения цикла 2 перейдите к выравниванию изображения или повторите шаги, описанные в разделе 6, для дополнительных циклов с непосредственно конъюгированными антителами. ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте канал, содержащий повторяющийся реперный маркер (Hoechst), для идентификации уникальных структур (ядерных форм), присутствующих на «живом» изображении (например, изображение цикла 2) и предыдущем изображении (цикл 1). Дополнительные циклы требуют непосредственно конъюгированных антител, поскольку IBEX не выделяет антитела.

7. Выравнивание изображения

  1. Конвертируйте необработанные изображения с микроскопа в файлы .lif в файлы .ims с помощью бесплатного конвертера файлов и обработки изображений с помощью программного обеспечения с открытым исходным кодом, как описано ранее5 и подробно описано в видеороликах на базе знаний IBEX10,11.
  2. Для каждого цикла обработки изображений отредактируйте файл и примените все необходимые шаги обработки (например, присвоение имен каналам, псевдораскраска каналов).
    1. Выполните фоновое вычитание и пороговое значение канала с помощью функций канальной арифметики, созданных для SimpleITK, чтобы уменьшить сигнал автофлуоресценции (https://niaid.github.io/imaris_extensions/XTChannelArithmetic.html).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы выполняем эти шаги для каждого изображения (например, Цикл 1, Цикл 2) перед тем, как выровнять их в одно составное изображение. Это связано с тем, что легче работать с меньшими отдельными изображениями, чем с большим комбинированным изображением.
  3. Разработайте последовательную стратегию именования для использования программного обеспечения для регистрации. Называйте каналы с помощью префикса-разделителя-постфикса (например, 'Cycle1 CD8_AF647') с пробелом в качестве разделительного символа, чтобы обозначить канал, в котором антитело против CD8 AF647 использовалось в первом цикле.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите расширение файла справки для получения дополнительной информации: https://niaid.github.io/imaris_extensions/XTRegisterSameChannel.html.
  4. После того, как все каналы будут названы соответствующим образом, запустите программу регистрации, нажмите «Расширения Imaris | СимплИТК | Аффинный.
  5. Загрузите файл .ims для каждого цикла, нажав кнопку обзора рядом с пунктом Имена файлов. Введите символ разделителя префикса имени канала. Если следуя приведенному выше примеру, введите один пробел, затем нажмите «Далее».
  6. Выберите регистрационный канал , используемый в качестве общего реперного маркера между циклами (например, Хёхста).
  7. Выберите Фиксированное изображение, изображение, к которому будут зарегистрированы другие изображения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем зарегистрироваться для участия во 2-м цикле итеративных изображений.
  8. Выберите нужный каталог для 'Output File'. Опция Начать регистрацию на разрешении будет установлена на максимальное разрешение по умолчанию, чтобы обеспечить наилучшую возможную регистрацию. Если вычислительные мощности ограничены, уменьшите этот параметр.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для описанных здесь данных (12-15 ГБ на изображение) мы использовали максимальное разрешение 5.
  9. Нажмите «Зарегистрироваться», чтобы начать. После завершения регистрации дождитесь появления кнопки «Изменить образец и сохранить объединенное изображение», нажмите на нее и дождитесь завершения индикатора выполнения.
  10. Откройте готовый выходной файл в программном обеспечении для обработки. Зарегистрированное изображение со всеми циклами и информацией о каналах будет доступно и готово к анализу или публикации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Разработка панели визуализации на основе мультиплексных антител требует значительного количества времени, усилий и ресурсов12. Эти проблемы особенно заметны при проектировании панели для архивных образцов FFPE из тканей с высокой степенью аутофлуоресценции, как описано здесь (Рисунок 1). Чтобы преодолеть эти проблемы, мы сначала определили самые яркие флуорофоры, совместимые с нашим протоколом инактивации красителя (Таблица 1). Например, сообщается, ч...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Клиническая патология легких при туберкулезе легких характеризуется некротизирующим гранулематозным воспалением. Легочная патология НТМ в основном встречается в двух различных популяциях пациентов с двумя отдельными патологическими типами: изолированное повреждение легких, характеризующееся гранулематозным воспалением с бронхиолярной облитерацией и образованием полости у иммунокомпетентных лиц, или диффузное узловое заболевание, поражающее легкие и другие органы у...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Эй Джей Ар работает в компании Leica Microsystems, Inc. Другие авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Программой внутренних исследований DIR/NIAID, NCI и NHLBI. Рисунок 1 был создан с использованием BioRender в соответствии с институциональным лицензионным соглашением с NIH.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,3% Тритон-Х-100Сигма-ОлдричТ8787Решение для блокировки буфера
1% BSAСигма-ОлдричА4503Решение для блокировки буфера
1% Fc-блок BD человекаBD Biosciences564220Fc Block необходим для буфера блокировки
Светодиодная лампа мощностью 150 ВтАмазонкаB07VH3CVSFСветодиодный источник света для фотооблучения тканей
1x PBS Gibco10010-023Решение для блокировки буфера и этапов промывки
Контейнер для хранения 20 галлоновАмазонкаB001B1C4G0Контейнер для процесса фотооблучения
Светодиодная лампа RGBW 40 Вт АмазонкаB08QFPJSMDИсточник света RGB для фотооблучения тканей
Ag85BАбкамab43019/NAАнтитела для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1.
Альфа-гладкомышечный актин DyLight 755Novus BiologicalsNBP2-345221R/NAАнтитела для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1.
Набор для блокировки авидина/биотинаАбкамАБ64212Авидин и раствор для блокирования биотина
BD Цитофикс/ЦитопермBD Biosciences554714Решение для фиксации
Раствор для депарафинизации BONDLeica BiosystemsNC0221076Решение для депарафинизации
Решение для извлечения эпитопов BOND 1Leica BiosystemsNC0235529Раствор для извлечения эпитопа pH 6 на основе цитрата (ER1)
Решение для извлечения эпитопов BOND 2Leica BiosystemsNC0235530Раствор для извлечения эпитопов pH 9 на основе ЭДТА (ER2)
Система обнаружения исследований BONDLeica BiosystemsNC0396648Автоматизированный реагент для окрашивания исследований
Морилка для исследований BOND RXLeica BiosystemsNAАвтоматизированная платформа для окрашивания исследований
Моющий раствор BONDLeica BiosystemsNC0221077Буфер для промывки
СД15BD Biosciences347420/AB_400298Антитела для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1.
CD20 eFluor 660Thermo Fisher Scientific50-0202-82/AB_11150959Антитела для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1.
CD4 Алекса Флуор 488НИР Системы DFAB8165G/AB_2728839Антитела для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1.
CD45 Фикоэритрин (ПЭ)Novus BiologicalsNBP2-34528PE/NAАнтитела для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1.
CD68 iFluor 594Каприко Биотехнологии1064135/AB_2892745Антитела для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1.
Ослиный антикозий IgG Alexa Fluor Plus 488Thermo Fisher ScientificА32814/AB_2762838Антитела для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1.
Антимышиный ослик IgG Alexa Fluor Plus AF647Thermo Fisher ScientificА32787/ AB_2762830Антитела для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1.
Антимышь для осликов IgM Alexa Fluor 488Иммуноисследования Джексона715-545-020/AB_2340844Антитела для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1.
Антикроличья добавка для осликов IgG Alexa Fluor Plus AF555Thermo Fisher ScientificА32794/AB_2762834Антитела для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1.
Система окрашивания EasyDipПредложение для новичков5300КОМПЛЕКТСистема окрашивания предметными стеклами
Фторомант-ГThermo Fisher Scientific00-4958-02Монтажный носитель
ХёхстБиотиум40046Ядерное окрашивание для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1.
Конвертер файлов Imaris x64 10.2.0Имарис Оксфорд InstrumentsБесплатный конвертер файлов
Программное обеспечение ImarisViewer x64 10.2.0Имарис Оксфорд InstrumentsБесплатное программное обеспечение для обработки изображений
Перо ImmEdgeЛаборатория «Вектор»Н-4000Гидрофобная барьерная ручка
Борогидрид лития (1 грамм)Химикаты STREM93-0397Химикат для инактивации красителя, купите небольшие аликвоты этого химиката (1 грамм)
Люмикан БиотинНИР Системы DBAF2846Антитела для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1.
Микрозащитные стеклаВВР48393-241Стеклянные крышки для слайдов
Пан-цитокератин Alexa Fluor 750Novus BiologicalsНБП2-33200АФ750/AB_2868569Антитела для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1.
Микроволновая система PELCO BioWave ProТед Пелла Инк36500-230Ненагреваемая научная микроволновая печь
PELCO SteadyTemp ProТед Пелла Инк50062Полностью автоматизированное регулирование температуры для научных микроволновых печей
СимплИТКПрограммное обеспечение с открытым исходным кодомПрограммное обеспечение для регистрации и обработки каналов
Стрептавидин Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificС11227Реагент для мечения для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1.
Широкопольный микроскопLeica MicrosystemsNAТепловизор Leica Microsystems THUNDER с источником света LED8 и программным обеспечением LAS X (3.7.1.21655). Для флуоресцентной визуализации был использован специальный четырехполосный фильтр с внешним фильтрующим колесом (PN: 11536075) и двумя дополнительными однополосными фильтрами (PN: 8118215) для получения изображения семи каналов красителя за проход. Линии возбуждения, дихроии и излучения фильтра: (1) четырехполосный куб: дихроичный при 391/32, 479/33, 554/24, 638/31, без фильтров возбуждения или излучения; (2) колесо внешнего фильтра положение 1: 434/32, положение 2: 520/40, положение 3: 585/20, положение 4: 720/60, положение 5: сквозной; (3) однополосный 1— 585/22 возбуждение, 594 дихроичное, 625/30 излучение; (4) однополосный 2— 635/20 возбуждение, 647 дихроя, 667/30 излучение.
Очиститель оптических линз ZeissАмазонкаB00GPVQVCOОчиститель объектива микроскопа
<сильные>антитела
Ag85BАбкамАБ43019Поликлональный кролик IgG, цикл 1
Альфа-гладкомышечный актин DyLight 755Novus BiologicalsНБП2-345221Р1А4/асм-1, цикл 1
CD4 Алекса Флуор 488НИР Системы DFAB8165GПоликлональный козий IgG, цикл 1
CD8 Alexa Fluor 647Биолегенда372906C8/144B, цикл 1
CD68 iFluor 594Каприко Биотехнологии1064135КП1, цикл 1
Ослиный антикозий IgG Alexa Fluor Plus 488Thermo Fisher ScientificА32814Поликлональный ослик, цикл 1
Антимышиный ослик IgG Alexa Fluor Plus AF647Thermo Fisher ScientificА32787Поликлональный ослик, цикл 1
Антикроличья добавка для осликов IgG Alexa Fluor Plus AF555Thermo Fisher ScientificА32794Поликлональный ослик, цикл 1
ХёхстБиотиум40046Ядерная маркировка, цикл 1
СД15BD Biosciences347420ММА, цикл 2
CD20 eFluor 660Thermo Fisher Scientific50-0202-82L26, цикл 2
CD45 Фикоэритрин (ПЭ)Novus BiologicalsНБП2-34528ПЭ2В11 + ПД7/26, цикл 2
Антимышь для осликов IgM Alexa Fluor 488Иммуноисследования Джексона715-545-020Поликлональный ослик, цикл 2
Люмикан БиотинНИР Системы DBAF2846Поликлональный козий IgG, цикл 2
Пан-цитокератин Alexa Fluor 750Novus BiologicalsНБП2-33200АФ750АЭ-1/АЕ-3, цикл 2
Стрептавидин Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificС11227Н/Д, цикл 2
ХёхстБиотиум40046Цикл 2
Solutions
Блокирующий буфер (цикл 1)
Тритон-Х-100Сигма-ОлдричТ87870,3% по объему
БСАСигма-ОлдричА45031% к объему
Блок BD Fc человекаBD Biosciences5642201% к объему
1x PBS Gibco10010-02397,7% по объему
<сильный>первичный раствор для окрашивания антител #1 (Цикл 1)
Блокирующий буфер (цикл 1)Смотрите вышеДоливайте до объема после добавления антител
ХёхстБиотиум400461:5000
СД8 АФ647Биолегенда3729061:10
<сильно>первичный раствор для окрашивания антител #2 (цикл 1)
Блокирующий буфер (цикл 1)Смотрите вышеДоливайте до объема после добавления антител
CD4  АФ488НИР Системы DFAB8165G1:10
Ag85BАбкамab43019/NA1:100
<сильно>вторичный раствор для окрашивания антител #1 (Цикл 1)
Блокирующий буфер (цикл 1)Смотрите вышеДоливайте до объема после добавления антител
Противокозлятник AF Plus 488Thermo Fisher ScientificА32814/AB_27628381:100
Анти-Кролик для Ослика AF Plus 555Thermo Fisher ScientificА32794/AB_27628341:100
Антимышь для осликов AF Plus 647Thermo Fisher ScientificА32787/AB_27628301:50
<сильный>первичный раствор для окрашивания антител #3 (Цикл 1)
Блокирующий буфер (цикл 1)Смотрите вышеДоливайте до объема после добавления антител
CD68 iF594Каприко Биотехнологии10641351:10
а-СМА DL755Novus BiologicalsNBP2-345221R/NA1:30
Блокирующий буфер без BSA (цикл 2) 
Тритон-Х-100Сигма-ОлдричТ87870,3% по объему
Блок BD Fc человекаBD Biosciences5642201% к объему
1x PBS Gibco10010-02398,7% по объему
<сильный>первичный раствор для окрашивания антител #4 (цикл 2)
Блокирующий буфер без BSA (цикл 2)Смотрите вышеДоливайте до объема после добавления антител
СД15BD Biosciences3474201:30
Люмикан БиотинНИР Системы DBAF28461:100
КД45 ПЭNovus BiologicalsНБП2-34528ПЭ1:20
CD20 eFluor 660Thermo Fisher Scientific50-0202-821:10
Пан-цитокератин AF750Novus BiologicalsНБП2-33200АФ7501:10
<сильно>Раствор для окрашивания вторичных антител #2 (Цикл 2)
Блокирующий буфер без BSA (цикл 2)Смотрите вышеДоливайте до объема после добавления антител
Антимышь для осликов IgM AF488Иммуноисследования Джексона715-545-020/AB_23408441:100
Стрепавидин AF594Thermo Fisher ScientificС112271:200

Ссылки

  1. Global tuberculosis report 2023. , World Health Organization. https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/373828/9789240083851-eng.pdf?sequence=1 (2023).
  2. Dahl, V. N., et al. Global trends of pulmonary infections with nontuberculous mycobacteria: A systematic review. Int J Infect Dis. 125, 120-131 (2022).
  3. Cadena, A. M., Fortune, S. M., Flynn, J. L. Heterogeneity in tuberculosis. Nat Rev Immunol. 17 (11), 691-702 (2017).
  4. Radtke, A. J., et al. Ibex: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33455-33465 (2020).
  5. Radtke, A. J., et al. Ibex: An iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues. Nat Protoc. 17 (2), 378-401 (2022).
  6. Hickey, J. W., et al. Spatial mapping of protein composition and tissue organization: A primer for multiplexed antibody-based imaging. Nat Methods. 19 (3), 284-295 (2022).
  7. Duong, H., Han, M. A multispectral led array for the reduction of background autofluorescence in brain tissue. J Neurosci Methods. 220 (1), 46-54 (2013).
  8. Nolta, N. F., Liberti, A., Makol, R., Han, M. Gelatin embedding and LED autofluorescence reduction for rodent spinal cord histology. J Neurosci Methods. 346, 108924(2020).
  9. Radtke, A. J., et al. Multi-omic profiling of follicular lymphoma reveals changes in tissue architecture and enhanced stromal remodeling in high-risk patients. Cancer Cell. 42 (3), 444-463.e10 (2024).
  10. Radtke, A. J., et al. The IBEX knowledge-base: A central resource for multiplexed imaging techniques. PLoS Biol. 23 (3), e3003070(2025).
  11. Yaniv, Z., et al. The IBEX imaging knowledge-base: A community resource enabling adoption and development of immunofluoresence imaging methods. ArXiv. , (2024).
  12. Quardokus, E. M., et al. Organ mapping antibody panels: A community resource for standardized multiplexed tissue imaging. Nat Methods. 20 (8), 1174-1178 (2023).
  13. Mcshane, P. J., Glassroth, J. Pulmonary disease due to nontuberculous mycobacteria: Current state and new insights. Chest. 148 (6), 1517-1527 (2015).
  14. Hsu, A. P., et al. Mutations in GATA2 are associated with the autosomal dominant and sporadic monocytopenia and mycobacterial infection (monomac) syndrome. Blood. 118 (10), 2653-2655 (2011).
  15. Vinh, D. C., et al. Autosomal dominant and sporadic monocytopenia with susceptibility to mycobacteria, fungi, papillomaviruses. Blood. 115 (8), 1519-1529 (2010).
  16. Filipe-Santos, O., et al. X-linked susceptibility to mycobacteria is caused by mutations in nemo impairing CD40-dependent IL-12 production. J Exp Med. 203 (7), 1745-1759 (2006).
  17. Galeotti, T., Van Rossum, G. D., Mayer, D. H., Chance, B. On the fluorescence of NAD(P)H in whole-cell preparations of tumours and normal tissues. Eur J Biochem. 17 (3), 485-496 (1970).
  18. Schneckenburger, H., Gessler, P., Pavenstadt-Grupp, I. Measurements of mitochondrial deficiencies in living cells by microspectrofluorometry. J Histochem Cytochem. 40 (10), 1573-1578 (1992).
  19. Harman, D. Lipofuscin and ceroid formation: The cellular recycling system. Adv Exp Med Biol. 266, 3-15 (1989).
  20. Brunk, U. T., Terman, A. Lipofuscin: Mechanisms of age-related accumulation and influence on cell function. Free Radic Biol Med. 33 (5), 611-619 (2002).
  21. Jung, T., Bader, N., Grune, T. Lipofuscin: Formation, distribution, and metabolic consequences. Ann N Y Acad Sci. 1119, 97-111 (2007).
  22. Sherratt, M. J. Tissue elasticity and the ageing elastic fibre. Age (Dordr). 31 (4), 305-325 (2009).
  23. Laurent, G. J. Lung collagen: More than scaffolding. Thorax. 41 (6), 418-428 (1986).
  24. Lakowicz, J. R. Principles of frequency-domain fluorescence spectroscopy and applications to cell membranes. Subcell Biochem. 13, 89-126 (1988).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Мультиплексная визуализацияавтофлуоресцентные образцыпространственная протеомикафиксированная в формалине и залитая парафином ткань легкогопротокол фотооблучениядизайн панели антителсканирование целых предметных стеколгранулематозное воспалениекартирование иммунных клеток
Оптимизированный рабочий процесс для итеративного отбеливания расширяет возможности мультиплексной визуализации высокоавтофлуоресцентных клинических образцов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.