Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

В пробирке Ударная модель для создания сублетального повреждения хондроцитов в эксплантах хрящевой ткани крупного рогатого скота

950 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68061

⸱

27 июня 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Weldon School of Biomedical Engineering, Purdue University, 2Indiana Center for Musculoskeletal Health, Indiana University School of Medicine, 3School of Mechanical Engineering, Purdue University, 4Department of Orthopaedic Surgery, Indiana University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Чтобы лучше понять реакцию хондроцитов на повреждение хондроцитов на механическую перегрузку хряща, в протоколе описывается разработка модели удара хряща ex vivo , которая была сублетальной в течение 24 часов.

Аннотация

Посттравматический остеоартрит (ПТОА) — это распространенное, дегенеративное и болезненное прогрессирующее заболевание суставов, которое обычно возникает после значительной травмы суставов и затрагивает более 6 миллионов американцев. Травма хряща, вызванная ударом, приводит к реакции на повреждение хондроцитов, которая завершается PTOA. Понимание молекулярных событий, связанных с повреждением хондроцитов, необходимо для разработки методов лечения для предотвращения PTOA или замедления его прогрессирования. Чтобы облегчить эту задачу, была разработана модель воздействия хряща ex vivo , которая была сублетальной в течение 24 часов. Остеохондральные экспланты были собраны из пястных суставов крупного рогатого скота, а для доставки ударных нагрузок к эксплантам использовалась откидная башня. Чтобы убедиться, что напряжение и удар были приложены к суставному хрящу относительно равномерно, экспланты располагались поверхностью кости вверх, а кость подвергалась воздействию сверху. Различные нагрузки прикладывались к эксплантам с высоты каретки 4,0 см, 4,5 см и 5,0 см, в результате чего средние пиковые напряжения составляли 10,87 ± 1,84 МПа, 11,69 ± 0,67 МПа и 12,98 ± 0,75 МПа соответственно. В исследовании была проанализирована роль присутствия субхондральной кости в хрящевой ткани во время культивирования после удара и эффект использования подогнанного или свободного держателя во время удара, оценка жизнеспособности клеток и апоптоза. Суставной хрящ, пораженный с высоты 4,5 см, в сочетании с подогнанным держателем и немедленным удалением кости, обеспечил оптимальную модель для индуцирования повреждения хряща с минимальной гибелью клеток через 24 часа после удара.

Введение

Посттравматический остеоартрит (ПТОА) – это изнурительное заболевание, которым страдают более 5 миллионов взрослых в Соединенных Штатах1. Однократное травматическое воздействие на хрящ может вызвать реакцию на повреждение хондроцитов, что приведет к раннему появлению симптомов и пожизненной борьбе с болью в суставах и дисфункцией2. Хрящ практически не обладает внутренней способностью к восстановлению, и, таким образом, существует неудовлетворенная потребность в разработке методов лечения для изменения прогрессирования заболевания3. Поскольку PTOA коррелирует с одним, четко определенным травматическим событием, есть возможность вмешаться до того, как болезнь прогрессирует. Тем не менее, разработка этих методов лечения затруднена пробелом в знаниях о молекулярной сигнализации, которая регулирует реакцию хондроцитов на повреждение и приводит к посттравматическому остеоартриту 2,3,4. Лучшее понимание молекулярных событий после повреждения хондроцитов может помочь в разработке новых терапевтических методов лечения, которые спасают реакцию на повреждение хондроцитов и предотвращают или задерживают развитие PTOA 2,5,6.

Чтобы лучше понять молекулярную сигнализацию повреждения хондроцитов, в предыдущих исследованиях использовались башни или аналогичные устройства, которые механически воздействуют на хрящевые экспланты, чтобы инициировать реакцию на повреждение. В этих исследованиях была предпринята попытка охарактеризовать многие аспекты этой реакции, включая изменения в механических свойствах и структуре 7,8, повреждение матрицы и синтез 6,9,10,11, митохондриальную дисфункцию 12,13,14,15, пути переноса ионов 16,17,18.19, и экспрессия генов 9,11,20,21,22,23. Тем не менее, во многих из этих исследований жизнеспособность клеток либо не сообщалось, либо была нарушена, при этом жизнеспособность клеток составляла 50% или ниже в некоторых исследованиях 24,25,26. Искажающие эффекты низкой жизнеспособности клеток могут затруднить изучение реакции на повреждение. Гибель хондроцитов, которая следует сразу за травмой сустава, необратима, но методы лечения, которые лечат повреждение хондроцитов, смягчают последующий PTOA27. Для того, чтобы идентифицировать молекулярные изменения, которые связаны с повреждением хондроцитов, а не с потерей жизнеспособных клеток, необходима модель воздействия хряща, которая поддерживает жизнеспособность хондроцитов в течение определенного периода времени. Кроме того, воздействие на хрящ, которое вызывает реакцию хондроцитов на повреждение хряща, которая относительно однородна по всей хрящевой ткани, обеспечит наиболее последовательные результаты при анализе поведения клеток.

Цель исследования состояла в том, чтобы разработать и охарактеризовать экономически эффективную модель ударной травмы ex vivo для суставного хряща, которая сохраняет способность изучать сигнальные пути, присущие реакции на острое повреждение хряща. Кроме того, такая модель может быть использована для оценки потенциальных методов лечения для восстановления реакции на травму. Чтобы достичь этого, мы сначала разработали стерильную технику забора хрящевых эксплантов из пястно-фаланговых суставов крупного рогатого скота у зрелых животных с использованием алмазного сверла, установленного на сверлильном станке. Пястно-фаланговые суставы выбрасываются на скотобойне, когда животные перерабатываются для употребления в пищу, что делает этот сустав легкодоступным и недорогим источником тканей. Затем мы создали модель ударной травмы, в которой остеохондральный образец был помещен в держатель под устройством откидной башни. В этой модели остеохондральные образцы были размещены суставной поверхностью вниз на зеркально отполированной поверхности из нержавеющей стали #8, а кость подвергалась воздействию сверху, доставляя относительно равномерную нагрузку на хрящевую ткань. Определены параметры удара, которые сохраняют жизнеспособность хондроцитов в течение 24 ч после удара, но при этом все еще вызывают ответ на молекулярное повреждение апоптоза. Держатели, которые допускали различное боковое движение образца во время удара, были оценены на предмет их влияния на жизнеспособность клеток и апоптоз; Наконец, был оценен эффект удаления хряща из субхондральной кости после удара.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Использование конечностей крупного рогатого скота, полученных на местной скотобойне, не требовало этического одобрения, так как ткани были собраны после смерти животных, обработанных для употребления в пищу.

1. Сбор урожая остеохондрального экспланта

  1. Стерилизуйте следующие материалы с помощью автоклава перед сбором урожая экспланта: буферный фосфатный раствор (PBS; примерно 1 л на сустав), сверло для отбора керна, адаптер для поворота воды, одну автоклавируемую промывочную бутылку, одну рукоятку скальпеля, два щипца и одно лезвие для аутопсии при вскрытии.
  2. Установите колпак для культуры тканей с помощью сверлильного станка и тиски внутри бассейна для хранения PBS. Соберите сверло для отбора керна и поворотный адаптер в сверлильном станке и подсоедините насадку поворотного адаптера со шлангом к тележке, наполненной стерилизованным PBS. Соберите пилу для вскрытия и поместите ее внутрь капота (рисунок 1A-B).
  3. Разложите одноразовые подкладки стопкой в капюшоне для культуры тканей, по одной на каждый сустав.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подкладки впитывают PBS и синовиальную жидкость, которая может капать при раскрытии сустава. Укладка нескольких подкладок позволяет легко снять верхний слой, когда он становится слишком влажным, обеспечивая чистое и сухое рабочее место на протяжении всей процедуры.
  4. Подготовьте одну пробирку объемом 50 мл, содержащую 70% этанола, и другую пробирку объемом 50 мл, содержащую 0,13% v/v бетадина, в PBS, и поместите их в колпак. Поместите щипцы и ручку скальпеля в пробирку с этанолом для поддержания стерильности при работе с тканями и поместите стерильную 6-луночную пластину для культивирования клеток в заднюю часть капюшона.
  5. Приготовьте 3 мл среды для культивирования клеток на каждый предполагаемый образец. Питательная среда состоит из модифицированной среды Eagle's Medium (DMEM) с 0,9 мМ пирувата натрия, инсулина, трансферрина и селена (ITS), 50 мг/мл L-аскорбиновой кислоты, заменимых аминокислот с минимальным содержанием незаменимой среды (MEM), пенициллина, стрептомицина и амфотерицина B. Добавьте L-аскорбиновую кислоту и ITS в день применения28.
  6. Получите передние ноги крупного рогатого скота от взрослых скелетов животных на местной скотобойне в течение 6 часов после жертвоприношения. Держите салфетки на льду во время транспортировки.
  7. Изолируйте пястно-фаланговый сустав, удалив копыто с помощью ленточной пилы для мяса, не вскрывая капсулу сустава. Удалите кожу с помощью лезвий скальпеля #22, не прокалывая капсулу сустава.
  8. Тщательно промойте каждую ногу снаружи шкафа биобезопасности холодной водой, чтобы удалить грязь, и нанесите покрытие бетадином для дезинфекции.
  9. Внутри капюшона для культуры тканей откройте капсулу для сустава с помощью нового лезвия скальпеля #22. Изолируйте дистальный сустав и увлажните суставной хрящ с помощью PBS из бутылки для мытья (Рисунок 1C). Накройте суставной хрящ стерильной марлей, смоченной PBS, для поддержания увлажненности.
  10. Далее изолируйте дистальный пястно-фаланговый сустав, разрезав плюсневую кость с помощью пилы для аутопсии (рис. 1D). Поместите дистальный сустав в тиски покрытым хрящом вверх и затяните до упора. В течение всего процесса регулярно смачивайте марлю на хряще PBS.
  11. Отогните марлю от одного мыщелка и отрегулируйте положение тисков так, чтобы сверло для отбора керна находилось над самой плоской областью суставной поверхности (рисунок 1E).
  12. Откройте клапан carboy, чтобы PBS мог пройти через коронку. Используйте промывочную бутылку для постоянного увлажнения ткани с помощью PBS и охлаждения образцов во время сверления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: PBS от тележки и промывочной бутылки оказывает охлаждающее действие в процессе отбора керна.
  13. Медленно вдавливайте керн в мыщелок, вдавливая сверло в поверхность мыщелка. Часто сбрасывайте давление и дайте теплу рассеяться. Продолжайте до тех пор, пока глубина отбора керна не составит примерно 2 мм в субхондральную кость. Повторите для каждой стороны (рисунок 1E).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Признаки перегрева включают быстрое испарение жидкости или запах гари.
  14. Используйте пилу для аутопсии для освобождения костно-хрящевых ядер, разрезая кость параллельно поверхности суставного хряща, продолжая выдавливать PBS из промывочной бутылки на стык пилы для аутопсии и костно-хрящевой кости во время резки. Во время этого шага поддерживайте увлажненную марлю на поверхности суставного хряща, чтобы избежать обезвоживания.
  15. Храните костно-хрящевые ядра (рис. 1F) в разбавленном растворе бетадина (см. шаг 1.3) до тех пор, пока не будут обработаны все суставы.
  16. Остеохондральные ядра промывают в PBS и переносят образцы в отдельные лунки стерильного 6-луночного планшета, содержащего 3 мл предварительно подогретых питательных сред (DMEM с 0,9 мМ пирувата натрия, инсулин-трансферрин-селен (ITS), 50 мг/мл L-аскорбиновой кислоты, заменимых аминокислот, пенициллина, стрептомицина и амфотерицина B)28. Храните образцы в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C с 5%CO2 до процедуры воздействия на следующий день.

2. Остеохондральное воздействие экспланта

  1. Изготовьте ударный держатель из нержавеющей стали с зеркально отполированной ударной поверхностью (дополнительный рисунок 1 и дополнительный рисунок 2) и просверлите соответствующие отверстия в опорной плите башни (дополнительный рисунок 3).
  2. Перед ударом в автоклаве стерилизуются следующие материалы: сферическая ударная головка из нержавеющей стали диаметром 15 мм, держатель из нержавеющей стали с зеркально отполированной ударной поверхностью, 4 винта 6/32, 4 шайбы, щипцы.
  3. Поместите откидную башню, которая была ранее спроектирована и изготовлена29, в шкаф биобезопасности. Для этого исследования используйте откидную башню со сферической ударной головкой диаметром 15 мм, установленную на каретке, оборудованной тензодатчиком и акселерометром (рис. 2А), с общей массой каретки 358,4 г.
  4. Закрепите держатель на опорной плите башни с помощью четырех автоклавных винтов (Рисунок 2B). В данном исследовании были испытаны держатели с круглыми отверстиями диаметром 8,7 мм и 9,1 мм.
  5. Поместите остеохондральный сердечник в держатель (дополнительный рисунок 1, дополнительный рисунок 2, дополнительный рисунок 3) под ударную головку башни так, чтобы кость была обращена вверх.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для более однородной нагрузки было выбрано размещение костно-хрящевого ядра костью вверх и суставной поверхностью вниз30.
  6. Отрегулируйте каретку откидной башни на желаемую высоту относительно верхней части кости. Определите примерную высоту сбрасываемой башни по опытным исследованиям. В этом исследовании оценивали рост 4,0, 4,5 и 5,0 см.
  7. Нажмите кнопку « Пуск » в программном обеспечении для сбора данных (файл дополнительного кодирования 1) непосредственно перед тем, как отпустить каретку башни, освободив упор шпинделя (рис. 2A) и позволив ударной головке упасть под действием силы тяжести на образец. Немедленно поднимите каретку и положите ее на упор шпинделя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время удара данные будут собираться на частоте 100 кГц с помощью программного обеспечения для сбора данных, подключенного к модулю сбора данных, который регистрирует сигналы от тензодатчика, расположенного между головкой ударного элемента и кареткой, а также от акселерометра. Несмотря на то, что мы поднимаем каретку как можно скорее после удара, она не имеет функции защиты от отскока или другого механизма, предотвращающего повторный удар.
  8. Поместите файл .txt, сгенерированный программным обеспечением для сбора данных, в ту же папку, что и код анализа данных Matlab (Файл дополнительного кодирования 2, также доступен по адресу https://github.com/sogol-younesi/cartilage-impact-analysis) и запустите код анализа данных для фильтрации исходных данных и расчета параметров воздействия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Код анализа данных использует толщину хряща 0,563 мм для расчета энергии удара. Она была определена как средняя толщина хряща, взятая из > 50 мест на каждом из пяти образцов в отдельном исследовании с использованием методаиглы 31 и механического тестера Biomomentum Mach-1. Параметры удара рассчитываются в соответствии с ранее описанным32.
  9. Удалите хрящ из кости с помощью лезвия скальпеля #11, если это необходимо. Верните образец в среду и увлажненный инкубатор при температуре 37 °C с 5%CO2 до получения изображения на следующий день.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании оценивался эффект удаления хряща из кости сразу после удара или через 24 часа после удара.

3. Характеристика жизнеспособности клеток в образцах хряща

  1. При необходимости удалите хрящи из кости. Разрежьте образец хряща пополам острым скальпелем. Избегайте выполнения многократных надрезов; Стремитесь к одному разрезу, чтобы обеспечить гладкий край.
  2. Погрузите каждую интересующую половину образца в раствор, состоящий из 5 мкМ гомодимера этидия и 2,5 мкМ кальциена AM в PBS. Беречь от света и выдерживать при комнатной температуре в течение 30 минут до полного окрашивания живых умерших.
  3. Промойте образцы PBS 2x и храните образцы в PBS до визуализации. Изображение как можно скорее после завершения окрашивания.
  4. Поставьте образец хряща вертикально на несколько капель PBS в чашку для микроскопии так, чтобы полный полукруг был виден с передней части микроскопа. Получение изображений с помощью инвертированного конфокального микроскопа. Слегка согните хрящ щипцами, если он не может самостоятельно стоять в вертикальном положении.
  5. Используя FIJI, дистрибутив ImageJ с входящими в комплект плагинами33, сначала преобразуйте изображение в 8-битное, нажав на Image > Type > 8-бит. Затем установите пороговое значение в разделе «Изображение» > «Настроить порог> и нажмите «Применить».  Затем выполните функцию Watershed в разделе Process > Binary и запустите Analyze Particles... в разделе Анализ для зеленого и красного каналов. Анализируйте изображения, полученные на постоянной z-высоте для каждого образца, для точного сравнения между группами.
  6. Рассчитайте жизнеспособность клеток, разделив количество живых клеток на общее количество клеток в образце.

4. Характеристика апоптоза в образцах хряща

  1. Погрузите каждую интересующую половину образца в 8 мкМ реагент Caspase-3/7 Green Detection в PBS. Беречь от света и выдерживать при температуре 37 °C в течение 30 минут.
  2. Промойте образцы PBS 3x. Зафиксируйте окрашенные образцы путем инкубации в 4% параформальдегиде (PFA) в течение 15 минут. Снова вымойте с PBS и храните в PBS до получения изображений. Изображение в течение 24 часов после окрашивания.
  3. Изображение с помощью конфокального микроскопа (см. шаг 3.4 выше). Для корректного сравнения интенсивности флуоресценции между группами поддерживайте согласованные параметры изображения для всех образцов, включая линзу объектива, мощность возбуждающего лазера, усиление детектора фотоумножителя, размер точечного отверстия, толщину оптического среза, скорость сканирования, усреднение линий и разрешение изображения.
  4. Используя расширение ImageJ для FIJI, выберите Среднее значение серого в меню Анализ > Установка измерений....
  5. Используйте инструмент «Разрез многоугольника», чтобы обвести всю область образца, показанного на изображении. Выполните функцию Измерить в меню Анализ и запишите среднее значение серого, используя одни и те же параметры обработки в группах.
  6. Используйте инструмент Сечение полигона, чтобы выбрать область изображения, которая не содержит образец, и снова выполните функцию Измерить. Запишите это в качестве среднего значения серого фона.
  7. Рассчитайте интенсивность флуоресценции путем вычитания фонового среднего значения серого из образца среднего серого.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Механическую воздействующую нагрузку на остеохондральные экспланты прикладывали с помощью башни-откидной башни с высотой каретки 4,0 см, 4,5 см и 5,0 см над тканью (n = 3 или 4). Увеличение высоты каретки до ее отпускания приводило к увеличению ударных сил, средних пиковых напряжений, скоростей нагружения и энергий удара (Таблица 1).

Мы стремились разработать модель повреждения хряща ex vivo , которая была бы сублетальной в течение 24 ч после удара. Определение характ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Цель данного исследования состояла в том, чтобы охарактеризовать и оптимизировать модель воздействия хряща, которая не ставит под угрозу жизнеспособность клеток, для изучения молекулярных событий после повреждения хондроцитов с конечной целью разработки лечения, которое спасает поврежденные клетки для предотвращения прогрессирования PTOA. Для достижения этой цели механическая нагрузка доставлялась на костную часть остеохондральных ядер, перенося нагрузку на хрящевую ткань. Кроме того, мы...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано грантом NIH NIAMS R21 AR080255. Авторы хотели бы поблагодарить Кевина Карра за предоставление своего опыта в области механической обработки и изготовления для этого проекта. Авторы выражают признательность Mooresville Butcher Shop (Мурсвилль, штат Индиана) за предоставление тканей для этого исследования. Авторы благодарят сотрудников Центра биологической микроскопии штата Индиана за помощь в проведении конфокальной микроскопии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
#11 стерильное лезвие скальпеляThermo Fisher Scientific10-001-823Удалить хрящ из кости
#22 стерильное лезвие скальпеляThermo Fisher Scientific10-001-833Удалить кожу с тканей крупного рогатого скота и открыть сустав разрезанием связок
10-1000 мкл наконечников пипетокThermo Fisher Scientific02-707-411Измерить и передать  PBS, питательные среды и другие решения 
200-дюймовый этанолThermo Fisher Scientific03-007-647Используется для приготовления 70% этанола в качестве стерилизующего агента для дезинфекции хирургических инструментов и поддержания стерильной среды во время подготовки и обработки тканей.
Центрифужная пробирка объемом 50 мл (стерильная)Thermo Fisher Scientific339652Используется для хранения сред и образцов
5-галлонный контейнерThermo Fisher Scientific04-355-233Стерильный контейнер PBS, который подключается к поворотному адаптеру с помощью шланга.
6-луночный планшет (стерильный)Thermo Fisher Scientific140685Используется для временного хранения остеохондральных ядер в стерильной среде с предварительно подогретыми средами во время сбора, инкубации перед исследованиями удара и визуализации
АкселерометрKistler8743A5Используется для измерения ускорения, создаваемого во время удара
Набор для окрашивания апоптоза (CellEvent)Thermo Fisher ScientificC10423Используется для обнаружения и визуализации апоптотических клеток
Автоклавируемые промывочные бутылкиNalgene2405-0500Заполните стерильным PBS для увлажнения хряща во время забора тканей.
Пила для аутопсииMopecBD 810Удалите лишнюю кость либо после вскрытия сустава, либо после извлечения остеохондрального ядра
Полотно для аутопсии MopecBD 101Используется для разрезания кости с целью выделения и высвобождения остеохондральных эксплантов.
БетадинАврио Хелс Л..н/дИспользуется для дезинфекции наружных образцов крупного рогатого скота перед перемещением их в капюшон и разбавляется для дезинфекции окончательных остеохондральных образцов.
Прозрачный шланг длиной 4 футан/д н/дИспользуется для подключения 5-литровой тележки, содержащей PBS, к поворотному адаптеру сверлильного станка для транспортировки PBS.
Буровое долото для отбора керна UKAM Industrial Superhard Tools3EDCD7160Используется для извлечения остеохондральных эксплантов из кости путем сверления в суставной хрящ и субхондральную кость.-  диаметр сверла: 7/16" (гальванические алмазные корончатые сверла)
Серповидный ключMcMaster Carr5362A1Используется для затяжки зажима (который удерживает соединение на месте) и затяжки сверла для отбора керна   
Одноразовые серологические пипеткиThermo Fisher Scientific13-678-11Измерение и перенос PBS и питательных сред
Одноразовая пеленкаThermo Fisher Scientific23-666-062Используется для покрытия противовеса для поглощения воды и жидкостей во время сбора урожая для большего удобства и гигиены
Одноразовые вакуумные фильтрующие установкиThermo Fisher ScientificSCGP00525Filter PBS и другие решения
Сверлильный станок   WEN433TV 3,25-дюймовыйПрикладывайте усилие для сверления остеохондральных образцов- WEN 433TV 3,25-дюймовый настольный
сверлильный станок промышленной прочности Угол наклона тискиWENTV434Фиксирует остеохондральные образцы в фиксированном положении под нужным углом в процессе отбора керна.
Откидная башняизготовлена на заказн/дИспользуется для воздействия на образцы
FIJI (ImageJ Extension)н/дн/дПрограммное обеспечение используется для обработки и анализа микроскопических изображений, включая определение жизнеспособности клеток и апоптоза
ЩипцыFisherbrand12-000-163Используется для разрезания ткани в капюшоне, вскрытия сустава и переноса образцов
Марля (стерильная)Dukal6412Используется для увлажнения суставного хряща после вскрытия суставной капсулы
Стеклянная 1-литровая медиа-бутылкаSigma AldrichCLS13951LHTCИспользуется для хранения стерильных PBS 
ПерчаткиThermo Fisher Scientific19-130-1597DИспользуются для защиты команды сбора
инсулин-трансферрин-селен (ITS)Gibco41400-045Медиа добавка
LabVIEW программное обеспечение для сбора данныхNational Instrumentsn/aЗахватывает данные с тензодатчика и акселерометра во время испытаний на удар для последующего анализа.
L-аскорбиновая кислотаMerckA4403Медиадобавка
Лазерный конфокальный сканирующий микроскопOlympusFV1000DИспользуется для получения трехмерных изображений окрашенных образцов тканей с высоким разрешением.
Набор для окрашивания живых и мертвых клетокThermo Fisher ScientificL3224Используется для дифференциации живых и мертвых клеток в образцах тканей для оценки жизнеспособности клеток
ТензодатчикKistler9712B5000Используется для измерения силы, приложенной во время удара.
МАТЛАБ Компания MathWorks Inc.н/а
Ленточная пила для мясаSkymsenMSKLEУдаление запястного копыта из образцов крупного рогатого скота
Микропипетка 10-100 мклThermo Fisher ScientificFBE00100Измерение и перенос  PBS и питательные среды
Минимальная незаменимая среда (MEM) раствор заменимых аминокислотGibco11140-050Добавка к среде
Modified Eagle' s Medium (DMEM)Gibco10566-016Остеохондральная эксплантная культура.
Пенициллин-стрептомицинThermo Fisher Scientific15-140-148Медиа добавка
Фосфат буферизованный физиологический растворThermo Fischer ScientificBP399-20Используется для полоскания, увлажнения и охлаждения тканей для поддержания физиологических условий, предотвращения обезвоживания и приготовления окрашивающих растворов
Держатель образца на башнеизготовленный по индивидуальному заказун/дОбеспечивает защиту остеохондрального ядра во время удара.
Рукоятка скальпеля Thermo Fisher Scientific16-100-107Используется для точной резки, рассечения тканей и вскрытия сустава.
Винты (добавить в CAD)6-32 резьба Размер-18-8 Нержавеющая сталь Винты с торцевой головкой
Пируват натрияGibco11360-070Медиа добавка
Сферическая ударная головкаMcMaster Carr9292K52Автоклав перед процедурой удара
Хирургические маскиФильтрующаямаска 375101Используется для защиты сборной команды
Поворотный адаптер для воды UKAM Industrial Superhard Tools7035812подключается к буровому долоту для обеспечения непрерывного потока PBS для охлаждения во время процесса бурения.
, ,

Ссылки

  1. Thomas, A. C., Hubbard-Turner, T., Wikstrom, E. A., Palmieri-Smith, R. M. Epidemiology of Posttraumatic Osteoarthritis. J Athletic Training. 52 (6), 491(2017).
  2. Dilley, J. E., Bello, M. A., Natoli, R. M., McKinley, T. O., Sankar, u Post-traumatic Osteoarthritis: A Review of Pathogenic Mechanisms and Novel Targets for Mitigation. Bone Rep. 18, 101658(2023).
  3. Grande, D. A., Schwartz, J. A., Brandel, E., Chahine, N. O., Sgaglione, N. Articular Cartilage Repair: Where We Have Been, Where We Are Now, and Where We Are Headed. Cartilage. 4 (4), 281(2013).
  4. Punzi, L., et al. Post-traumatic Arthritis: Overview On Pathogenic Mechanisms and Role of Inflammation. RMD Open. 2 (2), e000279(2016).
  5. Chubinskaya, S., Wimmer, M. A. Key Pathways to Prevent Posttraumatic Arthritis for Future Molecule-Based Therapy. Cartilage. 4 (3 Suppl), 13S(2013).
  6. Ding, L., et al. Mechanical Impact Induces Cartilage Degradation via Mitogen Activated Protein Kinases. Osteoarthritis Cartilage. 18 (11), 1509(2010).
  7. Bonnevie, E. D., et al. Characterization of Tissue Response to Impact Loads Delivered Using a Hand-Held Instrument for Studying Articular Cartilage Injury. Cartilage. 6 (4), 226(2015).
  8. Nishimuta, J. F., Levenston, M. E. Response of Cartilage and Meniscus Tissue Explants to In Vitro Compressive Overload. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (5), 422(2012).
  9. Liu, Q., et al. Effects of Mechanical Stress on Chondrocyte Phenotype and Chondrocyte Extracellular Matrix Expression. Sci Rep. 6 (1), 1-8 (2016).
  10. Martin, J. A., McCabe, D., Walter, M., Buckwalter, J. A., McKinley, T. O. N-Acetylcysteine Inhibits Post-Impact Chondrocyte Death in Osteochondral Explants. Bone Joint Surg Am. 91 (8), 1890(2009).
  11. Natoli, M. R., Scott, C. C., Athanasiou, A. K. Temporal Effects of Impact on Articular Cartilage Cell Death, Gene Expression, Matrix Biochemistry, and Biomechanics. Ann Biomed Eng. 36 (5), 780-792 (2008).
  12. Huser, C. A. M., Davies, M. E. Calcium Signaling Leads to Mitochondrial Depolarization in Impact-Induced Chondrocyte Death in Equine Articular Cartilage Explants. Arthritis Rheumatism. 56 (7), 2322-2334 (2007).
  13. Delco, M. L., Bonnevie, E. D., Bonassar, L. J., Fortier, L. A. Mitochondrial Dysfunction is An Acute Response of Articular Chondrocytes to Mechanical Injury. J Ortho Res. 36 (2), 739-750 (2018).
  14. Goodwin, W., et al. Rotenone Prevents Impact Induced Chondrocyte Death. J Ortho Res. 28 (8), 1057(2010).
  15. Bartell, L. R., et al. Mitoprotective Therapy Prevents Rapid, Strain-Dependent Mitochondrial Dysfunction After Articular Cartilage Injury. Ortho Res. 38 (6), 1257-1267 (2020).
  16. Zhang, K., et al. Mechanosensory and Mechanotransductive Processes Mediated by Ion Channels in Articular Chondrocytes: Potential Therapeutic Targets for Osteoarthritis. Channels. 15 (1), 339(2021).
  17. Xu, B. Y., et al. The Potential Role of Mechanically Sensitive Ion Channels in the Physiology, Injury, and Repair of Articular Cartilage. J Ortho Surg. 28 (3), 2309499020950262(2020).
  18. Lee, W., et al. Synergy Between Piezo1 and Piezo2 Channels Confers High-strain Mechanosensitivity to Articular Cartilage. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), E5114-E5122 (2014).
  19. Jia, Y. Double-Edged Role of Mechanical Stimuli and Underlying Mechanisms in Cartilage Tissue Engineering. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1271762(2023).
  20. Chan, P. S., et al. Gene Expression Profile of Mechanically Impacted Bovine Articular Cartilage Explants. J Ortho Res. 23 (5), 1146-1151 (2005).
  21. Burton-Wurster, N., et al. Genes in Canine Articular Cartilage that Respond to Mechanical Injury: Gene Expression Studies with Affymetrix Canine GeneChip. J Heredity. 96 (7), 821-828 (2005).
  22. Ashwell, M. S., et al. Changes in Chondrocyte Gene Expression Following In Vitro Impaction of Porcine Articular Cartilage in an Impact Injury Model. J Ortho Res. 31 (3), 385-391 (2013).
  23. Karnik, S., et al. Decreased SIRT1 Activity Is Involved in the Acute Injury Response of Chondrocytes to Ex Vivo Injurious Mechanical Overload. Int J Mol Sci. 24 (7), 6521(2023).
  24. Martin, J. A., McCabe, D., Walter, M., Buckwalter, J. A., McKinley, T. O. N-Acetylcysteine Inhibits Post-Impact Chondrocyte Death in Osteochondral Explants. J Bone Joint Surg Am. 91 (8), 1890(2009).
  25. Argote, P. F., et al. Chondrocyte Viability is Lost During High-Rate Impact Loading by Transfer of Amplified Strain, But not Stress, to Pericellular and Cellular Regions. Osteoarth Cartil. 27 (12), 1822(2019).
  26. Bush, P. G., Hodkinson, P. D., Hamilton, G. L., Hall, A. C. Viability and Volume of In Situ Bovine Articular Chondrocytes-Changes Following a Single Impact and Effects of Medium Osmolarity. Osteoarth Cartil. 13 (1), 54-65 (2005).
  27. Coleman, M. C., et al. Targeting Mitochondrial Responses to Intra-Articular Fracture to Prevent Posttraumatic Osteoarthritis. Sci Transl Med. 10 (427), 5372(2018).
  28. Garrity, J. T., Stoker, A. M., Sims, H. J., Cook, J. L. Improved Osteochondral Allograft Preservation Using Serum-Free Media at Body Temperature. Am J Sports Med. 40 (11), 2542-2548 (2012).
  29. Bonitsky, C. M., et al. Genipin Crosslinking Decreases the Mechanical Wear and Biochemical Degradation of Impacted Cartilage In Vitro. J Ortho Res. 35 (3), 558-565 (2017).
  30. Henson, F. M. D., Vincent, T. Chondrocyte Outgrowth Into a Gelatin scaffold in a Single Impact Load model of Damage/RepairEffect of BMP-2. BMC Musculoskel Disorders. 8, 120(2007).
  31. Jurvelin, J. S., Räsänen, T., Kolmonens, P., Lyyra, T. Comparison of Optical, Needle Probe and Ultrasonic Techniques for the Measurement of Articular Cartilage Thickness. J Biomech. 28 (2), 231-235 (1995).
  32. Dilley, J., et al. A Reproducible Cartilage Impact Model to Generate Post-Traumatic Osteoarthritis in the Rabbit. J Vis Exp. (201), e64450(2023).
  33. Schindelin, J., et al. Fiji: an Open-Source Platform for Biological-Image Analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
  34. Buckwalter, J. A., Brown, T. D. Joint injury, repair, and remodelling: Roles in post-traumatic osteoarthritis. Clin Ortho Related Res. 423, 7-16 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Модель ударного воздействия на хрящпосттравматический остеоартритприложение механической нагрузкиостеохондральные эксплантатыанализ жизнеспособности клетокапоптотическая сигнализацияметод башни свободного падениясубхондральная кость
В пробирке Ударная модель для создания сублетального повреждения хондроцитов в эксплантах хрящевой ткани крупного рогатого скота
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.