Экстракция ДНК микобактерий с помощью взбивания шариков в специальном буфере с последующим рабочим процессом NGS

Summary

Этот протокол показывает, что взбивание бусин в сочетании с очисткой шариков захвата ДНК обеспечивает быстрый и последовательный метод извлечения ДНК из образцов Mycobacterium tuberculosis , что делает его эффективным выбором для приложений секвенирования следующего поколения.

Abstract

Туберкулез является смертельно опасным заболеванием, и возникновение устойчивости к антибиотикам у возбудителя бактерии Mycobacterium tuberculosis ухудшает результаты лечения. Точная и быстрая идентификация лекарственной устойчивости с помощью технологий секвенирования необходима для улучшения результатов лечения пациентов с туберкулезом с помощью адаптированных терапевтических схем. Метод экстракции ДНК имеет решающее значение для последующих молекулярных анализов и осложняется жесткой клеточной стенкой Mycobacterium, низкой бациллярной нагрузкой многих клинических образцов и сложностью матрицы мокроты. Существует множество методов экстракции ДНК M. tuberculosis , но в настоящее время не существует золотого стандарта. Кроме того, лишь немногие из этих методов показали стабильную эффективность, и многие из них не подходят для стран с ограниченными ресурсами и тяжелым бременем туберкулеза. Следовательно, лаборатории часто вносят свои собственные модификации процедур, что приводит к значительной вариативности методов. В данной статье мы представляем экономически эффективный, быстрый и стандартизированный протокол экстракции ДНК микобактерий как из клинической мокроты, так и из культуры, которая позволяет получить ДНК, пригодную для количественной ПЦР, и которую следует рассмотреть для использования в лабораториях клинической диагностики.

Introduction

Извлечение высококачественной ДНК из M. tuberculosis необходимо для выявления лекарственно-устойчивого туберкулеза (ТБ) с помощью целевого секвенирования нового поколения (NGS) и полногеномного секвенирования (WGS), но часто упускается из виду. Мы разработали стандартизированный протокол для обеспечения согласованной высококачественной ДНК для клинических применений NGS, включая целевые подходы к NGS, такие как Deeplex-MycTB (GenoScreen) и секвенирование всего генома, которые в настоящее время рекомендуются Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) для диагностики лекарственно-устойчивого туберкулеза. Примечательно, что, х....

Protocol

Это исследование было проведено в Калифорнийском университете в Сан-Франциско (UCSF) с одобрения Институционального комитета по биобезопасности (BUA #BU198320-01GBUA/BABB) и соответствует рекомендациям UCSF по этике исследований. Мы получили образцы остаточной мокроты, собранные компанией Discovery Life Sciences в соответствии с одобренным IRB протоколом отказа от согласия, от лиц с респираторными заболеваниями, не связанными с туберкулезом.

1. Подготовка буферов

1. Специальный буфер Triton (Таблица 1): Чтобы приготовить 100 мл индивидуального буфера Triton, начните с смешивания 2 мл 5 M NaCl, 1 мл....

Results

Мы протестировали протокол экстракции ДНК на образцах мокроты с шипами M. tuberculosis и M. tuberculosis (n = 3 для каждого состояния). Используя культивируемый M. tuberculosis H37Rv mc² 7901, мы стандартизировали ввод до 8,4 x 10⁶ клеток на 50 μл, что эквивалентно 1 мл культуры MGIT при 200 GU. Для экспериментов с мокротой мы вводили 1 мл мокроты, собранной от людей с респираторными заболеваниями, не связанными с туберкулезом (полученной коммерчески) с двумя различными бактериальным.......

Discussion

В этой работе мы представляем надежный, валидированный протокол экстракции высококачественной ДНК M. tuberculosis с использованием бидинга с магнитной очисткой гранул для последующих молекулярных и NGS-приложений.

Этот метод имеет ряд преимуществ по сравнению с существующими протоколами экстракции ДНК M. tuberculosis . В то время как традиционная экстракция фенол-хлороформа обычно занимает несколько дней и содержит опасные химические вещества.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,1 мм Циркониевые силикатные шарики	Продукты Biospec	11079101з	Бусины, используемые для взбивания бусин на этапе лизиса клеток микобактерий
Бусины AMPure XP	Бекман Коултер	А63880	Магнитные шарики для очистки ДНК после лизиса
ЭДТА (0,5 М, pH 8,0)	Thermo Fisher Scientific	AM9260G	Пользовательские компоненты буфера Triton / Low EDTA
Фастпреп 24	MPbio, США	116004500	Оборудование для взбивания бусин со скоростью 6,5 м/с
Форвард Праймер	Thermo Fisher Scientific	Пользовательский синтез	Последовательность праймеров: AATTCCTGGTGTAGCGGTGG
H2O (Вода, класс молекулярной биологии)	Thermo Fisher Scientific	БП2819-1	Пользовательские компоненты буфера Triton / Low EDTA
Универсальный зонд Luna	Биолаборатории Новой Англии	М3004	реагент для количественной ПЦР для подсчета ДНК микобактерий
Набор MycoPrep	БД	Артикул/ССЫЛКА 240863	Разложение образцов BD MycoPrep для переработки мокроты NALC-NaOH
NaCl (хлорид натрия, 5М раствор)	Thermo Fisher Scientific	АМ9759	Пользовательские компоненты буфера Triton / Low EDTA
ПБС	Миллипора Сигма	П2272	Отработка мокроты
Обратный праймер	Thermo Fisher Scientific	Пользовательский синтез	Последовательность грунтовки: GTTTACGGCGTGGACTACCA
Зонд TaqMan	Thermo Fisher Scientific	Пользовательский синтез	Последовательность датчиков: AGGAGGAACACCGGTGGCGA
Tris-HCl (1M, pH 8,0)	Thermo Fisher Scientific	AM9855G	Пользовательские компоненты буфера Triton / Low EDTA
Тритон Х-100	Thermo Fisher Scientific	28314	Пользовательские компоненты буфера Triton / Low EDTA