Методическая статья

Определение морфологии митохондрий в живых клетках с помощью конфокальной микроскопии

DOI:

10.3791/68167

⸱

3 июля 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1NMPA Key Laboratory for Research and Evaluation of Drug Metabolism & Guangdong Provincial Key Laboratory of New Drug Screening, School of Pharmaceutical Sciences, Southern Medical University, 2Central Laboratory, Southern Medical University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании мы описываем пошаговый протокол и выделяем ключевые детали для определения морфологических характеристик митохондрий в живых клетках, включая подготовку образцов, получение изображений и анализ данных. Этот метод обычно используется для изучения морфологии митохондрий для изучения различных состояний.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Динамический баланс митохондриального слияния и деления напрямую способствует митохондриальному гомеостазу, который влияет на многочисленные клеточные функции в дополнение к гомеостазу аденозинтрифосфата (АТФ). Таким образом, оценка морфологии митохондрий в условиях стресса имеет важное значение для механистических исследований. В этом исследовании описан подробный протокол анализа морфологии митохондрий, включающий приготовление раствора MitoTracker, окрашивание митохондрий, оптимизацию параметров визуализации и обнаружение морфологических особенностей. MitoTrackers — это широко используемые, экономически эффективные митохондриальные красители. Тем не менее, некоторые изменения в морфологии митохондрий могут произойти из-за неправильного обращения, которое может быть незаметным и не отражать истинное состояние митохондрий. Поэтому необходимо понимать, как анализировать изменения морфологии митохондрий с помощью MitoTrackers. В протоколе использовались клетки SH-SY5Y, стимулированные 1-метил-4-фенилпиридиния йодидом (MPP+) для иллюстрации протокола морфологического анализа митохондрий. По сравнению с контрольными клетками, MPP+-стимулированные клетки демонстрировали меньшие размеры и более фрагментированные митохондрии, с морфологическими параметрами, указывающими на уменьшение митохондриального следа. Эти результаты свидетельствуют о том, что окрашивание MitoTracker является эффективным и осуществимым методом морфологического анализа митохондрий, который (с незначительными модификациями) может быть применен для изучения различных состояний.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Морфология митохондрий поддерживается динамическим балансом слияния и деления митохондрий и, следовательно, влияет на энергетический гомеостаз и многие другие клеточные функции, что приводит к различным патологиям, таким как нейродегенеративные заболевания, рак и воспаление 1,2,3,4,5 . Для наблюдения за морфологией митохондрий было разработано несколько митохондриально-селективных окрашивателей, включая зонды и антитела, для использования с конфокальным микроскопом. Некоторые митохондрион-специфичные зонды, такие как тетраметилрозамин и родамин 123, функционируют на основе потенциала митохондриальной мембраны (ММП), что ограничивает их применимость в исследованиях состояний, разрушающих ММП 6,7. И наоборот, окрашивание антителами обеспечивает независимую от ММП морфологическую оценку для изучения морфологии митохондрий в фиксированных клетках. Несмотря на то, что подходящее окрашивание позволяет оценить морфологию митохондрий в фиксированных клетках, изучение морфологии митохондрий в живых клетках, нарушенных некоторыми индукторами, остается сложной задачей. MitoTracker, проникающий в клетки катионный и митохондрион-специфичный флуоресцентный зонд, предлагает решение этой проблемы, позволяя окрашивать как живые, так и фиксированные клетки. Этот зонд широко использовался для изучения морфологии митохондрий в исследованиях различных заболеваний 8,9,10,11. Тем не менее, в некоторых исследованиях сообщалось о таких проблемах, как высокий фоновый сигнал и неспецифическое связывание, даже когда зонд используется в строгом соответствии с рекомендациями, предоставленными производителем. Эти наблюдения подчеркивают важность глубокого понимания подготовки образцов и получения изображений для успешного анализа морфологии митохондрий.

Для облегчения анализа морфологии митохондрий были разработаны различные программы и алгоритмы обработки изображений 12,13,14,15,16. В этом исследовании мы использовали макроинструмент «Анализ митохондриальных сетей» (MiNA) в ImageJ для анализа морфологии митохондрий13. Этот инструмент эффективно идентифицирует и характеризует морфологические особенности митохондриальных сетей путем вычисления девяти описательных параметров, включая количество особей (структур без ответвлений), количество сетей (количество объектов с хотя бы одним пикселем соединения), среднюю длину (среднюю длину всех палочек и ветвей), медианную длину (медианную длину всех палочек и ветвей), стандартное отклонение длины (стандартное отклонение отдельных длин), средний размер сети (среднее число ветвей в сети), медианный размер сети (среднее значение числа ветвей в сети), стандартное отклонение размера сети (стандартное отклонение числа ветвей в сети) и митохондриальный след (общая площадь сигнала после разделения фона). В этом протоколе митохондриальный след был выбран в качестве репрезентативного параметра.

Целью данного исследования является предоставление пошагового протокола для морфологического анализа митохондрий, уделяя особое внимание ключевым деталям. Для демонстрации этого протокола мы использовали MPP+-индуцированные клетки SH-SY5Y. MPP+ ингибирует комплекс I митохондриальной дыхательной цепи в дофаминергических нейронах, что приводит к нарушению морфологии и функции митохондрий 8,17. Протокол морфологического анализа, описанный в данном исследовании, позволяет получать изображения с высоким разрешением и оценивать соответствующие параметры для определения морфологических особенностей митохондриальных сетей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка

  1. Растворите MPP+ с диметилсульфоксидом (ДМСО) до получения 1 мМ исходного раствора и храните его при температуре -30 °C в темноте (см. Таблицу материалов).
  2. Растворите 50 г MitoTracker (MitoTracker Red CMXRos) в 94 μл ДМСО, чтобы получить 1 мМ исходный раствор. Разложите исходный раствор по нескольким микроцентрифужным пробиркам и храните в защищенном от света месте при температуре -30 °С до дальнейшего использования.
  3. Инкубируйте клетки SH-SY5Y в колбах с модифицированной средой F-12 Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 от Dulbecco с добавлением 10% (v/v) фетальной бычьей сыворотки (FBS) во увлажненной среде с 5%CO2 и 95% воздуха при 37 °C. Для пассирования клетки отделить 0,05% раствором трипсина на 1 мин и центрифугировать при 100 × г в течение 3 мин.

2. MPP+ стимуляция

  1. Посадите клетки SH-SY5Y на конфокальные чашки со стеклянным дном и выдержите их в среде DMEM/F12 с добавлением 1% (v/v) FBS в течение ночи.
  2. Замените питательную среду, затем инкубируйте клетки с MPP+ или без него в течение 24 ч.

3. Окрашивание MitoTracker

  1. Предварительно подогрейте DMEM/F12, затем разбавьте стоковый раствор MitoTracker DMEM/F12 до получения рабочего раствора 50 нМ. Храните раствор в защищенном от света месте в течение всей процедуры.
  2. Удалите среду для клеточных культур и вымойте конфокальную посуду 2 раза свежим DMEM/F12.
  3. Инкубируйте клетки в каждой чашке с 1 мл рабочего раствора MitoTracker в течение 15 минут при температуре 37 °C в темноте.
  4. Снимите рабочий раствор MitoTracker и промойте 2 раза DMEM/F12.
  5. Добавьте 1 мл DMEM/F12 в каждую чашку и инкубируйте в клеточном инкубаторе перед визуализацией.

4. Параметры визуализации для конфокального микроскопа

  1. Предваряйте микроскоп для последующих операций. Под панелью регистрации отрегулируйте параметры, связанные с траекторией света, установив длины волн возбуждения и излучения.
  2. Установите следующие параметры: размер точечного отверстия — 1,2 а.е.; размер сканирования пикселей — 1,024 x 1,024; время задержки пикселя — 2,4 μс (в среднем 2x)  (для калибровки сохраняйте его постоянным).

5. Оптимизация параметров визуализации

ВНИМАНИЕ: Избегайте воздействия на глаза как прямого, так и рассеянного излучения видимого и/или невидимого лазера.

  1. Во избежание фототоксичности используйте галогенный свет для фокусировки на клетках с помощью апохроматической линзы объектива plan apochromatic 60x (1,4 NA).
  2. Отрегулируйте мощность лазера и высокое напряжение (HV) чуть ниже уровня насыщенности, установите коэффициент масштабирования на 3 и затем сделайте снимки.
  3. Перемещайте область интереса и сосредоточьтесь на ячейках, чтобы делать снимки без изменения настроек.

6. Анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Данные были проанализированы с использованием программы ImageJ, предустановленной с плагином MiNA13. Для получения точных релевантных измерений изображения должны захватывать независимо разрешенные митохондрии с чистым и ярким окрашиванием.

  1. Чтобы повысить качество изображения перед двоичным преобразованием и скелетированием, откройте изображение и выполните предварительную обработку. Используйте инструмент ROI для выбора области одной ячейки. Применение процесса | Фильтры | Функция Unsharp Mask для повышения резкости, а также используйте функцию Process | Функция Enhance Contrast (Повышение контрастности) для уменьшения чрезмерного усиления шума. Чтобы удалить шум от соли и перца, используйте функцию «Процесс | Фильтры | Медианная функция (см. дополнительный рисунок S1).
  2. Чтобы построить упрощенную морфологическую модель для вычисления описательных параметров, преобразуйте изображение в двоичное с помощью порогового значения (нажмите на Process | Двоичный | Make Binary), а затем скелетировать двоичное изображение с помощью функции Skeletonize (нажмите на Process | Двоичный | Скелетизировать) (см. дополнительный рисунок S2).
  3. Сгруппируйте все пиксели в скелете с помощью команды Analyze | Скелет | Функция Анализ скелета (2D/3D). Упростите анализ, используя инструмент MiNA для вычисления девяти описательных параметров в скелетированном изображении (см. дополнительный рисунок S3).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе описана подробная пошаговая процедура митохондриального морфологического анализа с помощью трех взаимозависимых модулей оптимизации: стандартизация протоколов подготовки образцов, систематическая оптимизация оптических параметров для конфокальной микроскопии и рекомендации по вычислительной обработке изображений. Оптимальный протокол пробоподготовки имеет решающее значение для получения надежных данных митохондриальной визуализации. Систематическая оценка концентраций MitoTracker Red CMXRos показала конц...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящем исследовании представлена систематическая методология анализа морфологии митохондрий в живых клетках в условиях стресса. Важнейшие процедурные этапы митохондриальной визуализации включают: соответствующую концентрацию зондов MitoTracker, тщательное мытье конфокальных посудин перед получением изображения, минимизацию нарушений клеточного состояния и установку подходящих параметров визуализации.

Использование более высоких концентраций MitoTracker мо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81974501).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1-метил-4-фенилпиридиния йодид (MPP+)МаклинM875357Используется для индукции окислительного стресса
Конфокальная тарелкаГНЕЗДО801001Используется для культивирования клеток
Конфокальный микроскопКомпания NikonС2Используется для захвата изображений
Модифицированная смесь питательных веществ Eagle от Dulbecco F-12ThermoFisher Scientific11320033Используется для обеспечения питания клеток
Диметилсульфоксид (ДМСО)БейотимСТ038Используется для растворения зонда mitotracker
Фетальная бычья сыворотка (FBS)ThermoFisher ScientificA3161001CИспользуется для обеспечения питания клеток
ИзображениеJНациональные институты здравоохраненияИзображениеJИспользуется для анализа морфологии митохондрий
MitoTracker Red CMXRosThermoFisher ScientificМ7512Используется для визуализации митохондрий
Фосфатный буферный раствор (PBS)ThermoFisher ScientificC10010500BTИспользуется для мытья клеток на конфокальной посуде
Ячейка SH-SY5YАТКСЦРЛ-2266Используется для демонстрации рабочего процесса анализа морфологии митохондрий
Каскадный адаптер TI-SH-UКомпания NikonMEC59110Используется для защиты образцов

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. von der Malsburg, A., et al. Structural mechanism of mitochondrial membrane remodelling by human OPA1. Nature. 620 (7976), 1101-1108 (2023).
  2. Giacomello, M., Pyakurel, A., Glytsou, C., Scorrano, L. The cell biology of mitochondrial membrane dynamics. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (4), 204-224 (2020).
  3. Kalia, R., et al. Structural basis of mitochondrial receptor binding and constriction by DRP1. Nature. 558 (7710), 401-405 (2018).
  4. Cao, Y. L., et al. MFN1 structures reveal nucleotide-triggered dimerization critical for mitochondrial fusion. Nature. 542 (7641), 372-376 (2017).
  5. Chan, D. C. Mitochondrial dynamics and its involvement in disease. Annu Rev Pathol. 15, 235-259 (2020).
  6. Solaini, G., Sgarbi, G., Lenaz, G., Baracca, A. Evaluating mitochondrial membrane potential in cells. Biosci Rep. 27 (1-3), 11-21 (2007).
  7. Gan, Z., Audi, S. H., Bongard, R. D., Gauthier, K. M., Merker, M. P. Quantifying mitochondrial and plasma membrane potentials in intact pulmonary arterial endothelial cells based on extracellular disposition of rhodamine dyes. Am J Physiol-Lung Cell Mol Physiol. 300 (5), L762-L772 (2011).
  8. Zhong, J., et al. Roflupram exerts neuroprotection via activation of CREB/PGC-1α signalling in experimental models of Parkinson's disease. Br J Pharmacol. 177 (10), 2333-2350 (2020).
  9. Xu, B. T., et al. Mitofusin-2 mediates cannabidiol-induced neuroprotection against cerebral ischemia in rats. Acta Pharmacol Sin. 44 (3), 499-512 (2023).
  10. Hu, T., et al. PRDM16 exerts critical role in myocardial metabolism and energetics in type 2 diabetes induced cardiomyopathy. Metabolism. 146, 155658(2023).
  11. Reichardt, C., et al. DNA-binding protein-A promotes kidney ischemia/reperfusion injury and participates in mitochondrial function. Kidney Int. 106 (2), 241-257 (2024).
  12. Ahmad, T., et al. Computational classification of mitochondrial shapes reflects stress and redox state. Cell Death Dis. 4 (1), e461(2013).
  13. Valente, A. J., Maddalena, L. A., Robb, E. L., Moradi, F., Stuart, J. A. A simple imagej macro tool for analyzing mitochondrial network morphology in mammalian cell culture. Acta Histochem. 119 (3), 315-326 (2017).
  14. Hemel, I., Engelen, B., Luber, N., Gerards, M. A hitchhiker's guide to mitochondrial quantification. Mitochondrion. 59, 216-224 (2021).
  15. Vowinckel, J., Hartl, J., Butler, R., Ralser, M. Mitoloc: A method for the simultaneous quantification of mitochondrial network morphology and membrane potential in single cells. Mitochondrion. 24, 77-86 (2015).
  16. Dagda, R. K., et al. Loss of PINK1 function promotes mitophagy through effects on oxidative stress and mitochondrial fission. J Biol Chem. 284 (20), 13843-13855 (2009).
  17. Przedborski, S., Tieu, K., Perier, C., Vila, M. MPTP as a mitochondrial neurotoxic model of Parkinson's disease. J Bioenerg Biomembr. 36 (4), 375-379 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

MitoTrackerSH SY5YMPP

Похожие статьи