Экстракция ДНК микобактерий с помощью взбивания шариков в специальном буфере с последующим рабочим процессом NGS

Summary

Этот протокол показывает, что взбивание бусин в сочетании с очисткой шариков захвата ДНК обеспечивает быстрый и последовательный метод извлечения ДНК из образцов Mycobacterium tuberculosis , что делает его эффективным выбором для приложений секвенирования следующего поколения.

Abstract

Туберкулез является смертельно опасным заболеванием, и возникновение устойчивости к антибиотикам у возбудителя бактерии Mycobacterium tuberculosis ухудшает результаты лечения. Точная и быстрая идентификация лекарственной устойчивости с помощью технологий секвенирования необходима для улучшения результатов лечения пациентов с туберкулезом с помощью адаптированных терапевтических схем. Метод экстракции ДНК имеет решающее значение для последующих молекулярных анализов и осложняется жесткой клеточной стенкой Mycobacterium, низкой бациллярной нагрузкой многих клинических образцов и сложностью матрицы мокроты. Существует множество методов экстракции ДНК M. tuberculosis , но в настоящее время не существует золотого стандарта. Кроме того, лишь немногие из этих методов показали стабильную эффективность, и многие из них не подходят для стран с ограниченными ресурсами и тяжелым бременем туберкулеза. Следовательно, лаборатории часто вносят свои собственные модификации процедур, что приводит к значительной вариативности методов. В данной статье мы представляем экономически эффективный, быстрый и стандартизированный протокол экстракции ДНК микобактерий как из клинической мокроты, так и из культуры, которая позволяет получить ДНК, пригодную для количественной ПЦР, и которую следует рассмотреть для использования в лабораториях клинической диагностики.

Introduction

Извлечение высококачественной ДНК из M. tuberculosis необходимо для выявления лекарственно-устойчивого туберкулеза (ТБ) с помощью целевого секвенирования нового поколения (NGS) и полногеномного секвенирования (WGS), но часто упускается из виду. Мы разработали стандартизированный протокол для обеспечения согласованной высококачественной ДНК для клинических применений NGS, включая целевые подходы к NGS, такие как Deeplex-MycTB (GenoScreen) и секвенирование всего генома, которые в настоящее время рекомендуются Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) для диагностики лекарственно-устойчивого туберкулеза. Примечательно, что, хотя ВОЗ рекомендует эти диагностические стратегии на основе NGS, она не указывает конкретные протоколы экстракции ДНК для их поддержки. Наш метод может быть использован как с одобренными ВОЗ тестами, так и с новыми технологиями, требующими высококачественной ДНК микобактерий.

Проблема экстракции связана с уникальной клеточной стенкой M. tuberculosis, состоящей из миколовых кислот и липидов, которые делают его исключительно трудным для вскрытия. Опубликованные в настоящее время решения для экстракции имеют значительные различия в методах лизиса (например, ультразвуковая, химическая, тепловая и биговка) и экстракции ДНК (например, фенол-хлороформная экстракция, осаждение этанола, методы на основе CTAB и методы на основе колонок и шариков), что приводит к различиям в выходе, чистоте и качестве ДНК 1,2,3,4,5,6,7,8 ^,9,10,11,12,13,14,15,16. Кроме того, исследовательские группы редко используют один и тот же метод экстракции ДНК и часто измеряют успех по-разному. Это затрудняет определение того, какой метод работает лучше всего, поскольку оптимальный подход зависит от типа молекулярного применения. Например, для определения структурных вариантов M. tuberculosis в мокроте с помощью длинного секвенирования требуется более качественная ДНК и более точная полимераза, чем использование платного диагностического инструмента, нацеленного только на небольшую область rpoB. Несколько факторов еще больше осложняют успех экстракции ДНК. Количество ДНК, которое мы можем извлечь, зависит от типа образца, количества присутствующих бактерий и наличия веществ (коэкстрагированных немикобактериальных ДНК и ингибиторов ПЦР), которые мешают процессу. Даже технические аспекты, такие как то, насколько точно лаборант использует пипетки, могут повлиять на результаты. Современные методы часто не справляются с обработкой образцов с низкой бактериальной нагрузкой или высоким уровнем контаминирующей ДНК, которые обычно встречаются в клинических условиях 17,18,19.

Взбивание швов в пользовательском буфере с последующим протоколом очистки швов имеет ключевые преимущества по сравнению с другими методами. Это простой и быстрый рабочий процесс, который снижает вероятность вариаций, зависящих от оператора, и поддерживает целостность ДНК для последующих приложений секвенирования нового поколения. Этот стандартизированный подход особенно подходит клиническим лабораториям, которым нужны надежные, воспроизводимые результаты с использованием рекомендованных ВОЗ анализов лекарственной устойчивости NGS и всех приложений WGS.

Protocol

Это исследование было проведено в Калифорнийском университете в Сан-Франциско (UCSF) с одобрения Институционального комитета по биобезопасности (BUA #BU198320-01GBUA/BABB) и соответствует рекомендациям UCSF по этике исследований. Мы получили образцы остаточной мокроты, собранные компанией Discovery Life Sciences в соответствии с одобренным IRB протоколом отказа от согласия, от лиц с респираторными заболеваниями, не связанными с туберкулезом.

1. Подготовка буферов

1. Специальный буфер Triton (Таблица 1): Чтобы приготовить 100 мл индивидуального буфера Triton, начните с смешивания 2 мл 5 M NaCl, 1 мл 1 M Tris-HCl (pH 8), 1 мл Triton X-100 и 0,2 мл 0,5 M этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Добавьте сверхчистую воду, чтобы довести общий объем до 100 мл. Фильтр простерилизовать перед использованием. Конечный буфер содержит 100 мМ NaCl, 10 мМ Tris-HCl, 1 мМ ЭДТА и 1% Тритон Х-100.
2. Low EDTA TE (Таблица 2): Чтобы приготовить 100 мл буфера с низким содержанием EDTA TE, смешайте 1 мл 1M Tris-HCl (pH 8) и 0,02 мл 0,5 M EDTA. Добавьте сверхчистую воду, чтобы довести общий объем до 100 мл. Конечный буфер содержит 10 мМ Tris-HCl и 0,1 мМ ЭДТА.

2. Подготовка лизисных трубок

1. С помощью лезвия скальпеля аккуратно отрежьте дно трубки с завинчивающейся крышкой объемом 1,5 мл чуть ниже точки перегиба.
2. Отрежьте кончик от кончика P1000, разрежьте V-образный клин возле конца и вклините в него подготовленное дно трубки с завинчивающейся крышкой. Диаграмма совка приведена на рисунке 1 .
3. Наполните стерильный контейнер (например, резервуар или чашку Петри) 0,1 мм циркониевыми силикатными шариками и с помощью подготовленной мерной ложки распределите одну мерную ложку шариков (~200 мг) по пробиркам с завинчивающейся крышкой объемом 1,5 мл.

Иллюстрация 1: Совок для распределения шариков на месте. Совок был разработан для легкой передачи ~200 мг циркониевых шариков 0,1 мм в технологические трубы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

3. Подготовка входных данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Вся подготовка образцов должна проводиться в соответствии с протоколами биобезопасности вашего предприятия. Мы настоятельно рекомендуем работать с инфекционными материалами внутри шкафа биобезопасности класса II (BSC), чтобы свести к минимуму риск воздействия аэрозоля.

1. Бактериальная клеточная культура
   1. Центрифуга ~ 5 мл культуры M. tuberculosis (либо MGIT, либо мутная жидкая культура) в конической центрифужной пробирке объемом 15 мл с максимальной скоростью (≥ 3000 x g) в течение 10 мин.
   2. С помощью серологической пипетки объемом 10 мл осторожно удалите все, кроме ~ 500 мкл надосадочной жидкости, не нарушая гранулу. Удалите остатки надосадочной жидкости с помощью пипетки P1000, не повреждая гранулу.
   3. Повторно суспендируйте гранулу в 350 μл специального буфера Triton путем пипетирования вверх и вниз. При необходимости (например, для извлечения образцов для обработки вне BSL-3) деактивируйте образец в соответствии со стандартными операционными процедурами.
2. Приготовление мокроты
   1. Перелейте 1-5 мл образца мокроты (спонтанной или индуцированной) в стерильную центрифужную пробирку объемом 50 мл.
3. Сжижение DTT
   1. Добавьте четыре объема 100 мМ дитиотреитола в образец мокроты (объем может варьироваться). При использовании коммерческого реагента следуйте инструкциям производителя по разбавлению.
   2. Тщательно завихрить в течение 30 с. Выдерживать при комнатной температуре (20-25 °C) в течение 7 минут. Снова вихрь на 30 с.
   3. Повторите шаги 3.3.1. и 3.3.2. 1х, для очень вязких образцов, выполнять до 5 инкубационно-вихревых циклов.
   4. Центрифуга на максимальной скорости (≥ 3 000 x g) в течение 10 мин. Используя серологическую пипетку объемом 10 мл, осторожно выбросьте все надсадочную жидкость, кроме ~ 500 μл. Удалите остатки надосадочной жидкости с помощью пипетки P1000, не повреждая гранулу.
   5. Повторно суспендируйте гранулу в 350 μл специального буфера Triton.
4. Сжижение NALC-NaOH
   1. Для приготовления раствора NALC-NaOH следуйте инструкциям производителя по приготовлению и разбавлению.
   2. Добавьте четыре объема раствора NALC-NaOH в образец мокроты (спонтанной или индуцированной, объем может варьироваться).
   3. Вихрь за 30 с. Выдерживать при комнатной температуре (20-25 °C) в течение 7 минут. Повторите шаги 3.4.1 и 3.4.2. 1х. Для очень вязких образцов выполняют до 5 инкубационно-вихревых циклов.
   4. Добавьте PBS к отметке 50 мл. Вихрь коротко перемешать. Центрифуга на максимальной скорости (≥ 3 000 x g) в течение 10 мин.
   5. Используя серологическую пипетку объемом 50 мл, осторожно удалите все, кроме ~ 500 мкл надосадочной жидкости. Удалите остатки надосадочной жидкости с помощью пипетки P1000, не повреждая гранулу.
   6. Повторно суспендируйте гранулу в 350 μл специального буфера Triton. При необходимости (например, для извлечения образцов для обработки вне BSL-3) деактивируйте образец в соответствии со стандартными операционными процедурами.

4. Экстракция ДНК

1. Перенесите инактивированную бактериальную суспензию (350 мкл с этапа 3) в новую хорошо маркированную пробирку с завинчивающейся крышкой объемом 1,5 мл, содержащую ~250 мкл 0,1 мм циркониевых силикатных шариков.
2. Бисер взбивал лизат со скоростью 6,5 м/с в течение 45 с с 2-минутным отдыхом между пробежками. Повторите в общей сложности три цикла взбивания бисера.
3. Центрифугируйте на максимальной скорости (≥ 12 000 x g) в течение 2 мин и перенесите 150 мкл надосадочной жидкости в новую хорошо маркированную пробирку. Следите за тем, чтобы не перенести гранулы или клеточный мусор.
4. Дайте очищаемым магнитным шарикам уравновеситься до комнатной температуры в течение 30 минут и тщательно переведите вихрь, чтобы обеспечить полную ресуспендию перед использованием.
5. Добавьте 180 μл (в 1,2 раза больше объема) очищающих магнитных шариков и перемешайте, пипетируя вверх и вниз в 10 раз. Выдерживать при комнатной температуре в течение 2 минут.
6. Поместите на магнитную решетку и подождите, пока раствор рассеется ~ 2 минуты. С помощью пипетки P200 осторожно выбросьте надосадочную жидкость, не потревожив магнитные шарики.
7. Не снимая трубку с магнитной решеткой, добавьте 500 μл свежеприготовленного этанола с содержанием 70 % (v/v) и распределите по противоположной стенке трубки на магнитные шарики. Подождите 30 с.
8. Повторите шаги 4.5. - 4.7. Всего две промывки. По окончании последней промывки удалите остатки этанола с помощью пипетки P10. Кратко подсушите бусины в течение ~ 2 минут.
9. Сразу после того, как гранула шарика станет непрозрачной, извлеките трубку из магнитного штатива и снова суспендируйте в 20 мкл трис-буфера с низким содержанием ЭДТА. Не допускайте, чтобы бусины стали сухими и потрескавшимися.
10. Перемешайте с помощью пипетирования или вортексинга, чтобы убедиться, что все шарики находятся в растворе. Выдерживать при комнатной температуре в течение 5 минут.
11. Поместите на магнитную решетку и подождите, пока раствор станет прозрачным в течение ~2 мин. Перенесите элюированную ДНК в новую хорошо помеченную пробирку для последующего анализа. Аспират <20 мкл экстрагированной ДНК для предотвращения переноса магнитных шариков.

5. Количественное ПЦР-перечисление ДНК микобактерий

1. Для количественного определения ДНК микобактерий с помощью количественной ПЦР, нацеленной на 99 нуклеотидов микобактериального атпЕ (Rv1305), соберите на льду реакционную смесь объемом 10 мкл для каждого образца, содержащую 5 мкл универсальной мастер-смеси зонда (2x), по 0,4 мкл прямого праймера (5'-AATTCCTGGTGTAGCGGTGG-3', 10 μM) и обратного праймера (5'-GTTTACGGCGTGGACTACCA-3', 10 μM), 0,2 мкл зонда TaqMan (5'-VIC-AGGAGGAACACCGGTGGCGA-MGB-3', 10 мкМ), 2 мкл матрицы ДНК и 2 мкл воды, не содержащей нуклеаз (табл. 3).
2. Реакцию запускают в следующих условиях термоциклирования: начальная денатурация при 95 °C в течение 60 с, затем 35 циклов при 95 °C в течение 10 с и 60 °C в течение 30 с (с захватом в этом случае со скоростью нарастания 2,11 °C/с; Таблица 4).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае кПЦР проводили с использованием анализа TaqMan с зондом, меченным VIC, на системе QuantStudio 3 Real-Time PCR System.
3. Прогоните все сэмплы, стандарты и элементы управления в технических трех экземплярах. Построение стандартных кривых с использованием серийных разведений очищенной ДНК M. tuberculosis . Выполняйте относительный количественный анализ с помощью аналитического программного обеспечения.
4. Экспортируйте полученные относительные количественные значения в формат CSV и визуализируйте с помощью R Studio (версия 2024.09.1+394) для создания ящичковых диаграмм, сравнивающих выходы ДНК по методам экстракции.

Results

Мы протестировали протокол экстракции ДНК на образцах мокроты с шипами M. tuberculosis и M. tuberculosis (n = 3 для каждого состояния). Используя культивируемый M. tuberculosis H37Rv mc² 7901, мы стандартизировали ввод до 8,4 x 10⁶ клеток на 50 μл, что эквивалентно 1 мл культуры MGIT при 200 GU. Для экспериментов с мокротой мы вводили 1 мл мокроты, собранной от людей с респираторными заболеваниями, не связанными с туберкулезом (полученной коммерчески) с двумя различными бактериальным...

Discussion

В этой работе мы представляем надежный, валидированный протокол экстракции высококачественной ДНК M. tuberculosis с использованием бидинга с магнитной очисткой гранул для последующих молекулярных и NGS-приложений.

Этот метод имеет ряд преимуществ по сравнению с существующими протоколами экстракции ДНК M. tuberculosis . В то время как традиционная экстракция фенол-хлороформа обычно занимает несколько дней и содержит опасные химические вещества...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,1 мм Циркониевые силикатные шарики	Продукты Biospec	11079101з	Бусины, используемые для взбивания бусин на этапе лизиса клеток микобактерий
Бусины AMPure XP	Бекман Коултер	А63880	Магнитные шарики для очистки ДНК после лизиса
ЭДТА (0,5 М, pH 8,0)	Thermo Fisher Scientific	AM9260G	Пользовательские компоненты буфера Triton / Low EDTA
Фастпреп 24	MPbio, США	116004500	Оборудование для взбивания бусин со скоростью 6,5 м/с
Форвард Праймер	Thermo Fisher Scientific	Пользовательский синтез	Последовательность праймеров: AATTCCTGGTGTAGCGGTGG
H2O (Вода, класс молекулярной биологии)	Thermo Fisher Scientific	БП2819-1	Пользовательские компоненты буфера Triton / Low EDTA
Универсальный зонд Luna	Биолаборатории Новой Англии	М3004	реагент для количественной ПЦР для подсчета ДНК микобактерий
Набор MycoPrep	БД	Артикул/ССЫЛКА 240863	Разложение образцов BD MycoPrep для переработки мокроты NALC-NaOH
NaCl (хлорид натрия, 5М раствор)	Thermo Fisher Scientific	АМ9759	Пользовательские компоненты буфера Triton / Low EDTA
ПБС	Миллипора Сигма	П2272	Отработка мокроты
Обратный праймер	Thermo Fisher Scientific	Пользовательский синтез	Последовательность грунтовки: GTTTACGGCGTGGACTACCA
Зонд TaqMan	Thermo Fisher Scientific	Пользовательский синтез	Последовательность датчиков: AGGAGGAACACCGGTGGCGA
Tris-HCl (1M, pH 8,0)	Thermo Fisher Scientific	AM9855G	Пользовательские компоненты буфера Triton / Low EDTA
Тритон Х-100	Thermo Fisher Scientific	28314	Пользовательские компоненты буфера Triton / Low EDTA