Мы создаем стандартизированную модель in vitro для изучения воздействия паров каннабиса на границе раздела воздух-жидкость. Эта модель обеспечивает систематический подход к изучению воздействия испаренного каннабиса, отвечая на растущий интерес к испарителям каннабиса как альтернативе курению.
Методическая статья
In vitro Воздействие каннабиса на эпителиальные клетки легких на границе раздела воздух-жидкость
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
По оценкам, каннабис употребляют 192 миллиона человек во всем мире. Большинство людей употребляют каннабис путем вдыхания дыма каннабиса, который содержит побочные продукты сгорания, которые могут негативно повлиять на здоровье легких. Знание этих рисков привело к растущему интересу к испарителям каннабиса, которые нагревают сухой цветок каннабиса, не обжигая. Испарение каннабиса по-прежнему высвобождает каннабиноиды для вдыхания, но нагревает растительный материал при более низкой температуре. В настоящее время не существует стандартизированной модели in vitro для оценки воздействия сухих паров каннабиса. Таким образом, мы создали модель воздействия культур клеток легких на границе раздела воздух-жидкость (ALI), в результате чего клетки подвергаются апикальному воздействию испаренного каннабиса, тем самым более точно моделируя физиологию эпителиальных клеток легких. Этот протокол обеспечивает последовательную и воспроизводимую доставку паров каннабиса на поверхность клетки, обеспечивая надежную платформу для исследования клеточного и молекулярного воздействия испаренного каннабиса. Эта работа является первой по стандартизации метода доставки паров каннабиса in vitro , который может служить ориентиром для будущих доклинических исследований каннабиса.
Введение
Каннабис обычно используется путем вдыхания дыма от сжигания цветка растения в форме косяка, будь то в рекреационных или медицинских целях. Основная биологическая активность каннабиса обусловлена каннабиноидами, такими как Δ 9-тетрагидроканнабинол (Δ9-ТГК) и каннабидиол (КБД), которые выделяются в организм при вдыхании. Дым каннабиса также содержит пирогенные соединения, включая канцерогены, мутагены и тератогены, которые могут вызывать неблагоприятные последствия для здоровья1. Учитывая эти опасения, существует интерес к использованию испарителей каннабиса, которые нагревают цветок каннабиса, не обжигая, в надежде, что это позволит высвободить каннабиноиды для последующего вдыхания, но без продуктов сгорания. Была проведена некоторая работа по характеристике химических компонентов паров каннабиса, показывающая присутствие каннабиноидов, а также различных респираторных токсикантов, что ставит под сомнение представлениео том, что эти устройства безопасны. Существуют значительные пробелы в знаниях о том, как испарившийся каннабис влияет на легкие и другие органы.
Исследования клеточных культур имеют важное значение в токсикологии для выделения и понимания специфических эффектов вдыхаемых веществ на клеточном уровне, что позволяет получить высокопроизводительные, экономически эффективные и механистические знания, имеющие отношение к биологии человека. Метод культивирования клеток также является важным фактором, определяющим общие результаты, полученные в результате эксперимента in vitro . Большинство исследований клеточных культур проводятся в условиях погружения, где клетки выращиваются на пластике и подвергаются апикальному воздействию водных сред. Эпителиальные клетки дыхательных путей, однако, представляют собой уникальную проблему в этом отношении. На протяжении всей дыхательной системы апикальная поверхность эпителиальных клеток находится в контакте с воздухом. В альвеолах эпителиальные клетки продуцируют сурфактант, в то время как другие эпителиальные клетки дыхательных путей вырабатывают слизь; В совокупности это защищает и поддерживает функцию легких. Погруженные культуры не могут воспроизводить воздействие апикального воздуха, что ограничивает их способность точно моделировать среду in vivo . Альтернативой погруженным моделям культур является культивирование на границе раздела воздух-жидкость (ALI), где клетки респираторного эпителия выращиваются на мембране, покрытой коллагеном, с средами на базолатеральной стороне при апикальном воздействии воздуха. Эпителиальные клетки, культивируемые в ALI, являются более точными моделями респираторного эпителия благодаря их способности поляризоваться, продуцировать сурфактант или слизь и образовывать соединения в этой среде4.
Еще одним соображением, с которым сталкиваются традиционные методы культивирования клеток в погружении, является то, что гидрофобные соединения, такие как каннабиноиды, плохо растворяются в водных средах5. Этанольные экстракты являются распространенным растворителем для изучения гидрофобных соединений в погруженных культурах 6,7,8,9,10,11,12. Эти экстракты позволяют растворять в водных средах как гидрофобные, так и гидрофильные соединения. Тем не менее, ограничением является способность агломерации соединений, а также соединений, взаимодействующих со средой, которые могут изменять биодоступность13,14. В последнее время были разработаны решения, позволяющие доставлять соединения аэрозольной фазы в клетки в отсутствие растворителя или среды с использованием передовых систем воздействия, таких как expoCube15 (ALI/Transwell in vitro/ex vivo), а также других. Прямое осаждение аэрозолей и суспензий частиц с использованием усовершенствованной системы экспозиции устраняет процесс сбора-ресуспендирования, имеющий решающее значение для погружения в атмосферу, который, как известно, существенно изменяет физико-химические свойства частиц16. Здесь мы описываем стандартизированный протокол воздействия на линию альвеолярных эпителиальных клеток в ALI.
Протокол
1. Культивирование эпителиальных клеток легких в ALI
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь описан протокол культивирования клеток А549 в ALI. Пожалуйста, ознакомьтесь с литературой по типу клеток, которые будут использоваться в исследовании. Разным клеточным линиям требуется разное количество времени в ALI для дифференцировки, формирования плотных соединений и производства сурфактанта/слизи.
- Культура клеток
- Приготовьте среду, добавив 50 мл инактивированной при нагревании фетальной бычьей сыворотки (FBS), 5 мл Глутамакса, 5 мл антибиотика-антимикотика и 500 мкл гентамицина во флакон DMEM объемом 500 мкл.
- Подготовленный скот поместить на водяную баню на 10-15 мин до нагрева до 37 °С.
- Сбрызните шкаф биобезопасности 70% этанолом и протрите его. Как только среда нагреется, поместите ее под стерилизованный шкаф для биобезопасности.
- Под капюшоном для культивирования нанесите примерно 10 мл среды в пробирку объемом 15 мл.
- Извлеките клетки из жидкого азота и размораживайте, аккуратно перемешивая на водяной бане.
- Под культуральным колпаком пипетируют размороженные клетки криовиального аппарата в пробирку объемом 15 мл.
- Центрифугируйте пробирку объемом 15 мл при 300 г в течение 5 минут.
- Осторожно удалите надосадочную жидкость, не потревожив гранулы.
- Смешайте гранулу с фильтрующим материалом и переложите в колбу T75 .
- Проверьте колбу Т75 под микроскопом.
- Инкубируйте клетки при 37 °C, 5%CO2 с насыщающей влажностью.
- Обновляйте среды для клеточных культур каждые 2-3 дня.
- Пропускайте и выращивайте клетки до тех пор, пока не будет достигнуто желаемое количество клеток. Чтобы засеять одну 12-луночную пластину, требуется 3 × 106 ячеек.
- Коллагеновое покрытие трансвеллов
- Приготовление коллагенового раствора
- Растворите 10 мг коллагена IV типа в 20 мл ddH2O с 50 мкл ледяной уксусной кислоты.
- Выдерживать при температуре 37 °C в течение 30 минут, периодически поворачивая, до полного растворения.
- Стерилизуйте раствор путем фильтрации через фильтр 0,22 мкм.
- Разложите 1,5 мл раствора по 15 мл и храните при температуре -20 °С.
- Покрытие трансвелловых фильтров коллагеном типа IV
- Разморозьте один тюбик коллагена IV типа (50 мкг/мл) от -20 °C.
- Добавьте 150 мкл коллагена в каждый фильтр Transwell.
ПРИМЕЧАНИЕ: Только 12-луночные планшеты совместимы с системой экспонирования. - Оставьте тарелки с открытыми крышками в шкафу биобезопасности (БСК) на 18 часов для высыхания.
- Стерилизовать путем воздействия ультрафиолетового (УФ) света в течение 30 минут.
- Хранить тарелки при температуре 4 °C, завернутые в парапленку, до 30 дней.
- Перед нанесением покрытия на ячейки промойте обе стороны фильтров стерильным фосфатно-солевым буфером (PBS).
- Приготовление коллагенового раствора
- Засевка ячеек во вкладыши и переход на ALI
- Приготовление пластинчатой и клеточной суспензии
- Пипеткой внесите 1,5 мл предварительно подогретой подготовленной среды в каждую лунку 12-луночного планшета.
- Поместите планшет в инкубатор при температуре 37 °C и 5%CO2.
- Приготовьте клеточную суспензию с концентрацией 5 × 105 клеток/мл в подготовленной среде.
- Высевающие ячейки во вкладышах
- Извлеките подготовленную тарелку для клеточной культуры из инкубатора и поместите ее под стерилизованный шкаф биобезопасности.
- Пипеткой нанесите 0,5 мл клеточной суспензии (2,5 ×10 5 клеток/вкладыш) на верхнюю часть мембраны во вкладыше.
- Накройте тарелку крышкой и поместите ее обратно в инкубатор при температуре 37 °C и 5%CO2.
- Создание ALI
- Удаляют верхушечные среды через 24 ч после засеивания ячеек.
- Замените базолатеральную среду 0,6 мл приготовленной среды. На этом этапе клетки подвергаются апикальному воздействию воздуха, образуя ALI.
- Культивируйте клетки A549 в ALI в течение 2 недель, меняя среду каждые 2 дня, чтобы позволить клеткам дифференцироваться, как было описано ранее4.
- Приготовление пластинчатой и клеточной суспензии
2. Дозиметрическая оценка воздействия паров каннабиса с помощью ЖХ/МС
ПРИМЕЧАНИЕ: В этой части протокола были использованы бесклеточные методы для характеристики дозы паров каннабиса, осажденных в каждой лунке, путем анализа концентраций Δ-9-ТГК. Δ 9-ТГК прилипает к пластиковым материалам, поэтому для сбора образцов следует использовать только стеклянные флаконы. Этот метод требует, чтобы выбранный сорт каннабиса содержал Δ-9-ТГК.
- Подготовка и настройка системы экспонирования
- Установите трубки для системы воздействия в соответствии с заданным путем потока (рис. 1A, B): блок ENDS > конденсатор > насос для пыхтения > узел для отбора изометрических проб с насосом Aeroneb > датчик влажности expoCube > с фильтром > порт потока экспозиции expoCube.
- Включите регуляторы температуры, чтобы нагреть систему до 35 °C и 50 °C.
- Проведите испытания потока, чтобы убедиться в отсутствии утечек в системе и правильной настройке давления (см. техническое примечание SCIREQ: Руководство по устранению неравномерных потоков в expoCube).
- Запустите насосы Aeroneb для достижения относительной влажности более 75%.
- Дозиметрические испытания и подготовка испарителя
- Подготовка испарителя каннабиса
- Измельчите цветок конопли с помощью измельчителя трав.
- Взвесьте 0,25 г аликвот, организуя каждую порцию с помощью сепаратора таблеток.
- Вставьте вставки из нержавеющей стали в ряд экспозиционной пластины 12-луночного трансколодезного планшета в системе экспонирования.
- Подготовка испарителя каннабиса
- Воздействие паров каннабиса на вставки из нержавеющей стали
- Начало знакомства
- Упакуйте в печь испарителя 0,25 г каннабиса.
- Прикрепите испаритель каннабиса к блоку ENDS системы воздействия с помощью надежной прокладки и начните желаемый режим затяжки. Установите для испарителя настройку температуры Smart Path Level 2 .
ПРИМЕЧАНИЕ: Система воздействия, используемая в этом исследовании, имеет на выбор четыре интеллектуальных уровня, включая уровень 1 (176-188 °C), уровень 2 (188-199 °C), уровень 3 (199-210 °C) и уровень 4 (210-221 °C). - Создание профиля затяжки в программном обеспечении flexiWare (программное обеспечение для сбора данных; см. SCIREQ Technote: Руководство по созданию профилей для flexiWare 8). Для этого протокола используйте объем 70 мл затяжки с частотой 4 затяжки/мин.
- Запустите испаритель сухой травы в течение 5 минут, прежде чем переключить каннабис, вынув цветок каннабиса из печи испарителя и добавив в испаритель свежие 0,25 г каннабиса. Чередуйте два испарителя для непрерывного воздействия.
- Продолжайте шаги 2.3.1.1-2.3.1.4 до тех пор, пока не будет достигнуто желаемое время воздействия.
- После каждой экспозиции осторожно извлекайте вкладыши из системы экспонирования с помощью пинцета и подготавливайте их к сбору пробы, как описано ниже.
- Начало знакомства
- Сбор и подготовка проб для анализа ЖХ/МС
- С помощью пинцета поместите фильтры, соответствующие каждой экспозиции, в стеклянный флакон с маркировкой, содержащий 10 мл метанола класса LC/MS (например, экспозиция 1, экспозиция 2, экспозиция 3).
- Промойте вкладыш.
- Поместите каждую открытую вставку из нержавеющей стали в стеклянный флакон с этикеткой, содержащий 10 мл метанола класса LC/MS.
- Маркируйте флаконы в соответствии с экспозицией (например, экспозиция 1, лунка 1-4).
- Экстракт Δ 9-ТГК
- Используйте ванну с ультразвуком для обработки флаконов со вставками в течение 10 минут для извлечения Δ 9-ТГК.
- Переложите вкладыши во второй набор стеклянных флаконов с 10 мл свежего метанола и ультразвуком еще на 10 минут.
- Отправьте все подготовленные образцы (лунки, промывку и фильтр) для анализа LC/MS для количественного определения уровней Δ-9-ТГК.
- Дозиметрические расчеты
- Используя результаты анализа ЖХ/МС, рассчитать количество осажденного Δ9-ТГК для определения дозиметрии экспозиционного потока (количества, осажденного в фильтре) и дозиметрии в скважине.
- Рассчитайте соотношение между фильтром экспозиционного потока и осаждением из скважины для Δ 9-ТГК.
- Используйте это соотношение для определения дозы, которая будет доставлена в клетки во время воздействия.
3. Дозиметрическая оценка воздействия паров конопли с помощью кварцевых кристаллических микровесов
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод подробно описывает настройку и калибровку кварцевых кристаллических микровесов (QCM) для оценки массы частиц паров каннабиса, осажденных во время воздействия. Каждый QCM обеспечивает измерения в режиме реального времени, что позволяет точно дозиметрически оценивать воздействие паров каннабиса.
- Подготовка и настройка ККМ в системе экспонирования
- Настройте систему экспонирования, как описано ранее.
- Прикрепите каждый QCM к его электронному модулю с помощью разъема с зажимом и подключите модуль к входам блока inExpose (платформа ингаляционного воздействия) с помощью 7-контактного разъема.
- Поместите вставку (вставки) QCM в луночную пластину со стороны экспонирования системы экспонирования, убедившись, что QCM хорошо выровнена.
- Предварительно нагрейте систему воздействия с подключенными ККМ до тех пор, пока система не стабилизируется при целевых температурах 35 °C и 50 °C.
- Активируйте микропотоки и потоки воздействия в соответствии с экспериментальными настройками.
- Калибровка QCM
- Используйте мастер калибровки программного обеспечения для сбора данных для калибровки QCM перед каждым прогоном экспозиции.
- Подождите, пока синяя калибровочная шкала стабилизируется, затем нажмите «Далее », чтобы записать резонансную частоту QCM для точных расчетов массы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемый диапазон калибровки составляет от -15% до 15%. Отклонения могут указывать на такие проблемы, как загрязнение QCM или отсоединение разъема LEMO.
- Мониторинг сигналов СМК в режиме реального времени
- Мониторинг выходов QCM; Система выводит накопленную массу. Значение отображается в программном обеспечении для сбора данных как в виде графика, так и в виде фактической текущей стоимости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого экспериментального прогона в программном обеспечении также указываются максимальное и минимальное осаждение.
- Мониторинг выходов QCM; Система выводит накопленную массу. Значение отображается в программном обеспечении для сбора данных как в виде графика, так и в виде фактической текущей стоимости.
- Очистка QCM
- Для поддержания точности очищайте QCM после каждого эксперимента.
- Добавьте 1 мл 70% изопропилового спирта внутрь каждой вставки СМК.
- Пипеткой вгоняйте спиртовой раствор вверх и вниз 2-3 раза, чтобы растворить остатки.
- Удалите спиртовой раствор и дайте QCM полностью высохнуть на воздухе в защищенной от пыли среде перед следующим использованием.
4. Результаты воздействия на клетки паров каннабиса
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол предназначен для оценки воздействия паров каннабиса на клетки дыхательных путей, культивируемых в ALI с использованием системы expoCube. Постконтактные анализы, включающие 3-(4, 5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид (МТТ) и лактатдегидрогеназу (ЛДГ), позволяют получить представление о дозозависимой цитотоксичности и метаболической активности.
- Подача пара каннабиса
- Настройте систему воздействия, как описано выше: убедитесь, что температура системы превышает 35 °C и 50 °C, а относительная влажность превышает 75%.
- Если вы используете QCM, прикрепите устройство к его электронному модулю с помощью разъема с зажимом и подключите модуль к входам блока ингаляционного воздействия с помощью 7-контактного разъема. Поместите отдельную вставку QCM в луночную пластину со стороны экспозиции expoCube, убедившись, что QCM хорошо выровнена.
- Откройте систему экспозиции и поместите внутрь планшет для клеточной культуры.
- Начните режим затяжки в течение желаемой продолжительности в соответствии с разделом 2. Использование QCM позволит отслеживать общее количество осажденного пара в режиме реального времени.
- После воздействия верните клетки в инкубатор до желаемого момента проведения анализа.
- При необходимости соберите образцы из различных компартментов, включая базолатеральный компартмент, апикальный компартмент (для поверхностно-активного вещества или слизи) и лизат клеток.
- Анализы выбора дозы: Используйте анализы ЛДГ и МТТ для определения оптимальной дозы и потенциальной цитотоксичности.
- Анализ ЛДГ на клетки в ALI
- Сбор медиа: В нужный момент времени после экспонирования соберите медиа из базолатерального отсека.
- Перенесите 100 мкл собранной среды на прозрачную 96-луночную микропланшет.
- Добавьте в каждую лунку по 100 мкл свежеприготовленной реакционной смеси ЛДГ.
- Выдержать тарелку при комнатной температуре (15-25 °C) в течение 30 минут, защищая ее от света.
- Измерьте поглощение на длине волны 490-492 нм, используя опорную длину волны более 600 нм.
- Рассчитайте цитотоксичность по следующей формуле:
Цитотоксичность (%) = (экспериментальное значение-отрицательный контроль)/(положительный контроль-отрицательный контроль) x 100
- Анализ МТТ на клетки в ALI
- Культивирование клеток А549 в ALI в том виде, в котором это было установлено ранее.
- После введения экспозиции в систему экспозиции верните клетки в инкубатор до желаемого момента проведения анализа.
- Растворите 1 мг МТТ в 1 мл PBS, чтобы приготовить раствор МТТ.
- Добавьте 500 μL раствора MTT на апикальную сторону ячеек и 500 μL раствора MTT на базолатеральный отсек.
- Верните клетки в инкубатор при температуре 37 °C на 1 ч.
- Осторожно удалите все носители.
- Добавьте 500 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) на апикальную сторону и 1000 мкл ДМСО на базолатеральную сторону.
- Выдерживать в течение 1 ч до растворения кристаллов формазана.
- Соберите и соедините раствор как с апикальной, так и с базолатеральной стороны.
- Измерьте поглощение на длине волны 540 нм (OD540) с эталонным значением на длине волны 690 нм (OD690).
- Рассчитайте жизнеспособность клеток по следующей формуле:
Жизнеспособность клеток (%) = 100 × (Среднее OD_exposure/Среднее OD_negative контролем)
Результаты
Во время экспериментов с системой expoCube четыре лунки подвергаются воздействию паров каннабиса, четыре лунки подвергаются воздействию кондиционированного воздуха в качестве элементов управления транспортным средством, а остальные четыре лунки полностью закрыты в качестве отрицательного контроля (Рисунок 1C)17. Эта конфигурация позволяет точно сравнивать обработанные условия, состояние автомобиля и негативные условия. Система увлажнена для создания среды, пригодной для клеточных культур (рисунок 2), а регулирование температуры в системе усиливает осаждение частиц посредством термофореза, что позволяет эффективно доставлять испарившиеся соединения к клеткам18. Чтобы количественно оценить воздействие, мы измеряем количество Δ-9-ТГК в качестве маркера отложения паров каннабиса в месте воздействия клеток. Такое количественное определение имеет решающее значение для оптимизации времени и доз воздействия, позволяя исследователям корректировать периоды активного воздействия для достижения желаемых доз в экспериментах на клеточных культурах (рис. 3). Рассчитав отношение Δ9-ТГК, собранного в фильтре экспозиционного потока, к количеству, осевшему в отдельных лунках, мы можем оценить фактическую дозу, доставленную в ячейки (табл. 1). Эта рассчитанная доза информирует о желаемом диапазоне воздействия, помогая в определении оптимальных параметров для изучения клеточных реакций на пары каннабиса последовательным и измеримым образом. Это может быть выполнено для других каннабиноидов, в зависимости от каннабиноидного профиля выбранного сорта каннабиса. Кроме того, анализ QCM может быть выполнен для измерения осаждения паров каннабиса в режиме реального времени. На рисунке 4 показано осаждение паров каннабиса в течение 30 минут, в течение которого испаритель и материал каннабиса менялись каждые 5 минут. Каждая лунка показала последовательное увеличение массы с течением времени, что указывает на эффективное и непрерывное осаждение цельных частиц паров каннабиса.
Рисунок 1: Схема системы воздействия ALI/Transwell in vitro/ex vivo для воздействия паров каннабиса в ALI. (A) Для получения паров каннабиса использовался испаритель DaVinci MIQRO. Этот образец увлажняют и пропускают через изокинетический пробоотборник в место воздействия. Блок управления позволяет регулировать выходной поток воздуха и градиенты температуры. (B) Фотографии настройки системы экспонирования. (C) Внутренняя часть expoCube разделена на три ряда: испытательный ряд для воздействия паров каннабиса, ряд управления транспортным средством с кондиционированным воздухом и закрытый ряд отрицательного контроля, который остается нетронутым каким-либо воздушным потоком. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2: Профиль относительной влажности (%), записанный с течением времени. Эти данные показывают уровни относительной влажности при активации аэронебов, достигая и поддерживая среднюю влажность на уровне 75%. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3: Количественная оценка осаждения Δ-9-ТГК с помощью анализа LC/MS после 30-минутного воздействия паров каннабиса. (А-C) ОсаждениеΔ 9-ТГК было измерено в каждой скважине после трех независимых 30-минутных воздействий паров, в каждом из которых использовалось 1,5 г сорта конопли с высоким содержанием ТГК. Уровни Δ 9-ТГК были количественно определены с помощью LC/MS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Измерения QCM осаждения паров каннабиса в системе воздействия ALI/Transwell in vitro/ex vivo в течение 30-минутного режима воздействия. (A-D)Каждый график представляет собой кумулятивное осаждение частиц паров каннабиса в скважинах 1-4, с массой, измеряемой в микрограммах (μг) с течением времени. Скорость осаждения демонстрирует устойчивое накопление по всем скважинам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
| Осаждение фильтра грубой очистки (μг) | Отложения из скважин (μг) | Процент первичного притока, отложенного в скважине (%) | |
| Экспозиция 1 | 2142.3 | 4.7 | 0.22 |
| 4.4 | 0.2 | ||
| 4.6 | 0.22 | ||
| 4.4 | 0.21 | ||
| Экспозиция 2 | 2726.5 | 4.1 | 0.15 |
| 3.9 | 0.14 | ||
| 4.4 | 0.16 | ||
| 4.6 | 0.17 | ||
| Экспозиция 3 | 2400 | 3.6 | 0.15 |
| 3.8 | 0.16 | ||
| 5 | 0.21 | ||
| 4 | 0.17 | ||
| Средний | 2422.9 | 4.3 | 0.18 |
| Стандартное отклонение | 292.8 | 0.4 | 0.03 |
Таблица 1. Сравнение осаждения Δ-9-ТГК в системе воздействия ALI/Transwell in vitro/ex vivo между фильтром потока воздействия и местом воздействия клетки.
Обсуждение
Культивирование клеток в ALI является важным методом в респираторных исследованиях из-за его способности более точно представлять in vivo состояние дыхательных путей по сравнению с традиционными погружными культурами. Культивирование в ALI позволяет эпителиальным клеткам легких подвергаться воздействию воздуха непосредственно на их апикальной поверхности, сохраняя при этом необходимые питательные вещества из питательной среды на базолатеральной стороне. Эта установка позволяет клеткам вырабатывать сурфактант или слизь, ключевые компоненты механизма защиты органов дыхания, которые имеют решающее значение для улавливания и удаления вдыхаемых частиц и патогенов 20,21,22. Клетки A549 обычно используются для исследований in vitro, но являются лишь одной из многих культур респираторных эпителиальных клеток, которые могут быть использованы для лечения ОПЛ. Silva et al. рассмотрели клеточные линии и первичные культуры респираторного эпителия на ОПЛ от носовой полости до альвеол22. Гибкость представленной системы воздействия ALI позволяет адаптировать ее для разных клеточных линий и первичных клеток.
Культуры ALI все чаще рассматриваются в качестве «золотого стандарта» для ингаляционных исследований in vitro , особенно для исследований загрязнителей воздуха, твердых частиц и других ингаляционныхагентов. Основное преимущество моделей ALI заключается в их способности предоставлять информацию, которая в большей степени переводится в воздействие на человека in vivo . Тем не менее, заметным недостатком является отсутствие стандартизированных протоколов для воздействия ОПЛ, что влияет на воспроизводимость и сопоставимость между исследованиями. Одним из пробелов является стандартизированный рабочий процесс экспонирования. Подвергая клетки воздействию паров каннабиса в ALI, можно оценить влияние каннабиса на клеточную функцию, жизнеспособность и цитотоксичность. Эти воздействия позволяют детально оценить биологические последствия, включая маркеры цитотоксичности, воспаления и окислительного стресса. Точное количественное определение осажденных каннабиноидов позволяет проводить воспроизводимые исследования клеточных эффектов паров каннабиса (и других форм продуктов каннабиса), улучшая наше понимание его потенциального воздействия на здоровье в контролируемых лабораторных условиях.
Усовершенствованные системы экспозиции устраняют ограничения в традиционных погружных культурах, позволяя напрямую осаждать частицы на поверхность клетки, тем самым обеспечивая более физиологически релевантное воздействие. Это также снижает потенциальное воздействие растворителей или носителей. Обеспечивая прямое осаждение частиц без необходимости использования этих растворителей, системы воздействия помогают свести к минимуму эффекты, связанные с транспортным средством. Тем не менее, некоторые соображения, связанные с транспортными средствами, остаются. Например, неконтролируемый уровень влажности может вызвать нежелательный клеточный стресс24, что потенциально может повлиять на результаты экспериментов. Обеспечение тщательного регулирования влажности для достижения оптимального уровня имеет важное значение для поддержания стабильности клеток и точности результатов. Кроме того, каждая частица, аэрозоль или газовая смесь обладает своими уникальными физико-химическими свойствами, которые могут изменять осаждениена поверхности клетки. Поэтому важно охарактеризовать режим воздействия для каждого уникального продукта. Факторы, которые могут влиять на осаждение частиц, включают термофорез, перемещение частиц из области с более высокой температурой в область с более низкойтемпературой26. Термофорез помогает направлять частицы к клеткам и повышает эффективность осаждения.
Постоянство и точность дозирования являются дополнительными проблемами при работе с системами воздействия в ALI, особенно когда речь идет об аэрозолях или частицах. Осаждение частиц in vivo в легких представляет собой сложный процесс, на который влияют размер, форма, плотность и растворимость частиц, а также конкретная область легкого, на которую воздействует27. Эти факторы приводят к различным темпам осаждения, которые может быть трудно воспроизвести in vitro. Математические модели, такие как дозиметрия многолучевых частиц (MPPD), являются полезными инструментами для оценки скорости осаждения in vivo и трансляции дозы in vitro. Тем не менее, согласование дозирования in vitro со сценариями воздействия in vivo остается проблемой, особенно для сложных аэрозолей с гетерогенным составом.
Для определения безклеточной характеристики дозы важно отметить, что промывки вставок из нержавеющей стали, как правило, переоценивают осаждение, поскольку соединения могут прилипать как к стенкам вставки, так и к основанию, где обычно располагаются клетки. QCM имеет преимущество, измеряя только массу, осажденную непосредственно в месте культивирования клеток, обеспечивая более точную оценку осаждения, конкретно относящуюся к воздействию на клетки.
По мере того, как токсикология движется к более физиологически значимым моделям, принятие унифицированных протоколов воздействия ALI будет иметь основополагающее значение для преодоления разрыва между результатами in vitro и реакциями человека in vivo , в конечном итоге поддерживая более надежные оценки респираторных токсикантов и их воздействия на здоровье.
Раскрытие информации
PG и BU работают в SCIREQ - Scientific Respiratory Equipment, Inc. ETW прошли стажировку в SCIREQ - Scientific Respiratory Equipment, Inc. в рамках программы Mitacs Accelerate. У других авторов нет никаких противоречий для раскрытия
Благодарности
Эта работа была поддержана грантом проекта Канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR) 162273. CJB был поддержан Fonds de Recherche du Québec -Santé (FRQS). Это исследование также было поддержано грантом Mitacs #IT34076 ETW.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Центрифужная пробирка 15 мл, штатив (штатив из полистирола), стерильный | Монреаль Биотек Инк. | ||
| 30 мл стеклянные флаконы | Thomas Scientific | 1755F32 | |
| A549 клетки | ATCC | CCL-185 | |
| Антибиотик-антимикотик (100x) | Wisent | 450-115-EL | |
| Измельчитель трав каннабиса | Genchi | https://www.amazon.ca/Genchi-Grinder-Crystal-Threads-Premium/dp/B094WX443Y/ref=sr_1_10?crid=A1EV93N8PW1V&dib=eyJ2Ijo iMSJ9.WX_vMBLeAHzc6JplZiba8i w7k_cGpHrEm0VunfiDZqO0U1mT NA0Tr8j5nGMqrGq1BW75hAV8Fr3 SDCGH7O7zwsmmCWOxvdAEN4 97Npj07w0FHMuNDtuKZ3hKv9d8 vauHRtueWaDqYEPOCIAy956bGf PwXu2Gp9nCWVhFCo1gHqgeh1N nrWwD3lJ_r_wx2GoauoNdVw9eH A2QYc1tx3XKMidd2YkVRF_ABYL ZJd0EIDxi22hBnzaM4KklLO6Ep0v OGb1QifhM062KUvTTY9PAOUn8F -O1V0qNYQiRk6SQo2WId2wOHS Mz_zo4YCbkDQf2rNGy81iXhuBzV qu9LhvOcI1xnPUd-JPLx_4rZdSC92 Q_QZODiSxBhH-ellca78LW2iV4XXU vIr-fVWIKdhrS49MD7KV1lCjdBcT_ K3l4bT0mBgZB1_Qpgf_5tmrj-kf. vIr-br/-kf.-kf. vIr-br/-kf..--kf. vIr-br/-kf..-kf. vIr-br/-kf.. vIr-br/-kf..-kf. vIr-br/-kf.. vIr-br/-kf..-kf. vIr-br/-kf..--kf. -ctY GDLXKn-ovr6On-5g1G0_oK5mrHdj CN3LXumyu8Q& dib_tag=se& ключевые слова=herb%2Bgrinder& qid=1736346511& sprefix=herb%2Bgrinder%2Caps% 2C168& sr=8-10& th=1 | |
| Коллаген из плаценты человека, тип IV | Sigma-Aldrich | C7521 | |
| Costar 12 мм transwell, 0,4 &; m поры полиэфирная мембрана Вставки | Stemcell Technologies | 38023 | |
| Набор для обнаружения цитотоксичности (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| Davinci MIQRO-C сухой испаритель трав | DAVINCI | https://davincivaporizer.com/products/davinci-miqro-c | |
| Диметилсульфоксид | Sigma-Aldrich | 34869 | |
| DMEM medium | Wisent | 319-005-CL | |
| Сушеный цветок конопли | Socieacute; té кюакут; bé coise du cannabis | https://www.sqdc.ca/en-CA/dried-cannabis?&fn1=CannabinoidBalanceLookup Value&fv1=THC | Содержание каннабиноидов: 17– 23% ТГК < 0,1% КБД |
| Фетальная бычья сыворотка | Wisent | 080-150 | FBS |
| flexiWare | SCIREQ | https://www.scireq.com/downloads/ | Версия 8.4.1 |
| Гентамицин | Wisent | 450-134-XL | |
| Ледяная уксусная кислота | Sigma-Aldrich | 100063 | |
| Glutamax | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
| inExpose expoCube in vitro exposure package | SCIREQ | IX-XCP | |
| Infinite 200 PRO | TECAN | 30125944 | |
| метанол марки LC/MS | Sigma-Aldrich | 106035 | |
| фосфатно-солевой буфер | ThermoFisher Scientific | 10010-023 | |
| T175 EasYFlask, TC поверхность, крышка фильтра | ThermoFisher Scientific | 159910 | |
| T75 EasYFlask, TC поверхность, крышка фильтра | ThermoFisher Scientific | ||
| Тиазолил синий тетразолия бромид | Sigma-Aldrich | M 2128 | MTT |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 108603 | |
| Ультразвуковой очиститель ванны | VWR | 18303 | Соник для ванны |
| Еженедельный органайзер для таблеток | HealthSmart | 640-8223-0000 |
Ссылки
- Graves, B. M., et al. Comprehensive characterization of mainstream marijuana and tobacco smoke. Sci Rep. 10 (1), 7160(2020).
- Lanz, C., Mattsson, J., Soydaner, U., Brenneisen, R. Medicinal cannabis: in vitro validation of vaporizers for the smokefree inhalation of cannabis. PLoS One. 11 (1), e0147286(2016).
- Arlen, M., et al. Cannabis vaping elicits transcriptomic and metabolomic changes in inflammatory, oxidative stress and cancer pathways in human bronchial epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. , (2025).
- Wu, J., et al. Characterization of airliquid interface culture of A549 alveolar epithelial cells. Braz J Med Biol Res. 51 (2), e6950(2017).
- Kaur, K., et al. Comparison of biological responses between submerged, pseudoairliquid interface, and airliquid interface exposure of A549 and differentiated THP1 cocultures to combustionderived particles. J Environ Sci Health A Tox Hazard Subst Environ Eng. 57 (7), 540-551 (2022).
- Adekola, M. B., et al. Invitro antioxidant and antiinflammatory activities of ethanol stembark extract of Blighia sapida K.D. Koenig. J Pharm Anal. 12 (2), 350-354 (2022).
- Final report on the safety assessment of capsicum annuum extract, capsicum annuum fruit extract, capsicum annuum resin, capsicum annuum fruit powder, capsicum frutescens fruit, capsicum frutescens fruit extract, capsicum frutescens resin, and capsaicin. Int J Toxicol. 26 (Suppl 1), 3-106 (2007).
- Daltro, S. R. T., et al. In vitro and in vivo immunomodulatory activity of Physalis angulata concentrated ethanolic extract. Planta Med. 87 (1-02), 160-168 (2021).
- Araujo, J., et al. Antioxidant and in vitro cytogenotoxic properties of Amburana cearensis (Allemão) A.C.Sm. leaf extract. Drug Chem Toxicol. 46 (1), 104-112 (2023).
- Spósito, L., et al. In vitro and in vivo antihelicobacter pylori activity of Casearia sylvestris leaf derivatives. J Ethnopharmacol. 233, 1-12 (2019).
- Ngulde, S. I., et al. Ethanol extract of Securidaca longipedunculata induces apoptosis in brain tumor (U87) cells. Biomed Res Int. 2019, 9826590(2019).
- Phuwajaroanpong, A., et al. In vitro and in vivo antimalarial activities and toxicological assessment of Pogostemon cablin (Blanco) Benth. J Evid Based Integr Med. 25, (2020).
- Upadhyay, S., Palmberg, L. Airliquid interface: relevant in vitro models for investigating air pollutantinduced pulmonary toxicity. Toxicol Sci. 164 (1), 21-30 (2018).
- Lenz, A. G., et al. Inflammatory and oxidative stress responses of an alveolar epithelial cell line to airborne zinc oxide nanoparticles at the airliquid interface: a comparison with conventional, submerged cellculture conditions. Biomed Res Int. 2013, 652632(2013).
- Ritter, D., et al. In vitro inhalation cytotoxicity testing of therapeutic nanosystems for pulmonary infection. Toxicol In Vitro. 63, 104714(2020).
- Loret, T., et al. Airliquid interface exposure to aerosols of poorly soluble nanomaterials induces different biological activation levels compared to exposure to suspensions. Part Fibre Toxicol. 13 (1), 58(2016).
- Detlef, R., et al. In vitro inhalation cytotoxicity testing of therapeutic nanosystems for pulmonary infection. Toxicol In Vitro. 63, 104714(2020).
- Ritter, D., et al. Development and evaluation of an in vitro test system for toxicity screening of aerosols released from consumer products and first ap-plication to aerosols from a hair straightening process. Appl In Vitro Toxicol. 4 (2), 180-192 (2018).
- Silva, S., Bicker, J., Falcão, A., Fortuna, A. Airliquid interface (ALI) impact on different respiratory cell cultures. Eur J Pharm Biopharm. 184, 62-82 (2023).
- Fahy, J. V., Dickey, B. F. Airway mucus function and dysfunction. N Engl J Med. 363 (23), 2233-2247 (2010).
- Kingma, P. S., Whitsett, J. A. In defense of the lung: surfactant protein A and surfactant protein D. Curr Opin Pharmacol. 6 (3), 277-283 (2006).
- Soraia, S., Joana, B., Amílcar, F., Ana, F. Airliquid interface (ALI) impact on different respiratory cell cultures. Eur J Pharm Biopharm. 184, 62-82 (2023).
- Graf, J., TrautmannRodriguez, M., Sabnis, S., Kloxin, A. M., Fromen, C. A. On the path to predicting immune responses in the lung: modeling the pulmonary innate immune system at the airliquid interface (ALI). Eur J Pharm Sci. 191, 106596(2023).
- Zavala, J., et al. Regulating temperature and relative humidity in airliquid interface in vitro systems eliminates cytotoxicity resulting from control air exposures. Toxicol Res (Camb). 6 (4), 448-459 (2017).
- Speen, A. M., et al. Benchmark dose modeling approaches for volatile organic chemicals using a novel airliquid interface in vitro exposure system. Toxicol Sci. 188 (1), 88-107 (2022).
- Seidel, S. A., et al. Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions. Methods. 59 (3), 301-315 (2013).
- Morawska, L., Buonanno, G., Mikszewski, A., Stabile, L. The physics of respiratory particle generation, fate in the air, and inhalation. Nat Rev Phys. 4 (11), 723-734 (2022).
- Kuempel, E. D., Sweeney, L. M., Morris, J. B., Jarabek, A. M. Advances in inhalation dosimetry models and methods for occupational risk assessment and exposure limit derivation. J Occup Environ Hyg. 12 (Suppl 1), S18-S40 (2015).
Перепечатки и разрешения
