Оптимизированный рабочий процесс для итеративного отбеливания расширяет возможности мультиплексной визуализации высокоавтофлуоресцентных клинических образцов

Summary

Реализация недорогого, универсального метода фотооблучения с помощью ручного метода КОЗЫРЬ позволяет получить оптимальную визуализацию тканей человека со значительной нативной автофлуоресценцией. В этом протоколе подробно описывается, как получить мультиплексные изображения целиком предметного стекла из архивных клинических образцов с помощью инвертированного микроскопа, широко доступных реагентов и программного обеспечения с открытым исходным кодом для выравнивания и обработки изображений.

Abstract

Распространенность легочных заболеваний, вызванных нетуберкулезными микобактериями (НТМ), растет во всем мире. Несмотря на то, что НТМ-индуцированное заболевание легких часто проявляется бронхоэктазами, узелками в легких и полостными заболеваниями, реакция организма, связанная с этими различными моделями повреждения легких, не была хорошо описана in situ. Мы стремились оценить механизмы НТМ-индуцированной патологии путем проведения глубокого фенотипического анализа популяций иммунных клеток в легочной ткани у лиц с заболеванием НТМ в сравнении с золотым стандартом гранулематозного воспаления, туберкулезного (ТБ) заболевания легких.

Фиксированные формалином, залитые парафином (FFPE) легочные блокады пациентов с диссеминированным NTM, легочным NTM или легочным туберкулезом были разделены и окрашены после модифицированной версии метода визуализации Iterative Bleaching Extends multi-pleXity (IBEX). Оптимизация метода IBEX в первую очередь потребовалась для решения проблемы значительной эндогенной флуоресценции участков легких из-за высокой плотности коллагена, эластина и эритроцитов, присущих легочной ткани, которая ухудшается из-за сохранения FFPE и возраста блоков FFPE. В этом протоколе мы подробно описываем протокол фотооблучения и модифицированный метод извлечения антигена, который снижает автофлуоресценцию клинически архивированных образцов.

Кроме того, мы предоставляем рекомендации по проектированию панелей антител, включая общие проблемы, такие как перекрестная реактивность, потеря эпитопов после фотооблучения, спектральное перекрытие между соседними флуорофорами и низкое соотношение сигнал/шум для определенных мишеней. Для обеспечения эффективной визуализации целых срезов легочной ткани предметные стекла были визуализированы с помощью широкопольного микроскопа и обработаны с помощью программного обеспечения с открытым исходным кодом для улучшения качества изображения. В совокупности этот рабочий процесс решает важнейшую задачу, документируя, как получить мультиплексированные изображения с высоким разрешением и цельным слайдом из сложных образцов с использованием широко доступных инструментов и реагентов. Помимо количественной визуализации клинических образцов, эти методы могут быть применены к различным типам образцов для преодоления как эндогенных, так и экзогенных источников флуоресценции.

Introduction

Туберкулез (ТБ) является одной из основных причин смертности, ежегодно от туберкулеза умирает около 1,3 миллиона^{человек1}. Несмотря на то, что туберкулез не так смертелен, в последние годы наблюдается значительный рост легочных инфекций и последующих заболеваний, вызванных нетуберкулезными микобактериями (НТМ)². На тканевом уровне иммунный ответ хозяина на легочную инфекцию Mycobacterium tuberculosis (Mtb) хорошо изучен и включает образование гранулем, гетерогенных агрегатов лимфоцитов, дендритных клеток, макрофагов и нейтрофилов³. В то время как гранулема....

Protocol

Архивные срезы аутопсии и хирургической резекции легочной ткани были собраны в соответствии с протоколом 09-H-0172 (NCT00943514) «Естественная история бронхоэктазов» в лаборатории патологии Клинического центра Национального института здравоохранения. Этот протокол был одобрен IRB, и участники дали информированное согласие.

1. Автоматизированный забор антигена

ПРИМЕЧАНИЕ: Депарафинизацию и извлечение антигена проводили с использованием автоматизированной исследовательской платформы окрашивания (рис. 1). В предыдущей работе было установлено, что подх....

Results

Разработка панели визуализации на основе мультиплексных антител требует значительного количества времени, усилий и ресурсов¹². Эти проблемы особенно заметны при проектировании панели для архивных образцов FFPE из тканей с высокой степенью аутофлуоресценции, как описано здесь (Рисунок 1). Чтобы преодолеть эти проблемы, мы сначала определили самые яркие флуорофоры, совместимые с нашим протоколом инактивации красителя (Таблица 1). Например, сообщается, ч.......

Discussion

Клиническая патология легких при туберкулезе легких характеризуется некротизирующим гранулематозным воспалением. Легочная патология НТМ в основном встречается в двух различных популяциях пациентов с двумя отдельными патологическими типами: изолированное повреждение легких, характеризующееся гранулематозным воспалением с бронхиолярной облитерацией и образованием полости у иммунокомпетентных лиц, или диффузное узловое заболевание, поражающее легкие и другие органы у.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,3% Тритон-Х-100	Сигма-Олдрич	Т8787	Решение для блокировки буфера
1% BSA	Сигма-Олдрич	А4503	Решение для блокировки буфера
1% Fc-блок BD человека	BD Biosciences	564220	Fc Block необходим для буфера блокировки
Светодиодная лампа мощностью 150 Вт	Амазонка	B07VH3CVSF	Светодиодный источник света для фотооблучения тканей
1x PBS	Gibco	10010-023	Решение для блокировки буфера и этапов промывки
Контейнер для хранения 20 галлонов	Амазонка	B001B1C4G0	Контейнер для процесса фотооблучения
Светодиодная лампа RGBW 40 Вт	Амазонка	B08QFPJSMD	Источник света RGB для фотооблучения тканей
Ag85B	Абкам	ab43019/NA	Антитела для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1.
Альфа-гладкомышечный актин DyLight 755	Novus Biologicals	NBP2-345221R/NA	Антитела для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1.
Набор для блокировки авидина/биотина	Абкам	АБ64212	Авидин и раствор для блокирования биотина
BD Цитофикс/Цитоперм	BD Biosciences	554714	Решение для фиксации
Раствор для депарафинизации BOND	Leica Biosystems	NC0221076	Решение для депарафинизации
Решение для извлечения эпитопов BOND 1	Leica Biosystems	NC0235529	Раствор для извлечения эпитопа pH 6 на основе цитрата (ER1)
Решение для извлечения эпитопов BOND 2	Leica Biosystems	NC0235530	Раствор для извлечения эпитопов pH 9 на основе ЭДТА (ER2)
Система обнаружения исследований BOND	Leica Biosystems	NC0396648	Автоматизированный реагент для окрашивания исследований
Морилка для исследований BOND RX	Leica Biosystems	NA	Автоматизированная платформа для окрашивания исследований
Моющий раствор BOND	Leica Biosystems	NC0221077	Буфер для промывки
СД15	BD Biosciences	347420/AB_400298	Антитела для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1.
CD20 eFluor 660	Thermo Fisher Scientific	50-0202-82/AB_11150959	Антитела для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1.
CD4 Алекса Флуор 488	НИР Системы D	FAB8165G/AB_2728839	Антитела для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1.
CD45 Фикоэритрин (ПЭ)	Novus Biologicals	NBP2-34528PE/NA	Антитела для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1.
CD68 iFluor 594	Каприко Биотехнологии	1064135/AB_2892745	Антитела для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1.
Ослиный антикозий IgG Alexa Fluor Plus 488	Thermo Fisher Scientific	А32814/AB_2762838	Антитела для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1.
Антимышиный ослик IgG Alexa Fluor Plus AF647	Thermo Fisher Scientific	А32787/ AB_2762830	Антитела для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1.
Антимышь для осликов IgM Alexa Fluor 488	Иммуноисследования Джексона	715-545-020/AB_2340844	Антитела для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1.
Антикроличья добавка для осликов IgG Alexa Fluor Plus AF555	Thermo Fisher Scientific	А32794/AB_2762834	Антитела для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1.
Система окрашивания EasyDip	Предложение для новичков	5300КОМПЛЕКТ	Система окрашивания предметными стеклами
Фторомант-Г	Thermo Fisher Scientific	00-4958-02	Монтажный носитель
Хёхст	Биотиум	40046	Ядерное окрашивание для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1.
Конвертер файлов Imaris x64 10.2.0	Имарис Оксфорд Instruments		Бесплатный конвертер файлов
Программное обеспечение ImarisViewer x64 10.2.0	Имарис Оксфорд Instruments		Бесплатное программное обеспечение для обработки изображений
Перо ImmEdge	Лаборатория «Вектор»	Н-4000	Гидрофобная барьерная ручка
Борогидрид лития (1 грамм)	Химикаты STREM	93-0397	Химикат для инактивации красителя, купите небольшие аликвоты этого химиката (1 грамм)
Люмикан Биотин	НИР Системы D	BAF2846	Антитела для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1.
Микрозащитные стекла	ВВР	48393-241	Стеклянные крышки для слайдов
Пан-цитокератин Alexa Fluor 750	Novus Biologicals	НБП2-33200АФ750/AB_2868569	Антитела для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1.
Микроволновая система PELCO BioWave Pro	Тед Пелла Инк	36500-230	Ненагреваемая научная микроволновая печь
PELCO SteadyTemp Pro	Тед Пелла Инк	50062	Полностью автоматизированное регулирование температуры для научных микроволновых печей
СимплИТК	Программное обеспечение с открытым исходным кодом		Программное обеспечение для регистрации и обработки каналов
Стрептавидин Alexa Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	С11227	Реагент для мечения для визуализации IBEX. Смотрите таблицу 1.
Широкопольный микроскоп	Leica Microsystems	NA	Тепловизор Leica Microsystems THUNDER с источником света LED8 и программным обеспечением LAS X (3.7.1.21655). Для флуоресцентной визуализации был использован специальный четырехполосный фильтр с внешним фильтрующим колесом (PN: 11536075) и двумя дополнительными однополосными фильтрами (PN: 8118215) для получения изображения семи каналов красителя за проход. Линии возбуждения, дихроии и излучения фильтра: (1) четырехполосный куб: дихроичный при 391/32, 479/33, 554/24, 638/31, без фильтров возбуждения или излучения; (2) колесо внешнего фильтра положение 1: 434/32, положение 2: 520/40, положение 3: 585/20, положение 4: 720/60, положение 5: сквозной; (3) однополосный 1— 585/22 возбуждение, 594 дихроичное, 625/30 излучение; (4) однополосный 2— 635/20 возбуждение, 647 дихроя, 667/30 излучение.
Очиститель оптических линз Zeiss	Амазонка	B00GPVQVCO	Очиститель объектива микроскопа
<сильные>антитела
Ag85B	Абкам	АБ43019	Поликлональный кролик IgG, цикл 1
Альфа-гладкомышечный актин DyLight 755	Novus Biologicals	НБП2-345221Р	1А4/асм-1, цикл 1
CD4 Алекса Флуор 488	НИР Системы D	FAB8165G	Поликлональный козий IgG, цикл 1
CD8 Alexa Fluor 647	Биолегенда	372906	C8/144B, цикл 1
CD68 iFluor 594	Каприко Биотехнологии	1064135	КП1, цикл 1
Ослиный антикозий IgG Alexa Fluor Plus 488	Thermo Fisher Scientific	А32814	Поликлональный ослик, цикл 1
Антимышиный ослик IgG Alexa Fluor Plus AF647	Thermo Fisher Scientific	А32787	Поликлональный ослик, цикл 1
Антикроличья добавка для осликов IgG Alexa Fluor Plus AF555	Thermo Fisher Scientific	А32794	Поликлональный ослик, цикл 1
Хёхст	Биотиум	40046	Ядерная маркировка, цикл 1
СД15	BD Biosciences	347420	ММА, цикл 2
CD20 eFluor 660	Thermo Fisher Scientific	50-0202-82	L26, цикл 2
CD45 Фикоэритрин (ПЭ)	Novus Biologicals	НБП2-34528ПЭ	2В11 + ПД7/26, цикл 2
Антимышь для осликов IgM Alexa Fluor 488	Иммуноисследования Джексона	715-545-020	Поликлональный ослик, цикл 2
Люмикан Биотин	НИР Системы D	BAF2846	Поликлональный козий IgG, цикл 2
Пан-цитокератин Alexa Fluor 750	Novus Biologicals	НБП2-33200АФ750	АЭ-1/АЕ-3, цикл 2
Стрептавидин Alexa Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	С11227	Н/Д, цикл 2
Хёхст	Биотиум	40046	Цикл 2
Solutions
Блокирующий буфер (цикл 1)
Тритон-Х-100	Сигма-Олдрич	Т8787	0,3% по объему
БСА	Сигма-Олдрич	А4503	1% к объему
Блок BD Fc человека	BD Biosciences	564220	1% к объему
1x PBS	Gibco	10010-023	97,7% по объему
<сильный>первичный раствор для окрашивания антител #1 (Цикл 1)
Блокирующий буфер (цикл 1)	Смотрите выше		Доливайте до объема после добавления антител
Хёхст	Биотиум	40046	1:5000
СД8 АФ647	Биолегенда	372906	1:10
<сильно>первичный раствор для окрашивания антител #2 (цикл 1)
Блокирующий буфер (цикл 1)	Смотрите выше		Доливайте до объема после добавления антител
CD4  АФ488	НИР Системы D	FAB8165G	1:10
Ag85B	Абкам	ab43019/NA	1:100
<сильно>вторичный раствор для окрашивания антител #1 (Цикл 1)
Блокирующий буфер (цикл 1)	Смотрите выше		Доливайте до объема после добавления антител
Противокозлятник AF Plus 488	Thermo Fisher Scientific	А32814/AB_2762838	1:100
Анти-Кролик для Ослика AF Plus 555	Thermo Fisher Scientific	А32794/AB_2762834	1:100
Антимышь для осликов AF Plus 647	Thermo Fisher Scientific	А32787/AB_2762830	1:50
<сильный>первичный раствор для окрашивания антител #3 (Цикл 1)
Блокирующий буфер (цикл 1)	Смотрите выше		Доливайте до объема после добавления антител
CD68 iF594	Каприко Биотехнологии	1064135	1:10
а-СМА DL755	Novus Biologicals	NBP2-345221R/NA	1:30
Блокирующий буфер без BSA (цикл 2)
Тритон-Х-100	Сигма-Олдрич	Т8787	0,3% по объему
Блок BD Fc человека	BD Biosciences	564220	1% к объему
1x PBS	Gibco	10010-023	98,7% по объему
<сильный>первичный раствор для окрашивания антител #4 (цикл 2)
Блокирующий буфер без BSA (цикл 2)	Смотрите выше		Доливайте до объема после добавления антител
СД15	BD Biosciences	347420	1:30
Люмикан Биотин	НИР Системы D	BAF2846	1:100
КД45 ПЭ	Novus Biologicals	НБП2-34528ПЭ	1:20
CD20 eFluor 660	Thermo Fisher Scientific	50-0202-82	1:10
Пан-цитокератин AF750	Novus Biologicals	НБП2-33200АФ750	1:10
<сильно>Раствор для окрашивания вторичных антител #2 (Цикл 2)
Блокирующий буфер без BSA (цикл 2)	Смотрите выше		Доливайте до объема после добавления антител
Антимышь для осликов IgM AF488	Иммуноисследования Джексона	715-545-020/AB_2340844	1:100
Стрепавидин AF594	Thermo Fisher Scientific	С11227	1:200