Тщательный и структурированный подход применяется к отбору устойчивых и чувствительных генов радиации с помощью метода полногеномного скрининга CRISPR/Cas9. Этот протокол также может послужить универсальной основой для других исследований, изучающих механизмы устойчивости к клинически вводимым химическим препаратам.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Полногеномный CRISPR-скрининг для выявления радиочувствительных и радиорезистентных генов
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Система CRISPR-Cas9 была использована и перепрофилирована в мощный инструмент редактирования генома. Используя эту технологию, исследователи могут точно вырезать, вставлять и даже переписывать последовательности ДНК в живых клетках. Тем не менее, применение технологии экранов CRISPR выходит далеко за рамки простых экспериментов. Он служит ключевым инструментом в борьбе с генетическими заболеваниями, систематически анализируя сложные генетические ландшафты, позволяя исследователям раскрывать молекулярные механизмы, лежащие в основе биологических явлений, и позволяя ученым выявлять и устранять первопричины таких заболеваний, как рак, муковисцидоз и серповидноклеточная анемия. Помимо всего прочего, рак представляет собой сложнейшую проблему для медицины, стимулируя усилия по его ликвидации. Лучевая терапия, как и традиционное лечение, дает результаты, но имеет ограничения. Он уничтожает раковые клетки, но также повреждает здоровые ткани, вызывая неблагоприятные последствия, снижающие качество жизни. Кроме того, не все раковые клетки реагируют на лучевую терапию, а некоторые могут развить резистентность, что ухудшает состояние. Для решения этой проблемы внедряется комплексная технология полногеномного скрининга CRISPR, которая позволяет эффективно идентифицировать радиочувствительные и радиорезистентные гены, тем самым продвигая область исследований и лечения рака. В клетках аденокарциномы легкого, подвергшихся облучению, был проведен полногеномный скрининг CRISPR в соответствии с описанным протоколом, с помощью которого были идентифицированы гены, ассоциированные с радиорезистентностью и радиочувствительностью.
Введение
Изучение биологических явлений неразрывно связано с изучением клеточного поведения, и, в свою очередь, изучение клеточного поведения фундаментально связано с исследованием его генома. По мере того, как современные технологии продолжают развиваться, медицинские исследователи все больше перенаправляют свое внимание на изменение клеточного поведения с помощью редактирования генов, чтобы улучшить результаты лечения различных заболеваний. В связи с этим технология кластеризованных регулярных чередующихся коротких палиндромных повторов (CRISPR) стала революционным инструментом редактирования генома благодаря своей относительно
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Реагенты и оборудование, использованные в данном исследовании, перечислены в Таблице материалов.
1. Выбор подходящей дозы облучения
- Подготовка и нанесение покрытий адгезивных клеток
- Отрегулируйте плотность клеток до 5 x 105 клеток на мл с помощью полной среды для культивирования клеток RPMI 1640, содержащей 10% FBS для прохождения и роста клеток. Распределите клетки по 3,5-сантиметровым культуральным чашкам для облучения в разных дозах. Добавьте по 2 мл (1 x 106 ячеек) в каждую чашку и инкубируйте в течение ночи при 37 °C с 5%
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Рак легких, с ведущим уровнем смертности, представляет собой очень агрессивное и распространенное заболевание. На примере клеточной линии рака легкого A549 для проведения полногеномного скрининга CRISPR с облучением в качестве условия скрининга, схематический рабочий процесс показан на рисунке 1. Во-первых, изучите чувствительность клеток A549 к различным дозам радиации посредством формирования клонов и экспериментов CCK8 (рис. 2). В клоногенном анализе количест.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Являясь передовой технологией редактирования генов, скрининг CRISPR вызвал глубокие изменения в области научных исследований5. Возникшая на основе системы CRISPR-Cas9, эта технология стала важным инструментом для изучения функций генов благодаря своей высокой эффективности иточности9. Инженерный принцип CRISPR/Cas9 включает в себя разработку и введение специфических sgРНК с примерно 20 нуклеотидами, чтобы направлять нуклеазу Cas9 на точное .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
Это исследование было поддержано Региональным проектом научно-технических инноваций провинции Хубэй (2024EIA001) и Проектом поддержки строительства платформы инноваций в области медицинской науки и технологий больницы Чжуннань Уханьского университета (PTXM2025001). Рисунок 1 был создан с помощью Figdraw.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Чашка для культивирования клеток и тканей 150 мм | Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd. | 715011 | Чашка |
| для клеточных и тканевых культур 35 мм | Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd. | 706011 | Клеточная культура |
| A549 клеточная линия | ATCC | - | - |
| Набор для подсчета клеток-8 | Shanghai Beyotime Biotech Inc | C0041 | Для анализа жизнеспособности клеток |
| CO2-независимая среда | PHCbi | MCO-50AIC | Клеточная культура |
| Countess 3 FL автоматизированный счетчик клеток | Themo Scientific | AMQAF2001 | Для подсчета клеток |
| EDTA | Gibco | 25200056 | Клеточная культура |
| Фетальная бычья сыворотка | Gibco | 10099141 | Клеточная культура |
| Флуоресцентная микроскопия | LEICA | ebq 100-04 | Для флуоресцентного микроскопа |
| Полногеномная лентивирусная библиотека CRISPR | Shanghai OBiO Technology Co., Ltd. | H5070 | Для лентивирусной инфекции |
| MiniAmp plus PCR | Themo Scientific | C37835 | Для амплификации ПЦР |
| планшеты для культивирования клеток NEST, 12-луночный | Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd. | 712002 | Планшеты |
| клеточных культур NEST, 6-луночные | Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd. | 703002 | Клеточная |
| культура NEST клеточные планшеты, 96-луночный | Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd. | 701001 | Клеточная культура |
| PBS | Gibco | C10010500BT | |
| Прямой праймер для ПЦР клеточной культуры (AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG) | Beijing AuGCT Biotech Co., Ltd. | - | Для ПЦР-амплификации |
| ПЦР обратный праймер (GATGTGCGCTCTGCCCACTGACGGGCA) | Beijing AuGCT Biotech Co., Ltd. | - | Для амплификации ПЦР |
| Polybrene | Shanghai Beyotime Biotech Inc | C0351 | Для лентивирусной инфекции |
| Puromycin | MCE | HY-K1057 | Для селекции после лентивирусной инфекции |
| RPMI 1640 среда для клеточной культуры | Gibco | 23400-021 | Клеточная культура |
| TIANGENamp набор геномной ДНК | Beijing TIANGEN Biotech Co., Ltd. | DP304 | Для экстракции геномной ДНК |
| рентгеновский порошковый дифрактометр | PerkinElmer | Для лучевой терапии |
Ссылки
- Barrangou, R., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas systems: Prokaryotes upgrade to adaptive immunity. Mol Cell. 54 (2), 234-244 (2014).
- Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12 (4), 828-8....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
