Method Article

Стандартизированная модульная сборка полицистронных оперонов с модульным клонированием (MoClo) с использованием инструментария In-Cloning

DOI:

10.3791/68103

⸱

September 2nd, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Systems and Synthetic Biology (SSB), Wageningen University and Research, Agrotechnology and Food Sciences, 2Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology, 3Center for Molecular Biology of Heidelberg University (ZMBH), 4Center for Synthetic Microbiology, Philipps-University Marburg

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье представлен пошаговый протокол, демонстрирующий, как модульное клонирование (MoClo) может быть адаптировано для клонирования полицистронных оперонов.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наборы инструментов модульного клонирования (MoClo) позволяют быстро собирать мультигенные конструкции. Они основаны на клонировании Golden Gate, в котором используются ферменты рестрикции типа IIS, которые выходят за пределы их сайта распознавания. Поскольку распознавание и последовательность разреза разъединены, выступы, создаваемые ферментами рестрикции типа IIS, могут быть выбраны намеренно, а стратегии клонирования обычно предотвращают разрезание правильно соединенных фрагментов ДНК. Это позволяет создавать высокоэффективные сборки нескольких фрагментов ДНК в одной реакции. В MoClo отдельным функциональным частям ДНК, таким как промоторы, рибосомные сайты связывания, кодирующие последовательности и терминаторы, а также сборкам более высокого порядка, присваиваются стандартизированные выступы, так что можно создавать повторно используемые библиотеки деталей. Большинство бактериальных наборов инструментов MoClo предназначены для клонирования моноцистронных транскрипционных единиц и не предусматривают структурированного пути для сборки полицистронных оперонов. Этот протокол демонстрирует сборку полицистронных транскрипционных единиц с помощью инструментария In- & Out-Cloning . Тот же подход можно применить и к другим инструментариям MoClo.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Молекулярное клонирование, введение рекомбинантной ДНК в репликон, такой как плазмида, является основополагающей методологией в молекулярной биологии. В последние десятилетия методы построения и сборки ДНК становятся все более изощренными. К настоящему времени исследователи могут создавать целые синтетические хромосомы и даже геномы из синтезированной ДНК1. Традиционное молекулярное клонирование часто опирается на специальные стратегии клонирования и может быть трудоемким и дорогостоящим для больших мультигенных конструкций2. В последние годы клонирование Golden Gate (GG) и производные наборы инструментов иерархического модульного клонирования (MoClo) 2,3 стали популярными решениями, позволяющими быстро и экономично собирать ДНК.

Ферменты рестрикции типа IIS представляют собой эндонуклеазы, которые распознают направленную (непалиндромную) последовательность и расщепляются за пределами этой узнавающей последовательности4. В результате последовательности выступов, создаваемые расщеплением, не зависят от сайта узнавания, но могут быть выбраны4. Кроме того, функциональные фрагменты ДНК, называемые здесь «частями», могут быть сконструированы таким образом, что при расщеплении сайт узнавания удаляется с концов соединяемых частей2. Стратегии клонирования GG используют это для создания эффективных многокомпонентных сборок ДНК в однокомпонентных реакциях5. Наборы инструментов MoClo основаны на клонировании GG и направлены на обеспечение модульного и иерархического способа сборки мультигенных конструкций. Выступы, используемые для сборки деталей, стандартизированы, что позволяет создавать библиотеки повторно используемых и взаимозаменяемых деталей. Наборы инструментов MoClo основаны на акцепторных плазмидах, которые спроектированы таким образом, чтобы принимать несколько последовательностей ДНК и высвобождать собранный продукт. Каждая акцепторная плазмида содержит два сайта узнавания двух различных ферментов типа IIS, один из которых используется для приема груза ДНК, а другой — для высвобождения собранной ДНК 3,6. Иллюстрация этого принципа показана на рисунке 1 для клонирования отдельной части, терминатора, в плазмиду акцептора MoClo (уровень 0). Как акцепторная плазмида, так и вставка разрезаются ферментом рестрикции BbsI таким образом, что остаются совместимые выступы и удаляются сайты узнавания BbsI. Правильно лигированные плазмиды, таким образом, больше не разрезаются BbsI. Разрезание полученной плазмиды ферментом типа IIS SapI высвобождает ранее вставленный фрагмент на следующем этапе сборки (уровень 1).

В этом протоколеиспользуется инструментарий MoClo для ин- и аутклонирования 7. Здесь плазмиды уровня 0 содержат определенные фундаментальные генетические части, такие как промоторы с 5'-нетранслируемыми областями (UTR), кодирующие последовательности и терминаторы с 3'UTR, на рисунке 1 показан схематический обзор уровня 0. На уровне 1 несколько частей собираются в блок транскрипции (TU), на рисунке 2 показан схематический обзор частей уровня 1 и клонирования. Клонирование и клонирование MoClo был разработан для сборки транскрипционных единиц на уровне 1 без рубцов с использованием фермента типа IIS, который создает 3-нуклеотидные выступы. Это позволяет полностью находиться в пределах растра кодонов кодирующей последовательности, используя для сборки стартовые кодоны ATG и стоп-кодоны TGA. Уровни М и Р используются для сборки множественных транскрипционных единиц, высвобождаемых из плазмид уровня 1 3,8. На рисунке 3 показан схематический обзор деталей для клонирования на уровни M и P, а также сборка бицистронного оперона на уровне M (бицистронный оперон представляет собой транскрипционную единицу, которая выражает множественные кодирующие последовательности (CDS)). Уровни P и M были разработаны таким образом, чтобы обеспечить итеративный циклический переход от одного к другому, так что нет теоретического ограничения на количество деталей, которые могут быть собраны, однако это не описано в данном протоколе, так как основное внимание в этом протоколе уделяется демонстрации сборки бицистронного оперона. Несмотря на то, что количество деталей, которые могут быть собраны, не ограничено, существует ограничение на размер конструкции, которую можно собрать; до 100 000.о. было собрано с помощью комплекта MoClo9. Кроме того, большие конструкции или конструкции, содержащие токсичные гены, могут создавать нагрузку на клетку; Для этих случаев были опубликованы модифицированные протоколы10.

In- and Out-Cloning изначально не описывал схему сборки полицистронных транскрипционных блоков. Полицистронные опероны являются очень распространенным способом организации генов у бактерий 11,12,13, и поэтому существует заметный интерес к их сборке снизу вверх модульным способом 14. Здесь описана структурированная схема сборки полицистронных оперонов с использованием In- и Out-Cloning. Представленная схема позволяет легко менять местами кодирующие последовательности внутри полицистронных транскрипционных блоков, а также сборок, состоящих как из моно-, так и из полицистронной транскрипции.

В следующем пошаговом протоколе показано проектирование и клонирование полицистронного оперона с использованием ин- и аут-клонирования. Представленная стратегия клонирования полицистронных транскрипционных единиц может быть легко адаптирована к другим инструментариям MoClo.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол описывает проектирование и сборку полицистронного оперона с помощью трех уровней стандарта In-Cloning (0, 1 и M). Собранный здесь полицистронный оперон начинается с промотора, за которым следует рибосомный сайт связывания (RBS), кодирующая последовательность (CDS), второй RBS, второй CDS и, наконец, терминатор (рис. S1). Настоятельно рекомендуется использовать программное обеспечение для молекулярного клонирования для моделирования клонирования in silico, чтобы убедиться в правильности разработанной стратегии клонирования. Здесь описан пример сборки промотора в качестве детали Уровня 0, сборки RBS с кодирующей последовательностью и терминатором в блок транскрипции Уровня 1 и сборки бицистронного оперона на Уровне М, а на рисунке S1 показан схематический обзор всей сборки.

1. Уровень 0: Одомашнивание деталей

ПРИМЕЧАНИЕ: Термин «одомашнивание» используется для обозначения того, что молекулярная часть была интегрирована в библиотеку деталей MoClo и может быть собрана на всех уровнях набора MoClo. Как правило, все сайты узнавания ферментов рестрикции типа IIS, используемые в наборе, удаляют из одомашненной части, например, путем синонимичного перекодирования.

  1. Конструкция вкладыша
    1. Выберите молекулярные части, такие как промотор, CDS и терминатор, которые будут собраны вместе в опероне.
      Примечание: В этом протоколе оперон инициируется промотором PLuxB, который может быть активирован белком LuxR в присутствии индуктора N-(β-кетокапроил)-L-гомосеринового лактона (OC6)17. GFP – это первая CDS оперона; его RBS — это iGEM BBa_B0064. За GFP следует нетерминальный линкер, «терминаторный мост». Второй CDS — mTurquoise. Его RBS был разработан с помощью калькулятора RBS18. Наконец, оперон заканчивается терминаторомL3S2P21 19.
    2. Выберите положение, в котором должна быть собрана деталь, обзор показан на рисунке 1. Исходя из положения, выберите плазмиду-акцептор, которая будет использоваться в GG.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Детали могут быть одомашнены для последующего использования в различных положениях. Например, промотор может быть собран как единая деталь позже при соединении с деталью 5'UTR (pSL252), или он может быть одомашнен с уже содержащимся 5'UTR (pSL099). CDS может быть собран в четыре акцепторные плазмиды, собираться без метки (pSL102), собираться с N-концевой меткой (pSL104), собираться с C-концевой меткой (pSL101) или собираться как с N-концевой меткой, так и с C-концевой меткой (pSL103). В приведенном примере промотор одомашнен в pSL252, первый RBS одомашнен в pSL253, первый CDS одомашнен в pSL102, мост терминатора одомашнен в pSL106, второй RBS одомашнен в pSL099, второй CDS одомашнен в pSL102, а терминатор одомашнен в pSL106.
    3. Добавьте удлинители к проектируемой вставке на основе выбранной плазмиды акцептора. В таблице 1 представлен обзор расширения, необходимого для сборки GG для каждой плазмиды акцептора. Эти расширения должны быть добавлены во время проектирования праймеров для ПЦР, проектирования олигон в случае отжига двух олигон для создания детали или во время синтеза генов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы деталь была одомашнена, необходимо убедиться, что сама деталь не содержит сайтов узнавания ферментов типа IIS, используемых в наборе, SapI (5'-GCTCTTC-3'), BbsI (5'-GAAGAC-3') и BsaI (5'-GGTCTC-3'). Наличие сайтов узнавания в деталях резко снижает эффективность правильной сборки, так как конечный продукт может быть разрезан использованным ферментом типа IIS (см. рис. 1).
  2. Реакция GG
    1. Для реакции GG добавляют 50 флоль желаемой вставки, 50 фл акцепторной плазмиды, 1 мкл 10-кратного буфера ДНК-лигазы T4, 1 мкл Т4-лигазы и 1 мкл BbsI. Добавьте воду без нуклеаз в общий объем 10 μл. Кроме того, включите отрицательный контроль с той же реакцией без нужной вставки.
    2. Запустите в термоамплификаторе следующую программу: 25 циклов при 37 °C в течение 3 мин (37 °C — оптимальная температура фермента рестрикции) и 16 °C в течение 4 мин (16 °C — оптимальная температура Т4-лигазы), затем окончательное разложение при 50 °C в течение 20 мин (при 50 °C Т4-лигаза проявляет очень мало или совсем не проявляет активности. в то время как фермент рестрикции все еще способен функционировать, тем самым ограничивая количество неразрезанной акцепторной плазмиды в конечном продукте) и тепловая инактивация ферментов при 80 °С в течение 20 мин (при 80 °С все ферменты инактивируются при нагревании и реакция прекращается)6.
    3. Трансформировать реакцию GG путем добавления 5 мкл реакции GG в 50 мкл химически компетентных клеток E. coli и выполнить преобразование тепловым шоком со стадией восстановления, как описано в ранее опубликованном протоколе15.
    4. Распределите 100 мкл выростка трансформации на агаровой пластине Лурии-Бертани (LB) с 100 мкг/мл спектиномицина. Инкубируйте тарелку в течение ночи при температуре 37 °C.
    5. Сравните эффективность преобразования отрицательного контроля с эффективностью полной сборки, подсчитав количество белых колоний на обеих пластинах. Переходите к следующему шагу, если в сборке примерно в 10 раз (или более) белых колоний, чем в отрицательном контроле.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство полученных колоний должны быть белыми, и лишь небольшая часть красных колоний должна быть белой. Акцепторные плазмиды в наборе инструментов In-Cloning имеют двойную кассету выбора, содержащую либо mCherry (уровень 0 и уровень 1), либо LacZα (уровень M и уровень P), и ген ccdB , кодирующий ингибитор гиразы. Трансформация реакции GG осуществляется в ccdB-чувствительных клетках E. coli , таким образом, только клетки, имеющие собранную плазмиду, могут расти, в то время как исходная акцепторная плазмида не может размножаться. Примерами чувствительных к ccdB штаммов являются DH5α и TOP10. mCherry/LacZα позволяет визуально идентифицировать клетки, ускользающие от механизма ccdB 16.
    6. Для каждой сборки культивируйте две белые колонии, взяв некоторое количество материала колонии с помощью наконечника пипетки и ресуспендируя его в 5 мл LB-среды с 100 мкг/мл спектиномицина каждая, и инкубируйте в течение ночи при 37 °C в встряхивающем инкубаторе при 250 об/мин. Проводите экстракцию плазмиды в колонке в соответствии с инструкциями производителя. Убедитесь, что экстрагированная плазмида имеет ожидаемую последовательность с помощью секвенирования по Сэнгеру.

2. Уровень 1: Определение позиций

ПРИМЕЧАНИЕ: Уровень 1 - это уровень между одомашниванием деталей и сборкой полицистронного оперона (Рисунок 2). Здесь определяются позиции промежуточных сборок в итоговой конструкции. Положение сборки Уровня 1 в опероне может быть изменено с помощью другой плазмиды акцептора Уровня 1. Приведенный пример описывает сборку бицистронного блока, но приведенную схему можно легко адаптировать для сборки до шести кодирующих последовательностей (с RBS в каждой). Сборка большего количества кодирующих последовательностей дополнительно требует переключения между уровнями P и M. При итеративном циклировании между уровнями P и M не существует фиксированного верхнего предела количества кодирующих последовательностей, которые могут быть собраны в один оперон.

  1. Выбор деталей и плазмид акцептора
    1. Выберите детали уровня 0, которые будут собраны в блок транскрипции. Как минимум, они должны включать в себя промоутера, CDS и терминатора.
    2. Выберите положение, в котором должен быть собран блок транскрипции в опероне. Исходя из этого положения, выберите подходящую плазмиду-акцептор. Общий обзор показан на рисунке 2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 7 фрагментов ДНК для построения бицистронного оперона, показанного в качестве примера, собраны в две конструкции Уровня 1. Промотер, первый RBS, первый CDS и терминаторный мост собраны в pSL68; второй RBS, второй CDS и терминатор собраны в pSL69.
  2. Реакция GG
    1. Для реакции GG добавляют по 50 фмоль каждой из желаемых вставок, 50 фмоль акцепторной плазмиды, 1 мкл 10-кратного буфера Т4-ДНК-лигазы, 1 мкл Т4-лигазы и 1 мкл SapI. Добавьте воду без нуклеаз в общий объем 10 μл.
    2. Запустите в термоамплификаторе следующую программу: 25 циклов при температуре 37 °C в течение 3 минут и при 16 °C в течение 4 минут, затем окончательное разложение при 50 °C в течение 20 минут и нагревательная инактивация ферментов при 80 °C в течение 20 минут6 минут.
    3. Дополнительно: Добавьте 0,5 мкл SapI в реакцию GG и инкубируйте при 37 °C в течение 1 ч.
      Примечание: SapI не так стабилен, как другие используемые ферменты рестрикции типа IIS. Было обнаружено, что стадия расщепления с SapI после реакции GG уменьшает количество колоний, несущих религированную акцепторную плазмиду. SapI содержит изошизомер, BspQI, который может не нуждаться в этой заключительной стадии пищеварения.
    4. Преобразуйте 5 мкл реакции GG в 50 мкл химически компетентных клеток E. coli и проведите преобразование с тепловым шоком, предпочтительно со стадией восстановления, как это выполнено на стадии 1.2.3.
    5. Планшет 100 мкл выроста трансформации на агаровой пластине LB с ампициллином 100 мкг/мл. Инкубируйте тарелку в течение ночи при температуре 37 °C.
    6. Для каждой из них культивируют две белые колонии, взяв некоторое количество материала из колонии с помощью наконечника пипетки и повторно суспендируя его в 5 мл LB-среды с 100 мкг/мл ампициллина каждая. Инкубировать в течение ночи при 37 °C в встряхивающем инкубаторе при 250 об/мин. Проводите экстракцию плазмиды в колонке в соответствии с инструкциями производителя.
    7. Подтвердите правильность сборки с помощью дайджеста ограничений с помощью BbsI, убедившись, что размер выреза соответствует ожидаемому размеру вставки. Расщепите 1000 нг плазмидной ДНК, добавив 1 мкл соответствующего 10-кратного буфера для расщепления и 1 мкл BbsI. Добавьте воду без нуклеаз в общий объем 10 μл. Инкубируйте реакцию при 37 °C в течение 15 минут.
    8. Проведите гель-электрофорез, загрузив расщепленную плазмиду на 1% агарозный гель, запустите гель при напряжении 100 В в течение 35 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Может быть выполнено расщепление in silico ожидаемой плазмиды для моделирования агарозного геля для прогнозирования результата.

3. Уровень М: Сборка полицистронного оперона

ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе происходит сборка полицистронного оперона. В представленном случае бицистронного оперона в положениях 1 и 2 собраны две вставки уровня 1. Соответственно, выбирается акцепторная плазмида pMA60. Кроме того, требуется концевой линкер. Все акцепторные плазмиды уровней M и P имеют выступ GGGA в качестве второго выступа. Концевые сшиватели соединяют вставку и плазмиду акцептора и позволяют собирать конструкцию уровня P в конструкцию уровня M и наоборот. Для сборки уровня P из двух пластин уровня 1 используется торцевой компоновщик pMA668, который займет третье и последнее положение. Обзор уровней M и P, а также визуализация этапа клонирования показаны на рисунке 3. При сборке только на уровне M (или P) можно клонировать опероны, содержащие до 6 кодирующих последовательностей (позиции 1-6). Позицию 7 занимает конечный компоновщик. Сборка большего числа кодирующих последовательностей в опероне возможна, но требует переключения на уровень M (или P), который не описан в данном протоколе.

  1. Для реакции GG добавляют 50 флоль каждой желаемой вставки, 50 фл акцепторной плазмиды, 1 мкл 10x Т4 ДНК-лигазного буфера, 1 мкл Т4-лигазы и 1 мкл BbsI. Добавьте воду без нуклеаз в общий объем 10 μл.
  2. Запустите в термоамплификаторе следующую программу: 50 циклов при 37 °C в течение 3 мин и при 16 °C в течение 4 мин, затем окончательное разложение при 50 °C в течение 20 мин и нагревательная инактивация ферментов при 80 °C в течение 20 мин6.
  3. Преобразовать 5 мкл реакции GG в 50 мкл химически компетентных клеток E. coli и выполнить преобразование тепловым шоком со стадией восстановления, как это выполнено на шаге 1.2.3.
  4. Распределите 100 мкл выростка трансформации на агаровую пластину LB с 100 мкг/мл спектиномицина. Инкубируйте планшет в течение ночи при 37 °C или при 30 °C, если ожидается метаболическая нагрузка или токсичность сборки.
  5. Для каждой сборки сделайте культуру из двух белых колоний. С этой целью опустите наконечник пипетки в колонию и используйте его для инокуляции 5 мл LB 100 мкг/мл спектиномицина. Инкубировать в течение ночи при температуре 37 °C или 30 °C в встряхивающем инкубаторе со скоростью 250 об/мин. Проводите экстракцию плазмиды в колонке в соответствии с инструкциями производителя.
  6. Подтвердите правильность сборки с помощью дайджеста ограничений с помощью BsaI, проверив, что размер выреза соответствует ожидаемому размеру вставки, как это выполнено в шаге 2.2.7.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конструкция может быть слишком длинной, чтобы ее можно было покрыть секвенированием по Сэнгеру для подтверждения. Затем это может быть подтверждено с помощью полноплазмидного секвенирования, которое доступно в качестве коммерческой услуги у нескольких поставщиков услуг секвенирования.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь показаны результаты восходящей сборки полицистронного оперона от уровня 0 до уровня M (рисунок S1). Оперон инициируется промотором PLuxB, который может быть активирован белком LuxR в присутствии индуктора N-(β-кетокапроил)-L-гомосеринового лактона (OC6)17. GFP – это первая CDS оперона, ее RBS – iGEM BBa_B0064. За GFP следует нетерминальный линкер, «терминаторный мост». Второй RBS спроектирован с помощью калькулятора RBS

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Молекулярное клонирование может быть трудоемким и громоздким, особенно при использовании специальных стратегий клонирования. Наборы инструментов MoClo могут улучшить молекулярное клонирование благодаря своей модульности, иерархической сборке и высокоэффективным одногоршковым реакциям. Они полагаются на сборку ДНК с помощью реакций Золотых Ворот. Благодаря стандартизированным вылетам библиотеки молекулярных частей могут быть повторно использованы и совместно использоваться с друг...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TAL, STdV и DS были поддержаны Обществом Макса Планка в рамках проекта MaxGENESYS.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
АмпициллинMerck Life ScienceA9518
Бактериальный агарFisher Scientific P0011B
BbsI-HFNew England BiolabsR3539
BsaI-HF V2New England BiolabsR3733
E. coli DH5α компетентные клетки
Eppendorf  Mastercycler  Nexus Thermal CyclersЭппендорф6333000014
Микрообъёмный спектрофотометр EzDrop 1000Blue-Ray BiotechBRED-1000
GeneJET Plasmid Miniprep KitThermo ScientificK0503
In- & Выход — набор инструментов для клонирования
Лигазный буферNew England BiolabsB0216
NaClFisher Scientific BP358
New Brunswick Innova®   42/42R — стекируемый инкубаторный шейкерЭппендорфM1335-0080
PhenoBooth+Певческие инструментыPHB-007
SapINew England BiolabsR0569
СпектиномицинMerck Life ScienceS4014
Стандартная лабораторная посуда
Лигаза ДНК T4New England BiolabsM0202
Thermomix MMB. Braun Biotech International
ТриптонFisher Scientific LP0042B
Экстракт дрожжейFisher Scientific LP0021B

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. James, J. S., Dai, J., Chew, W. L., Cai, Y. The design and engineering of synthetic genomes. Nat Rev Genet. 1, 1-22 (2024).
  2. Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S., Marillonnet, S. A modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs. PLoS One. 6 (2), e16765(2011).
  3. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), e3647(2008).
  4. Pingoud, A., Jeltsch, A. Structure and function of type II restriction endonucleases. Nucleic Acids Res. 29 (18), 3705-3727 (2001).
  5. Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. Golden Gate shuffling: A one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS One. 4 (5), e5553(2009).
  6. de Vries, S. T., Kley, L., Schindler, D. Use of a Golden Gate plasmid set enabling scarless MoClo-compatible transcription unit assembly. Golden Gate Cloning: Methods Protoc. 2850, 105-132 (2024).
  7. de Vries, S. T., Köbel, T. S., Sanal, A., Schindler, D. In-& Out-Cloning: Plasmid toolboxes for scarless transcription unit and modular Golden Gate acceptor plasmid assembly. Synth Biol. 9 (1), ysae016(2024).
  8. Schindler, D., Milbredt, S., Sperlea, T., Waldminghaus, T. Design and assembly of DNA sequence libraries for chromosomal insertion in bacteria based on a set of modified MoClo vectors. ACS Synth Biol. 5 (12), 1362-1368 (2016).
  9. Zumkeller, C., Schindler, D., Felder, J., Waldminghaus, T. Modular assembly of synthetic secondary chromosomes. Bacterial Chromatin: Methods Protoc. 2819, 157-187 (2024).
  10. Hoffmann, S. A. YeastFab cloning of toxic genes and protein expression optimization in yeast. Golden Gate Cloning: Methods and Protocols. , Springer, New York. (2025).
  11. Sun, G., et al. Cross-evaluation of E. coli's operon structures via a whole-cell model suggests alternative cellular benefits for low- versus high-expressing operons. Cell Syst. 15 (3), 227-245.e7 (2024).
  12. Zhao, J., et al. Multifaceted stoichiometry control of bacterial operons revealed by deep proteome quantification. Front Genet. 10, 1-12 (2019).
  13. Müntjes, K., et al. Establishing polycistronic expression in the model microorganism Ustilago maydis. Front Microbiol. 11, 1-10 (2020).
  14. Behrendt, G., Frohwitter, J., Vlachonikolou, M., Klamt, S., Bettenbrock, K. Zymo-Parts: A Golden Gate modular cloning toolbox for heterologous gene expression in Zymomonas mobilis. ACS Synth Biol. 11 (11), 3855-3864 (2022).
  15. Green, R., Rogers, E. J. Chemical transformation of E. coli. Methods Enzymol. 529, 329-336 (2013).
  16. Köbel, T. S., et al. An easy-to-use plasmid toolset for efficient generation and benchmarking of synthetic small RNAs in bacteria. ACS Synth Biol. 11 (9), 2989-3003 (2022).
  17. Meyer, A. J., Segall-Shapiro, T. H., Glassey, E., Zhang, J., Voigt, C. A. Escherichia coli "Marionette" strains with 12 highly optimized small-molecule sensors. Nat Chem Biol. 15 (2), 196-204 (2019).
  18. Salis, H. M., Mirsky, E. A., Voigt, C. A. Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression. Nat Biotechnol. 27 (10), 946-950 (2009).
  19. Chen, Y. J., et al. Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints. Nat Methods. 10 (7), 659-664 (2013).
  20. Togna, A. P., Shuler, M. L., Wilson, D. B. Effects of plasmid copy number and runaway plasmid replication on overproduction and excretion of beta-lactamase from Escherichia coli. Biotechnol Prog. 9 (1), 31-39 (1993).
  21. Messerschmidt, S. J., et al. Optimization and characterization of the synthetic secondary chromosome synVicII in Escherichia coli. Front Bioeng Biotechnol. 4, 1-9 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Modular CloningGolden Gate CloningPolycistronic OperonsType IIS EnzymesDNA AssemblyMultigene ConstructsStandardized OverhangsRibosome Binding SiteHeat Shock TransformationAgarose Gel Electrophoresis

Related Articles