Оптимизация выделения и очистки мезангиальных клеток клубочков мышей

Summary

В этом исследовании был разработан оптимизированный протокол для выделения мышиных мезангиальных клеток (МЦ) и их культуры клеток ex vivo . Эти клетки могут быть пропущены несколько раз, заморожены, оживлены и культивированы без ущерба для роста клеток или экспрессии белка.

Abstract

Мезангиальные клетки (МЦ) — это стромальные клетки, расположенные в среднем пространстве клубочка, выполняющие ключевые функции в гомеостазе клубочков. Методы выделения, очистки и культивирования клубочковых ТК разрабатываются и оптимизируются с 1980-х годов для использования в биомедицинских исследованиях, в частности в области нефрологии. Мыши являются наиболее часто используемыми экспериментальными животными моделями в исследованиях почечных заболеваний. В этом исследовании мы разработали оптимизированный протокол для выделения мышиных ТК и культивирования клеток ex vivo . Эти клетки могут быть пропущены несколько раз, заморожены, оживлены и культивированы без ущерба для роста клеток или экспрессии белка. Такой оптимизированный подход значительно сокращает продолжительность исследования для исследователей и обеспечивает долгосрочную сохранность клеток. Необходимое оборудование для процедур легко доступно в базовой биомедицинской лаборатории, а этапы процедуры просты. Для получения клеток-мишеней требуется всего 2-3 недели, сокращение не менее чем на 1 неделю по сравнению с существующими методами.

Introduction

Клубочковый клубок представляет собой сеть капилляров, которая выполняет важную задачу фильтрации крови для формирования мочи¹. Мезангиальные клетки (МЦ) встроены в мезангиальный матрикс, расположенный между клубочковыми капиллярами, и обладают уникальными возможностями для влияния на динамику клубочков через свои разнообразные функции². ТК играют решающую роль в развитии клубочков, включая структурную поддержку клубочковых капилляров, фагоцитоз и продукцию матрицы базальной мембраны клубочков³. Изучение мезангиальных клеток имеет решающее значение для углубления нашего понимания физиологии и патологии почек.

Обращает на себя внимание и участие мезангиальных клеток в патологических состояниях. В ответ на повреждение клубочков или заболевание, такое как диабетическая нефропатия или гломерулонефрит, мезангиальные клетки могут пролиферировать и секретировать избыток компонентов внеклеточного матрикса, что приводит к гломерулосклерозу и нарушению функции почек ^4,5. Таким образом, понимание функций и регуляторных механизмов мезангиальных клеток имеет важное значение для разработки терапевтических стратегий при заболеваниях почек.

Мышиные мезангиальные клетки позволяют исследователям моделировать и исследовать молекулярные и клеточные процессы, связанные с такими состояниями, как IgA-нефропатия⁶, диабетическая нефропатия⁷ и фокальный сегментарный гломерулосклероз (ФСГС)^8,9. Учитывая их роль в развитии почечного фиброза и воспаления, мышиные клубочковые МЦ часто используются в клинических исследованиях для оценки эффективности терапевтических соединений ^9,10. Кроме того, мышиные мезангиальные клетки являются важным инструментом для изучения влияния различных сигнальных путей на функцию почек, включая путь RhoA/ROCK¹¹ и путь трансформирующего фактора роста-бета (TGF-β)¹². Эти исследования помогают выяснить, как эти сигнальные молекулы способствуют прогрессированию заболевания почек. Независимо от того, используются ли они для моделирования заболеваний, терапевтических разработок или исследований в области передачи сигналов, мышиные МК продолжают служить важнейшим ресурсом для улучшения нашего понимания здоровья почек и заболеваний.

В 1988 г. Mackay et al. разработали метод получения ex vivo клеточных линий клубочковых эпителиальных, мезангиальных и эндотелиальных клеток трансгенных мышей^. Уилсон и Стюарт разработали метод выделения и очистки первичных МК из почечной ткани пациента, который включает в себя три раунда просеивания и обширную промывку средой¹⁴. Мене и Стоппакчаро также предложили метод выделения первичных МК из ткани почек пациента или крысы. Эта техника включает в себя два раунда просеивания, два толчка иглой и расщепление коллагеназы. Клетки, полученные из 4-8 почек крысы, помещают на шестилуночный планшет, хотя выход относительно невелик^{и составляет 15}. Эти методы обуславливают необходимость рассечения почек на мелкие кусочки перед обработкой. Кроме того, эти подходы занимают примерно 3-4 недели для получения очищенных ТК.

Мыши являются наиболее часто используемыми экспериментальными животными моделями в исследованиях почечных заболеваний. Тем не менее, систематический метод выделения мышиных МК до сих пор отсутствует. В этом исследовании мы разработали оптимизированный протокол для выделения мышиных ТК и культивирования клеток ex vivo . Этот метод может быть использован при использовании первичных ТК почек мышей для экспериментальных исследований. По сравнению с предыдущими методами, такой подход устраняет необходимость разрезания и просеивания тканей перед перевариванием. Вместо этого вся почка мыши измельчается с помощью клеточной мельницы и непосредственно переваривается коллагеназой. Затем раствор для сбраживания дважды просеивают, при этом все клетки собираются на втором сите и снова суспендируются. Этот метод позволяет двум почкам мыши производить достаточное количество клеток для посева двух-трех 100-мм культуральных чашек в течение 10 дней. Очищенные ТК впоследствии получают путем культивирования и очистки с использованием специализированной среды, содержащей D-валин. Эти клетки могут быть пропущены несколько раз, заморожены, оживлены и культивированы без ущерба для роста клеток или экспрессии белка. Оборудование, необходимое для этих процедур, легко доступно для базовых биомедицинских лабораторий, а весь процесс занимает всего 2-3 недели для получения клеток-мишеней. Этот метод подходит для исследований с участием мышиных ТК для изучения заболеваний или механизмов, связанных с почками, поскольку он эффективен и экономит время.

Protocol

Эксперименты на животных проводились в соответствии с руководящими принципами ARRIVE, а все процедуры на животных проводились в соответствии с национальным законодательством и Директивой Европейской комиссии (2010/63/EU). Мыши содержались и содержались в условиях, свободных от патогенов, в соответствии с требованиями комитетов по уходу и использованию животных Западно-Китайской больницы Сычуаньского университета. Все экспериментальные исследования на животных были одобрены комитетами по уходу за животными и их использованию Западно-Китайской больницы Сычуаньского университета. Восьминедельные самцы мышей C57BL/6JGpt были использованы для выделения мезангиальных клеток в этом анализе. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов. На рисунке 1 показаны процедуры выделения и очистки клубочковых мезангиальных клеток мышей.

1. Приготовление реагентов для выделения мышиных ТК

ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все реагенты и оборудование стерильны.

1. Коллагеназа I типа (750 Ед/мл): Взвесьте порошок и растворите незадолго до использования в RPMI 1640.
2. Мезангиальные среды для культивирования клеток 1: Смешайте RPMI 1640 с 2 мМ глутамина, 17% FBS, антибиотиками (100 ЕД/мл пенициллина плюс 10 000 мкг/мл стрептомицина) и 0,1 ЕД/мл инсулина.
3. Мезангиальные среды для культивирования клеток 2: Сочетайте RPMI 1640 (D-валин) с 2 мМ глутамина, 10% FBS, антибиотиками (100 ЕД/мл пенициллина плюс 10 000 мкг/мл стрептомицина), ITS-G (инсулин, трансферрин, раствор селена 100x) и 0,1 ЕД/мл инсулина. Хранить мезангиальные среды для культивирования клеток при температуре 4 °C и использовать в течение 1 месяца после приготовления.
4. Среда для криоконсервации клеток: Приготовьте смесь среды RPMI 1640, сыворотки и ДМСО в соотношении 7:2:1.

2. Выделение мышиных ТК

1. Мышей гуманно приносят в жертву с помощью асфиксии CO₂ с последующим вывихом шейки матки (в соответствии с институционально утвержденными протоколами). Погрузите туши в мензурку, содержащую 75% спирта для стерилизации, затем переложите животное на асептическую рабочую поверхность.
2. Асептически удалите почки мыши с помощью ножниц и пинцета, поместите их в чашку Петри, промойте EBSS (Earle's Balanced Salt Solution), затем осторожно удалите соединительную ткань и капсулу почки с помощью пинцета.
3. Разрежьте почку пополам по вертикали, добавьте 3-4 мл раствора коллагеназы I и измельчите пестиком из пластиковой ячейки.
4. Пипеткой нанесите все ткани и раствор из чашки Петри в центрифужную пробирку объемом 15 мл. Промойте чашку Петри 1-2 мл раствора коллагеназы I, чтобы обеспечить перенос всех тканей. Поместите раствор в шейкер при температуре 37 °C, встряхивая при 120 об/мин в течение 30 минут. Затем добавьте равное количество стопового раствора (культуральная среда 1).
5. Наберите раствор из центрифужной пробирки объемом 15 мл, пропустите его через сетчатый фильтр 100 мкм и соберите фильтрат в центрифужную пробирку объемом 50 мл.
6. Пропустите жидкость с шага 2.5 через сетчатый фильтр 40 μm, удерживая только клетки на сетчатом фильтре 40 μm. Повторно промойте сетчатое фильтр питательной средой 1, чтобы обеспечить сбор как можно большего количества клеток на фильтре. Переложите собранные клетки из сетчатого фильтра в новую центрифужную пробирку объемом 50 мл.
7. Центрифугируйте суспензию при 600 x g в течение 5 минут (при комнатной температуре), затем повторно суспендируйте клетки в чашке для культивирования клеток в соответствии с плотностью клеток. Как правило, ресуспендируют клетки двух почек в двух или трех 100 мм чашках для культивирования (10 мл питательной среды 1/100 мм). Поместите посуду в клеточный инкубатор с температурой 37 °C и содержанием_CO2 95% воздуха/5%.
8. Исследуйте морфологию и адгезию клеток под микроскопом (40×) на следующий день. Если в питательной среде присутствуют плавающие мертвые клетки, используйте пипетку для удаления среды со дна чашки для культивирования, стараясь не потревожить прикрепленные клетки.
9. Добавьте 1-2 мл PBS вдоль внутреннего края чашки для культивирования для промывки клеток. С помощью пипетки удалите всю PBS со дна питательной чашки и, наконец, добавьте 10 мл питательной среды 1 вдоль внутреннего края питательной чашки.

3. Очищение мышиных МК

1. Через день после отделения удалите неадгезивные клетки, аккуратно промыв и заменив питательную среду свежей питательной средой 1, как описано в шаге 2.8. Наблюдайте за клетками клубочков под фазово-контрастным микроскопом (40×).
   Примечание: Яркие сферические формы представляют клубочек, в то время как окружающие клетки демонстрируют булыжники, характерные для эпителиальных клеток (рис. 2А).
2. Наблюдайте за морфологией клеток через 1-3 дня (рисунок 2B-C). Звездчатые и веретенообразные клетки появятся вокруг булыжных клеток, как показано на рисунке 2D.
3. Когда клетки достигнут 80% конфлюенции (обычно в течение 7-10 дней), дважды промойте клетки стерильным PBS, затем трипсинизируйте клетки 0,25% раствором трипсина (2 мл 0,25% раствора трипсина на 100 мм чашку).
4. Начальный процесс трипсинизации клеток может занять приблизительно 20 минут. После добавления трипсина поместите чашку в инкубатор при температуре 37 °C. Наблюдайте за процессом в режиме реального времени под фазово-контрастным микроскопом (40×) для оценки трипсинизации клеток.
5. Завершите процесс трипсинизации добавлением равного объема среды2, когда большинство клеток проявляют округлую морфологию и отделяются от поверхности чашки.
6. Центрифугируйте клетки при 600 × г в течение 5 мин (при комнатной температуре), затем повторно суспендируйте их в среде 2. Как правило, ресуспендирование клеток из одной чашки 100 мм в двух чашках для культур 100 мм (чашка 10 мл для культуральных сред 2/100 мм).
7. Смените питательную среду 2 на следующий день. Наблюдайте под микроскопом многочисленные взвешенные клетки и фрагменты клеток (40×), так как только ТК могут выживать и размножаться в среде D-валина¹⁶. Меняйте среду каждые 1–2 дня, чтобы удалить омертвевшие клетки. Адгезивными клетками в культуре являются ТК (рис. 3A-D). Определите скорость роста изолированных ТК (рисунок 3E).
8. Как только клетки достигнут 80% слияния, трипсинизируйте и пройдите их. МК обычно требуется примерно 5-10 минут для трипсинизации.

4. Долговременная сохранность мышиных ТК

Примечание: Поскольку первичные клетки могут дифференцироваться и мутировать со временем и множественными пассажами, замораживайте и храните МК после очистки клеток для долгосрочного сохранения.

1. Осторожно удалите надосадочную жидкость по нижнему краю чашки с помощью пипетки, дважды промойте ячейки стерильным PBS, затем трипсинизируйте 0,25% раствором трипсина (2 мл 0,25% раствора трипсина на 100 мм посуду). Выполните шаги трипсинизации, описанные в шагах 3.3-3.8.
2. После трипсинизации добавьте равный объем среды 2, чтобы завершить процесс, и переложите всю жидкость в центрифужную пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте клетки при 600 × г в течение 5 минут (при комнатной температуре), выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 1 мл PBS для подсчета клеток.
3. Используйте автоматический счетчик ячеек для подсчета ячеек. Возьмите 20 мкл из 1 мл раствора ресуспендированных клеток и добавьте его в специальный планшет для подсчета клеток, чтобы определить общее количество клеток. В зависимости от количества клеток ресуспендируйте их в клеточных криоконсервирующих средах (1 мл клеточной криоконсервирующей среды на 10–⁶ клеток).
4. Перелейте клеточный раствор в пробирки для криоконсервации (1 мл клеточного криоконсервирующего материала на 2 мл пробирки для криоконсервации) и выполните медленную заморозку до -80 °C перед переносом в жидкий азот для консервации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ресуспендируйте и засейте клетки в чашках для клеточных культур для амплификации по мере необходимости. Клетки следует использовать между отрывками 3 и 8 после полной характеристики¹⁷.

5. Идентификация мышиных МК

ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как клетки будут пройдены дважды, определите мышиных МК с помощью следующих методов.

1. Западный блот мышиных МС
   ПРИМЕЧАНИЕ: Реагенты, необходимые для процедуры, приведены в Дополнительной таблице 1.
   1. Трипсинизируйте клетки, следуя тем же шагам, что и в 3.3-3.8 и шаге 4.1.
   2. После сбора клеток лизируйте клетки для извлечения белков и измерьте концентрацию белка.
   3. Возьмите соответствующее количество образца (обычно 20 нг), добавьте загрузочный буфер и денатурируйте при 100 °C в течение 5 минут.
   4. Растворите белок (20 нг) с помощью 10% геля SDS-PAGE или 7,5% геля SDS-PAGE, затем перенесите его на целлюлозную мембрану при постоянном напряжении.
   5. Заблокируйте мембрану 5% обезжиренным молоком, затем инкубируйте с первичным антителом при 4 °C в шейкере в течение ночи.
   6. Инкубировать со вторичным антителом при комнатной температуре в течение 1 ч после промывки TBST (Tris Buffered Salt with Tween 20) три раза.
   7. Обнаружение сигналов с помощью системы формирования изображений.
      Примечание: Основные антитела, использованные в этом исследовании, включали мышиный анти-αSMA (1:500), кроличий анти-виментин (1:2000), кроличий антифибронектин (1:2000) и мышиный анти-GAPDH (1:50000). Вторичные антитела, использованные в этом исследовании, включали пероксидазу-конъюгированный козий антикролик IgG (H + L) (1:5000) и пероксидаза-конъюгированный козий анти-мышиный IgG (H + L) (1:5000).
2. Иммунофлуоресцентное окрашивание мышиных ТК
   ПРИМЕЧАНИЕ: Реагенты, необходимые для процедуры, приведены в Дополнительной таблице 2.
   1. Трипсинизируйте клетки, следуя тем же шагам, что и в шагах 3.3-3.8 и шаге 4.1.
   2. Повторно подвесьте клетки и подсчитайте их. Возьмите 1 x 10⁵ клеток и добавьте их в чашку для культивирования клеток со стеклянным дном 15 мм (1 мл питательных сред 2 на стеклянное дно 15 мм).
   3. Зафиксируйте МК 4% параформальдегидом на 15 мин (1 мл 4% параформальдегида на 15 мм стеклянного дна), затем трижды промойте PBS.
   4. Обрабатывайте МК 0,1% Triton X-100 в течение 10 минут для проникновения в клеточные мембраны.
   5. После еще трех промывок PBS заблокируйте ячейки при комнатной температуре 3% раствором BSA PBS на 30 минут.
   6. Промойте клетки и инкубируйте их с первичными антителами против мышиной αSMA и антителами против виментина кролика при температуре 4 °C в течение ночи.
   7. Инкубировать в течение 1 ч с вторичным ослиным антимышиным IgG, конъюгированным с красным Alexa 594, и ослиным антикроличьим IgG, конъюгированным с зеленым FITC при комнатной температуре.
   8. Используйте DAPI для ядерного противозапятнания в течение 1 минуты при комнатной температуре.
   9. Добавьте флюоромонтажный носитель и накройте предметным стеклом. Проанализируйте клетки с помощью конфокального микроскопа.
      Примечание: Основные антитела, использованные в этом исследовании, включали мышиный анти-αSMA (1:200) и кроличий анти-виментин (1:200). Вторичные антитела, использованные в этом исследовании, включали ослиный антимышиный IgG, конъюгированный с красным Alexa 594 (1:400), ослиный антикроличий IgG, конъюгированный с зеленым FITC (1:400), и DAPI (1:1000).
3. Проточная цитометрия мышиных ТК
   1. Трипсинизируйте клетки, следуя тем же шагам, что и в шагах 3.3-3.8 и шаге 4.1.
   2. Повторно подвесьте клетки и подсчитайте их. Возьмите 5 x 10⁵ клеток и промойте их один раз 3 мл PBS.
   3. Ресуспендируйте клетки 100 мкл PBS в проточной трубке, затем добавьте 1-2 мкл антитела против мышиного PDGFRB (CD140b).
   4. Инкубируйте клетки на льду в течение 30 минут в темноте, затем проведите анализ с помощью проточной цитометрии.

Results

В этом исследовании был разработан оптимизированный протокол выделения мышиных ТК и культивирования клеток ex vivo. Насколько нам известно, не существует стандартного метода валидации первичных МК ex vivo. Согласно предыдущим публикациям, ТК характеризуются экспрессией αSMA, Виментина и Фибронектина ^3,14,15. Для определения уровней экспрессии МК был использован вестерн-блоттинг. Выделенные в этом исследовании Т...

Discussion

Заболевания, связанные с почками, широко распространены, и мыши широко используются в качестве основной животной модели для изучения этих состояний из-за их генетического сходства с людьми и наличия хорошо зарекомендовавших себя моделей заболеваний. Мезангиальные клетки играют решающую роль в поддержании нормальной структуры и функции клубочка, обеспечивая структурную поддержку, регулируя клубочковую фильтрацию и участвуя в иммунных реакциях. Несмотря на то, что существуют различные эксп...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 &микро; m Сетчатое фильтр	Biosharp	BS-100-CS
100 мм Чашка Петри	Sorfa	230301
15 мл Центрифуга Пробирка	Sorfa	411000
15 мм Чашка для клеточной культуры со стеклянным дном	Sorfa	201200
180 кДа плюс Предварительно окрашенный белковый маркер	Vazyme	MP201-01
2 мМ L-глутамин	BasalMedia	S210JV
4% параформальдегид	Biosharp	BL539A
40 &; m Сетчатое фильтр	Biosharp	BS-40-XBS
50 мл Центрифужная пробирка	Sorfa	41000
60 мм Чашка Петри	Sorfa	230201
75% спирт	Knowles	64-17-5
96 Well Cell Culture Plates, обработанные TC	Servicebio	CCP-96H
Антибиотики (10 μ г/мл цефтриаксона плюс 100 мкм; г/мл гентамицина)	NCM	C100C5
BCA (бицинхониновая кислота) Набор для анализа белка	CWBIO	CW0014S
Набор для подсчета клеток-8	Oriscience	CB101
Конфокальный микроскоп	FV-3000	Olympus
DMSO	Sigma	D2650
DMSO	Sigma	D2650
Earle's Сбалансированный раствор соли (1x EBSS)	Beyotime	C0213
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Excell	FSP500
Флуоресцентный анализатор клеток	Mira FL	Countstar
Fluoromount media	Southern Biotech	0100-01
Инсулин, трансферрин, раствор селена 100x (ITS -G)	Gibco	41400045
Инвертированный флуоресцентный микроскоп	Olympus	IX83
Буфер для лизиса	Adilab	PP1101
Набор для подготовки одношаговой страницы (10%)	Oriscience	PB102
Набор для подготовки одноэтапной страницы (7,5%)	Oriscience	PB101
PE антимышиный CD140b антитела	Biolegend	323605
фосфатно-солевой буфер (PBS)	Servicebio	G4202
Пестик для пластиковых клеток	Biofil	CC-4090
Коктейль ингибиторов протеиназы	Roche	4693159001
PVDF Мембрана	Vazyme	E802-01
Рекомбинантный человеческий инсулин	Solarbio	11061-68-0
Мемориальный институт Розуэлл Парк (RPMI) 1640 Medium	Corning	10-040-CV
SDS-PAGE Буфер для загрузки образцов (5x)	Servicebio	G2013
Специально изготовленный по индивидуальному заказу Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium (D-валин вместо L-валина)	Procell	WH3923U222
TBS (Tris Buffered Salt Zone)	Servicebio	G0001-2L Triton
X-100	Biosharp	BS084
Трипсин-ЭДТА (0,25%)	Gibco	25200072
Tween 20	Biosharp	BS100
Коллагеназа типа I	Solarbio	КБ140