Методическая статья

Определение морфологии митохондрий в живых клетках с помощью конфокальной микроскопии

DOI:

10.3791/68167

⸱

3 июля 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1NMPA Key Laboratory for Research and Evaluation of Drug Metabolism & Guangdong Provincial Key Laboratory of New Drug Screening, School of Pharmaceutical Sciences, Southern Medical University, 2Central Laboratory, Southern Medical University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании мы описываем пошаговый протокол и выделяем ключевые детали для определения морфологических характеристик митохондрий в живых клетках, включая подготовку образцов, получение изображений и анализ данных. Этот метод обычно используется для изучения морфологии митохондрий для изучения различных состояний.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Динамический баланс митохондриального слияния и деления напрямую способствует митохондриальному гомеостазу, который влияет на многочисленные клеточные функции в дополнение к гомеостазу аденозинтрифосфата (АТФ). Таким образом, оценка морфологии митохондрий в условиях стресса имеет важное значение для механистических исследований. В этом исследовании описан подробный протокол анализа морфологии митохондрий, включающий приготовление раствора MitoTracker, окрашивание митохондрий, оптимизацию параметров визуализации и обнаружение морфологических особенностей. MitoTrackers — это широко используемые, экономически эффективные митохондриальные красители. Тем не менее, некоторые изменения в морфологии митохондрий могут произойти из-за неправильного обращения, которое может быть незаметным и не отражать истинное состояние митохондрий. Поэтому необходимо понимать, как анализировать изменения морфологии митохондрий с помощью MitoTrackers. В протоколе использовались клетки SH-SY5Y, стимулированные 1-метил-4-фенилпиридиния йодидом (MPP+) для иллюстрации протокола морфологического анализа митохондрий. По сравнению с контрольными клетками, MPP+-стимулированные клетки демонстрировали меньшие размеры и более фрагментированные митохондрии, с морфологическими параметрами, указывающими на уменьшение митохондриального следа. Эти результаты свидетельствуют о том, что окрашивание MitoTracker является эффективным и осуществимым методом морфологического анализа митохондрий, который (с незначительными модификациями) может быть применен для изучения различных состояний.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Морфология митохондрий поддерживается динамическим балансом слияния и деления митохондрий и, следовательно, влияет на энергетический гомеостаз и многие другие клеточные функции, что приводит к различным патологиям, таким как нейродегенеративные заболевания, рак и воспаление 1,2,3,4,5 . Для наблюдения за морфологией митохондрий было разработано несколько митохондриально-селективных окрашивателей, включая зонды и антитела, для использования с конфокальным микроскопом. Некотор....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка

  1. Растворите MPP+ с диметилсульфоксидом (ДМСО) до получения 1 мМ исходного раствора и храните его при температуре -30 °C в темноте (см. Таблицу материалов).
  2. Растворите 50 г MitoTracker (MitoTracker Red CMXRos) в 94 μл ДМСО, чтобы получить 1 мМ исходный раствор. Разложите исходный раствор по нескольким микроцентрифужным пробиркам и храните в защищенном от света месте при температуре -30 °С до дальнейшего использования.
  3. Инкубируйте клетки SH-SY5Y в колбах с модифицированной средой F-12 Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 от Dulbecco с добавл....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе описана подробная пошаговая процедура митохондриального морфологического анализа с помощью трех взаимозависимых модулей оптимизации: стандартизация протоколов подготовки образцов, систематическая оптимизация оптических параметров для конфокальной микроскопии и рекомендации по вычислительной обработке изображений. Оптимальный протокол пробоподготовки имеет решающее значение для получения надежных данных митохондриальной визуализации. Систематическая оценка концентраций MitoTracker Red CMXRos показала конц.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящем исследовании представлена систематическая методология анализа морфологии митохондрий в живых клетках в условиях стресса. Важнейшие процедурные этапы митохондриальной визуализации включают: соответствующую концентрацию зондов MitoTracker, тщательное мытье конфокальных посудин перед получением изображения, минимизацию нарушений клеточного состояния и установку подходящих параметров визуализации.

Использование более высоких концентраций MitoTracker мо.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81974501).

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1-метил-4-фенилпиридиния йодид (MPP+)МаклинM875357Используется для индукции окислительного стресса
Конфокальная тарелкаГНЕЗДО801001Используется для культивирования клеток
Конфокальный микроскопКомпания NikonС2Используется для захвата изображений
Модифицированная смесь питательных веществ Eagle от Dulbecco F-12ThermoFisher Scientific11320033Используется для обеспечения питания клеток
Диметилсульфоксид (ДМСО)БейотимСТ038Используется для растворения зонда mitotracker
Фетальная бычья сыворотка (FBS)ThermoFisher ScientificA3161001CИспользуется для обеспечения питания клеток
ИзображениеJНациональные институты здравоохраненияИзображениеJИспользуется для анализа морфологии митохондрий
MitoTracker Red CMXRosThermoFisher ScientificМ7512Используется для визуализации митохондрий
Фосфатный буферный раствор (PBS)ThermoFisher ScientificC10010500BTИспользуется для мытья клеток на конфокальной посуде
Ячейка SH-SY5YАТКСЦРЛ-2266Используется для демонстрации рабочего процесса анализа морфологии митохондрий
Каскадный адаптер TI-SH-UКомпания NikonMEC59110Используется для защиты образцов

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. von der Malsburg, A., et al. Structural mechanism of mitochondrial membrane remodelling by human OPA1. Nature. 620 (7976), 1101-1108 (2023).
  2. Giacomello, M., Pyakurel, A., Glytsou, C., Scorrano, L. The cell biology of mitochondrial membrane dynamics. Nat Rev Mol Cell Biol

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

MitoTrackerSH SY5YMPP

Похожие статьи