Методическая статья

Митохондриальный препарат из микроглии для анализа гликанов

DOI:

10.3791/68179

⸱

30 мая 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Health Professions, University of Alabama at Birmingham, 2Department of Chemistry, North Carolina State University, 3Department of Pathology, Division of Molecular and Cellular Pathology, University of Alabama at Birmingham, 4Department of Biomedical Engineering, University of Alabama at Birmingham

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Разработан протокол подготовки очищенных митохондрий из клеток микроглии, выделения митохондриальных белков для высвобождения N-гликанов и быстрого детектирования субклеточных митохондриальных гликанов с помощью лазерной десорбционной ионизации с помощью инфракрасной матрицы в сочетании с точной масс-спектрометрией масс-анализатора высокого разрешения.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Понимание закономерностей гликозилирования митохондриальных белков в микроглии имеет решающее значение для определения их роли в нейродегенеративных заболеваниях. В данной работе мы представляем новую и высокопроизводительную методологию гликомического анализа митохондриальных белков, выделенных из культивируемой микроглии. Этот метод включает в себя выделение митохондрий из культур микроглии, оценку качества образцов митохондрий с последующей оптимизированной экстракцией белка для максимального обнаружения гликана и масс-спектрометрию высокого разрешения (HRAM) с помощью лазерной десорбции электроспрея с помощью инфракрасной матрицы (IR-MALDESI) для получения подробных профилей митохондриального гликозилирования.

Этот протокол подчеркивает важность поддержания целостности митохондрий во время выделения и использует строгий контроль качества для обеспечения воспроизводимости, включая измерение чистоты митохондрий после экстракции. Этот подход позволяет всесторонне профилировать изменения гликозилирования в микроглиальных митохондриях в различных экспериментальных условиях in vitro, что дает представление о митохондриальных изменениях, связанных с нейродегенеративными заболеваниями. Этот подход может быть адаптирован к другим методам лечения in vitro , другим типам культивируемых клеток или первичным клеткам. С помощью этого стандартизированного подхода мы стремимся улучшить понимание микроглиальных митохондриальных гликанов, внося свой вклад в более широкую область нейродегенеративных исследований.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микроглия является доминирующей резидентной клеткой врожденного иммунитета в головном мозге и составляет 10-15%клеток мозга взрослого человека1,2. Они используют свой рецепторный репертуар для динамического мониторинга микроокружения мозга и регуляции нормальной функции мозга для поддержания гомеостазамозга. Микроглия очень чувствительна к изменениям в микроокружении и претерпевает изменения морфологии клеток, иммунофенотипа и функции при патологических состояниях или различных стимуляциях. На состояния активации микроглии влияют потребности клеток в энергии, необходимые для их функционирования, такие как фагоцитоз, выработка цитокинов или восстановление тканей. Таким образом, клеточный энергетический метаболизм играет решающую роль в регулировании изменений функции микроглии4. Нарушение регуляции микроглии приводит к чрезмерному высвобождению провоспалительных цитокинов (например, IL-1β, TNF-α) и активных форм кислорода (АФК), предрасполагая мозг к нейровоспалению 5,6. Хроническая дисрегуляция микроглии и возникающая в результате нейровоспалительная среда закладывают основу для нейродегенерации7.

На мозг приходится всего 2% массы тела, но 20% от общего потребления энергии организмом. Митохондрии являются основным источником энергии в клетках мозга и выступают в качестве ключевых игроков в патогенезе как острых, так и хронических заболеваний мозга8. Предыдущие исследования установили сильную корреляцию между активацией микроглии и метаболической дисфункцией в возрасте9 лет и возрастными расстройствами, такими как болезнь Альцгеймера10,11, подчеркивая ключевую роль митохондрий в клеточном старении и нейродегенерации. Нарушение функции митохондрий приводит к снижению выработки энергии, повышенному окислительному стрессу и усилению нейровоспаления при старении и возрастных заболеваниях.

В то время как обширные исследования прояснили роль митохондрий в энергетическом обмене, старении и расстройствах мозга, роль общих посттрансляционных модификаций, таких как гликозилирование, в биологии и функции митохондрий остается недостаточно изученной. Гликозилирование, ферментативное добавление сахарных фрагментов, называемых гликанами, к белкам с помощью ферментов гликозилирования, является наиболее распространенной посттрансляционной модификацией в большинстве клеток мозга, включая микроглию. Активированные микроглии модулируют свою иммунную функцию под действием воспалительных стимулов, регулируя внутриклеточную или поверхностную экспрессию гликанов12. Про- и противовоспалительные реакции, проявляемые микроглией после стимуляции, также регулируются гликанами13. Митохондриальные белки также имеют эти модификации гликанов, которые регулируют их функцию и локализацию. Тем не менее, детальный анализ специфичных для клеток паттернов митохондриального гликозилирования в микроглии отсутствует из-за технических сложностей в исследовании субклеточного гликозилирования. Несмотря на хорошо описанную роль гликозилирования в модуляции фенотипа микроглии, роль гликанов в модуляции митохондриальной функции и, следовательно, клеточного иммунофенотипа в микроглии остается плохо изученной.

Ограниченные исследования, изучающие гликозилирование митохондриальных белков, были сосредоточены в основном на идентификации паттернов гликозилирования на основе лектина. Лектины представляют собой гликан-связывающие белки, связывающие биомолекулярные гликановые фрагменты14,15, которым не хватает специфичности и способности предоставлять подробную информацию о составе гликанов. Масс-спектрометрические методы обеспечивают детальную идентификацию составов гликанов для решения аналитических проблем, возникающих при лектиновом анализе. Один из таких методов, инфракрасная матричная лазерная десорбционная электрораспыляемая ионизация (IR-MALDESI), использует гибридную стратегию ионизации, используя лазер среднего инфракрасного диапазона для резонансного возбуждения воды, обнаруженной в биологических образцах16, для десорбции нейтральных веществ и воздействия на них ортогонального шлейфа электрораспыления с последующим анализом с использованием точного масс-спектрометра Orbitrap с высоким разрешением. Ранее было продемонстрировано применение IR-MALDESI для прямого анализа тканевых метаболитов17 с явными преимуществами экспресс-анализа18, метода мягкой ионизации и предсказуемости содержания сиаловых кислот в N-связанных гликанах на основе изотопных схем распределения хлорированных гликанов19. Тем не менее, адаптация этой платформы для прямого анализа субклеточных гликанов не была продемонстрирована.

В данной работе мы сообщаем о высокопроизводительном протоколе для выделения митохондрий из клеток микроглии, выделения митохондриальных N-гликанов, а также обнаружения и анализа митохондриальных N-гликанов с помощью масс-спектрометрии IR-MALDESI. Этот протокол будет иметь основополагающее значение для раскрытия новых идей о роли гликозилирования в функции митохондрий, потенциально выявляя новые терапевтические мишени для нейровоспалительных и нейродегенеративных заболеваний.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Культура микроглиальной клеточной линии BV2

  1. Поддерживайте клетки BV-2 (микроглиальные клетки, полученные от мышей C57BL/6) в среде DMEM с низким содержанием глюкозы с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS), 1% Penicillium-Streptomycin (PenStrep) и 1% заменимых аминокислот (NEAA).
  2. Выращивайте клетки в колбах Т-175 и дайте им достичь 70-80% конфлюенции.
  3. Расщепляют клетки путем инкубации с ферментами диссоциации клеток в течение 5 мин при 37 °C в 5%CO2 с последующей инактивацией ферментов с равным объемом клеточной среды и центрифугированием клеток в течение 5 мин при 500 × г при комнатной температуре (RT).
    Используемые здесь ферменты диссоциации клеток более щадящие по отношению к клеткам BV2, чем трипсин, и могут использоваться для защиты экспрессии антигена на клеточной поверхности.
  4. Отсадите среду, ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 мл питательной среды и подсчитайте клетки с помощью трипанового синего (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом шаге для подсчета ячеек мы использовали автоматический счетчик ячеек.
  5. Чтобы провести митохондриальную изоляцию, действуйте, если клеточная гранула содержит 2 × 107 (20 миллионов клеток/гранулу).

2. Выделение митохондрий из клеток микроглии

ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте быстро, держа все на льду на протяжении всей процедуры. Набор для митохондриальной изоляции, используемый для митохондриальной изоляции, состоит из трех компонентов: реагенты А (буфер для лизиса клеток), реагент В (стабилизирующий буфер) и реагент С (митохондриальный буфер для промывки). Добавляйте ингибиторы протеазы в реагент А и реагент С непосредственно перед применением.

  1. Пеллеты 2 × 107 клеток путем центрифугирования собранных клеток в микроцентрифужной пробирке объемом 2,0 мл при давлении 500 × г в течение 5 мин. Осторожно аспирируйте и выбросьте надосадочную жидкость.
  2. Добавьте 800 мкл реагента для выделения митохондрий А (буфер для лизиса клеток), переведите вихрь на средней скорости в течение 5 с и инкубируйте пробирку на льду ровно 2 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте 2-минутную инкубацию.
  3. Добавьте 10 мкл реагента митохондриальной изоляции В (стабилизирующего буфера), сделайте вихрь на максимальной скорости в течение 5 с и инкубируйте пробирку на льду в течение 5 минут, совершая вихревые операции с максимальной скоростью каждую минуту.
  4. Добавьте 800 мкл реагента для выделения митохондрий C (митохондриальный буфер для промывки), переверните пробирку несколько раз для перемешивания и центрифугируйте пробирку при 700 × г в течение 10 мин при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не делайте вихрей.
  5. Перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку объемом 2,0 мл и вращайте при 3 000 × г в течение 15 минут при 4 °C.
  6. Перенесите надосадочную жидкость (цитозольные порции) в новую пробирку. Гранула содержит изолированные митохондрии.
  7. Добавьте в гранулу 500 μл реагента для выделения митохондрий C и центрифугируйте при 12 000 × г в течение 5 минут.
  8. Используйте гранулу для количественного определения и обработки белка или храните гранулу при температуре -80 °C до дальнейшего использования.

3. Оценка белка с помощью анализа microBCA

ПРИМЕЧАНИЕ: Оценка белка для этого протокола может быть выполнена с использованием различных реагентов и анализов. Количественное определение цитозольных или митохондриальных белков может быть выполнено путем нормализации по отношению к общей концентрации белка, используемой в анализе.

  1. Приготовьте стандарты бычьего сывороточного альбумина (БСА) в диапазоне от 0 мкг/мл до 200 мкг/мл (0 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 1 г/мл, 2,5 мкг/мл, 5 мкг/мл, 10 мкг/мл, 20 мкг/мл, 40 мкг/мл, 200 мкг/мл) и заготовки только с буфером для лизиса.
  2. Добавьте по 150 мкл каждого стандарта в 96-луночный планшет с плоским дном, содержащий образцы.
  3. Смешайте 25 частей реагента Micro BCA MA (раствор бицинхониновой кислоты (BCA)) и 24 части реагента MB (раствор сульфата меди) с 1 частью реагента MC (стабилизирующий буфер) (25:24:1, реагенты MA:MB:MC) для создания рабочего реагента. Добавьте 150 мкл смешанного реагента BCA к каждому образцу и стандарту.
  4. Выдерживать при 37 °C в течение 2 ч.
  5. Используйте планшетный ридер для измерения абсорбции при 562 нм и количественного определения концентрации белка с помощью стандартной кривой. Вычтите полную стандартную абсорбцию из измерения абсорбции всех других отдельных стандартов, и неизвестный образец будет реплицирован для получения концентраций белка в образце.

4. Контроль качества митохондриального препарата (вестерн-блоттинг)

  1. Ресуспендируйте митохондриальную гранулу в буфере радиоиммунопреципитационного анализа (RIPA) для количественного определения белка. Определите концентрацию белка для каждого образца с помощью микроанализа BCA.
  2. Денатурируйте образцы в буфере для проб при 94 °C в течение 5 минут.
  3. Загрузите равное количество (20 мкг) митохондриального белка в сборные гели (см. Таблицу материалов) вместе с маркером молекулярной массы.
  4. Влейте гель в течение 50 минут при 100 В.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время работы может варьироваться, поэтому обязательно остановите гель, когда белки достигнут конца геля, указанного красителем в буфере для образца.
  5. Перенесите белки из геля на мембрану из поливинилиденфторида (PVDF) с использованием протокола сухого переноса в системе переноса вестерн-блоттинга в течение 7 мин при 20 В.
  6. Выньте мембрану и заблокируйте с помощью блокирующего раствора (Таблица 1) на 1 час при комнатной температуре.
  7. Добавьте соответствующие разведения первичного антитела к мембране в блокирующий буфер на ночь при 4 °C (COXIV = 1:3,000, GAPDH = 1:3,000).
    Примечание: Отсутствие ядерного загрязнения эндоплазматического ретикулума (ER) в митохондриальном препарате можно проверить, используя дополнительные маркеры, такие как lamin (ядерный маркер) и ERp57 (маркер ER) в западных блоттингах.
  8. Промойте мембрану в течение 3 x 15 минут с помощью буфера для промывки (Таблица 1).
  9. Инкубировать мембрану с соответствующим разведением HRP-конъюгированного вторичного антитела в блокирующем буфере при комнатной температуре в течение 1 ч
  10. Промойте мембрану в течение 3 х 15 минут с помощью буфера для промывки.
  11. Для проявки используйте набор хемилюминесцентных подложек.
  12. Отсканируйте мембрану с помощью геля и мембранного тепловизора.

5. Выделение митохондриального белка для экстракции N-гликана из микроглии

  1. Ресуспендируйте выделенные митохондрии в 50 мкл буфера для изоляции белка (табл. 1) и оставьте на льду на 20 минут.
  2. Отсадить и дозировать три раза и оставить на 20 минут на льду (вихре перед использованием). Если митохондриальная гранула не полностью растворена, добавьте еще 50 μL изоляционного буфера и объедините в ту же пробирку.
  3. Центрифугируйте при 13 000 × г в течение 10 мин.
  4. Восстановите надосадочную жидкость, заморозьте при -80 °C в течение минимум 1 часа и высушите как можно больше в вакуумном концентраторе.
  5. Ресуспендию перед выделением гликана с использованием буфера для расщепления PNGазы (Таблица 1) для IR-MALDESI.

6. Митохондриальный N-гликановый препарат для IR-MALDESI

  1. Загрузите 25-250 мкг белка (в максимальном объеме 250 мкл) выделенных митохондриальных белков в фильтр с молекулярной массой 10 кДа (MWCO).
  2. Уменьшите количество образцов белка, чтобы обнажить гликановые фрагменты, добавив 2 мкл 1 М дитиотреитола (DTT) в каждый образец фильтра.
  3. Разбавьте образец 200 μL буфера для расщепления PNGазы и слегка перемешайте, чтобы не нарушить работу фильтра.
  4. Денатурируйте митохондриальные белки путем инкубации образца при 56 °C в течение 30 минут.
  5. Используйте 50 мкл 1 М йодоацетамида для алкилирования митохондрий до конечной концентрации ~200 мМ и инкубируйте при 37 °C в течение 60 минут.
  6. Для дальнейшей концентрации денатурированных митохондриальных методов центрифугируйте образцы при 14 000 × г в течение 40 минут. Откажитесь от проточной части.
  7. Промойте образец 100 μL буфера для расщепления PNGase.
  8. Сконцентрируйте гликопротеин на фильтре при концентрации 14 000 × г в течение 20 минут и выбросьте проточный. Повторите шаг промывки и концентрации 2 раза, в общей сложности 3 раза, в результате чего концентрат попадет в мертвый объем фильтра (~5 μл). Отбрасывайте все проточные.
  9. Выбросьте флакон для сбора после завершения стирки. Используйте флакон нового сбора для всех будущих элюентов и смывок.
  10. Чтобы отделить гликаны от денатурированных митохондриальных гликоструктур, переложите в свежий флакон для сбора и добавьте в фильтр 2 мкл PNGазы без глицерина (75 000 единиц/мл). Добавьте 98 μL буфера для расщепления PNGase, доведя общий объем до 100 μЛ, и перемешайте, аккуратно пипетируя вверх и вниз на фильтре.
  11. Инкубируйте образцы при 37 °C в течение 18 ч для ферментативного расщепления всех N-гликанов из митохондриальных белков.
  12. Элюируйте высвобождающиеся митохондриальные N-гликаны путем центрифугирования образца при 14 000 × г в течение 20 мин при 20 °C.
  13. Промойте митохондриальные гликаны, добавив 100 мкл буфера для расщепления PNGазы в фильтр и центрифугируйте при 14 000 × г в течение 20 мин при 20 °C. Соберите раствор, содержащий оставшиеся N-гликаны, в тот же флакон для сбора, что и элюент. Повторите 2 раза и снимите фильтр с флакона для сбора.
  14. Образцы митохондриального гликана инкубировать в морозильной камере при температуре -80 °C до замерзания (30-60 минут) и высушить до полной сушки при комнатной температуре в вакуумном концентраторе (4-6 часов для 400 μл).
    ПРИМЕЧАНИЕ: N-гликаны могут храниться при температуре -20 °C до 6 месяцев до анализа.
  15. Ресуспендируйте высушенные N-связанные гликаны в 50 мкл воды класса LC/MS непосредственно перед анализом IR-MALDESI.

7. Детектирование высвобождаемых гликанов с помощью масс-спектрометрии IR-MALDESI

  1. Выполняйте калибровку гири каждый день эксперимента. Загрузите калибровочный раствор в шприцевой насос и протолкните его со скоростью 1,2 мкл/мин. Подайте напряжение 3,5 кВ для достижения стабильного шлейфа электрораспыления для калибровки массы как в положительном, так и в отрицательном режимах.
  2. Пипеткой 5 мкл ресуспендированных митохондриальных гликанов в место отбора образца на тефлоновом микролуночном стекле.
  3. Используйте лазер среднего ИК-диапазона, работающий на длине волны 2,97 мкм для абляции с энергией 1,8 мДж на пакет.
  4. Ионизируйте и детектируйте N-гликаны в режиме отрицательной ионизации. Используйте растворитель электрораспыления, состоящий из 60% ацетонитрила и 1 мМ уксусной кислоты, для создания стабильного шлейфа электроспрея с расходом 2 μл/мин при напряжении 3,2 кВ.
  5. Для выполнения анализа подключите IR-MALDESI к масс-спектрометру HRAM, настроенному на разрешающую способность по массе 240 000FWHM при m/z 200, анализируя от 500 до 2000 м/з в режиме отрицательной ионизации.
  6. Отключите автоматическую регулировку усиления (АРУ) и установите фиксированное время инжекции 90 мс. Используйте источник EasyIC для внутренней калибровки каждого спектра в режиме реального времени для достижения высокой точности измерения массы (MMA).

8. Анализ данных митохондриального N-гликана

  1. Ручная идентификация N-связанных гликанов путем поиска моноизотопных масс и подтверждения изотопных распределений с использованием интервала m/z для определения дважды и трижды заряженных ионов с минимальным порогом потока ионов 1000 ионов/с.
  2. Преобразуйте необработанные масс-спектры из соотношений m/z в массы нейтральных моноизотопов.
  3. Загрузите моноизотопные массы в онлайн-инструмент прогнозирования структуры олигосахаридов, чтобы определить потенциальные составы гликанов. Подтверждение аннотаций с использованием экспериментально подобранной гликомной базы данных20; Убедитесь, что каждая идентификация находится в пределах 2,5 ppm MMA, содержит основную N-связанную гликановую структуру (Hex3HexNAc2) и исключает пентозу, KDN или моносахариды HexA.
  4. Нарисуйте подтвержденные гликановые структуры с использованием номенклатуры SNFG21.
  5. Получить относительное содержание гликанов из исходных масс-спектров и нормализовать по количеству митохондриального белка в мкг для получения ионов/с/мкг.
  6. Используйте анализ хи-квадрат для проверки соответствия между теоретическим и экспериментальным распределениями N-связанных гликанов для определения количества аддуктов хлора. Это позволяет напрямую определить количество сиаловых кислот19.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На рисунке 1 представлена схематическая схема этапов выделения митохондрий из линии микроглиальных клеток BV2 для масс-спектрометрического анализа гликанов. Воспроизводимость выделения митохондриальных белков между различными митохондриальными препаратами из одинаковой начальной плотности клеток микроглии представлена на рисунке 2, где не показано существенной разницы между концентрацией митохондриального белка, оцененной с помощью анализа микро БЦА.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микроглия является резидентными иммунными клетками головного мозга, а модификации гликана модулируют иммунофенотип и функцию микроглии. Эти иммунные функции требуют значительного количества клеточной энергии, которая в основном поставляется митохондриями. Примечательно, что митохондриальные белки также представляют модификации гликанов, которые остаются в значительной степени малоизученными из-за технологических сложностей в исследовании субклеточного гликозилирования. Большинство исслед...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить Сета Айзенберга, аспиранта лаборатории Маддимана в NCSU, за его помощь в видеозаписи масс-спектрометрического протокола. Это исследование было частично поддержано Программой стипендиатов Школы инженерных инноваций при Университете Алабамы в Бирмингеме, AG068309 до D.J.T. и R01GM087964-12 до D.C.M. Схемы в этой рукописи были нарисованы с помощью BioRender.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Equipment
Amersham 600 ImagerCytvia 29194217Гелевый и мембранный имиджер
Countess 3 автоматизированный счетчик ячеекFisher ScientificX003SZ1LY9
Сухая ванна Stdrd 4 blck 100-120VThermofisher scientific 
i-Blot2 Устройство для переноса геляInvitrogenIB21001Система переноса вестерн-блота
Инвертированный микроскопCell Treat04355223EA
Считыватель82050-760
Мини гелевый бакInvitrogenA25977
Open Air RockerFisher Brand88861025
Пипетка для мальчика BioTek229310
Вихревой смесительIntegra- VWR
strong>Реагенты для выделения митохондрий 
Набор для выделения митохондрийThermofisher scientific 89874
Ингибитор фосфотазыThermofisher научный 
Ингибитор протеазыThermofisher scientific Выделение 1861281
N-гликана и реагенты IR-MALDESI
уксусная кислота Fisher ScientificA1135050% в растворителе ESI
ацетонитрил Sigma Aldrich34851-4L1 мМ в растворителе ESI
бикарбонате аммония Fisher ScientificA643500калибровочный раствор 100 мМ
Thermofisher ScientificA39239Pierce FlexMix
Dithiothreitol Sigma AldrichAC4263801001 м
йодоацетамидSigma AldrichA322-10VL
LC/MS класс водыThermofisher Scientific047146.M6
PNGase FBulldog BioNZPP01075000 Ед/мл, фермент для высвобождения N-гликанов 
Изоляция N-гликана и расходные материалы IR-MALDESI
Amicon центробежные фильтрыFisher Scientific UFC501024MWCO 10 кДа
Orbitrap Exploris 240
Mid-IR LaserJGM Associates, Берлингтон, Массачусетс, США
тефлоновый микролуночный слайдProsolia, Индианаполис, Индианаполис, Индианаполис, США
Программное обеспечение для анализа N-гликанов
GlycoMod Expasy https://web.expasy.org/glycomod/
GlyConnectExpasy https://glyconnect.expasy.org/
Выделение белка и расходные материалы для вестерн-блота  Насадки для геля
Basix ( 10 & микро; L) Basix13-611-102
Насадки для геля Basix ( 200 & микро; L) Basix13-611-116
Скребок клетокVWR labs14-388-100
i-Blot NC обычные стекиInvitrogenIB23001
i-Blot2 PVDF Regular StacksInvitrogenIB24001
10  &микро; L микропипеткаFisher ScientificFBE00010
20 & микро; L микропипеткаInvitrogenFBE00020
200  &микро; L микропипетка Бренд FisherFBE00200
1000 &микро; L микропипеткаFisher маркиFBE01000
10  &микро; L наконечники для пипеток VWR labs76322-528
20  & micro; L наконечники для дозаторовVWR labs76322-134
200  µ L наконечники для пипеток VWR labs76322-150
1000  & micro; L наконечники для дозаторовVWR labs76322-154
Планшет для лунок Фишер марки14-388-100
Белковая изоляция и реагенты вестерн-блот 
Actin антитела ( Хозяин : Кролик )Технологии клеточной сигнализации8457T
Anti-rabbit IgG HRP Linked Технологии клеточной сигнализации7074S
Bolt 4-12% Бис-Трис плюсИнвитрогенNW04120BOX
Сыворотка крупного рогатого скота АльбуминБиореагенты ФишераBP9700-100
Антитела к COXIV ( Хозяин : Кролик )Технологии клеточной сигнализации4844S
Антитела к GAPDH ( Хозяин : Кролик )Технологии клеточной сигнализации2118S
Набор для анализа белка MicroBCAThermofisher scientific 23235
Nupage MOPS SDS Буфер для работы [20x]Thermofisher scientific NP0001
СТРАНИЦА Линейка предварительно окрашенная белковая лестницаThermofisher научный 815-968-0747Разбавление = использование 7  &микро; L для загрузки в первую лунку
фосфатного буферного раствора Aniara DiagnosticsA12-9423-5Приготовить 1x PBS из 10x порошка 
Pierce ECL Western Blotting SubstrateThermofisher scientific 32106Набор хемилюминесцентных субстратов
RIPA BufferThermofisher scientific 89901
Буфер для образцовNovexB0007Буфер для образцов bolt LDS приготовлен в соотношении 3:1 образец к образцу буфер
Tween-20MP BiomedicalsTWEEN201
Расходные материалы для культуры тканей 
Countess SlidesAvantor229411
Eppendorf tubesCell Treat414004-265612-5884
2 мл аспирационной пипеткиVista lab5090-0010E
5 мл серологической пипетки Fisher Scientific13-678-11D
10 мл серологическая пипетка Basix13-678-11E
25 мл серологическая пипеткаVista labFB012937
50 мл серологическая пипеткаVista lab14955233
15 мл коническая пробиркаAvantor229225A
50 мл коническая трубкаCell treat4190-0050
T-75 см2 Колба для культуры тканейFisher Scientific
Т-180 см<суп>2 Колба для культуры тканейFisher ScientificFB012939
Реактивы для культуры тканей 
BV2 линия микроглиальных клеток Креативный биомассив CSC-I2227ZИммортализованная мышиная микроглия (BV2), полученная из неонатальной микроглии C57/BL6 
Ферменты диссоциации клеток Thermofisher научный 12563029TrypLE 
Модифицированная среда Dulbecco's Eagle Medium (DMEM) с низким содержанием глюкозы Gibco10567014
Фетальная бычья сывороткаЦитиваSH30071,03HI
Минимальная незаменимая среда (MEM) Заменимые аминокислотыGibco11140050
Penicillium StreptomycinCytiviaSV30010
Фосфатный буфер физиологического раствораCorning21-040-CV
Трипановый синий краситель 0,4%InvitrogenТ10282
88870003 микропланшетов <1861274 Масс-спектрометр FB012937

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dos Santos, S. E., et al. Similar microglial cell densities across brain structures and mammalian species: Implications for brain tissue function. J Neurosci. 40 (24), 4622-4643 (2020).
  2. Shao, F., Wang, X., Wu, H., Wu, Q., Zhang, J. Microglia and neuroinflammation: Crucial pathological mechanisms in traumatic brain injury-induced neurodegeneration. Front Aging Neurosci. 14, 825086(2022).
  3. Arcuri, C., Mecca, C., Bianchi, R., Giambanco, I., Donato, R. The pathophysiological role of microglia in dynamic surveillance, phagocytosis and structural remodeling of the developing cns. Front Mol Neurosci. 10, 191(2017).
  4. Cheng, J., et al. Early glycolytic reprogramming controls microglial inflammatory activation. J Neuroinflammation. 18 (1), 129(2021).
  5. Cătălin, B., Cupido, A., Iancău, M., Albu, C. V., Kirchhoff, F. Microglia: First responders in the central nervous system. Rom J Morphol Embryol. 54 (3), 467-472 (2013).
  6. Cai, Y., Liu, J., Wang, B., Sun, M., Yang, H. Microglia in the neuroinflammatory pathogenesis of alzheimer's disease and related therapeutic targets. Front Immunol. 13, 856376(2022).
  7. Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., El Khoury, J. Microglia in neurodegeneration. Nat Neurosci. 21 (10), 1359-1369 (2018).
  8. Norat, P., et al. Mitochondrial dysfunction in neurological disorders: Exploring mitochondrial transplantation. NPJ Regen Med. 5 (1), 22(2020).
  9. Picca, A., et al. Age-associated glia remodeling and mitochondrial dysfunction in neurodegeneration: Antioxidant supplementation as a possible intervention. Nutrients. 14 (12), 2406(2022).
  10. Mcavoy, K., Kawamata, H. Glial mitochondrial function and dysfunction in health and neurodegeneration. Mol Cell Neurosci. 101, 103417(2019).
  11. Fairley, L. H., Wong, J. H., Barron, A. M. Mitochondrial regulation of microglial immunometabolism in alzheimer's disease. Front Immunol. 12, 624538(2021).
  12. Starossom, S. C., et al. Galectin-1 deactivates classically activated microglia and protects from inflammation-induced neurodegeneration. Immunity. 37 (2), 249-263 (2012).
  13. Puigdellívol, M., Allendorf, D. H., Brown, G. C. Sialylation and galectin-3 in microglia-mediated neuroinflammation and neurodegeneration. Front Cell Neurosci. 14, 162(2020).
  14. Gerlach, J. Q., Kilcoyne, M., Eaton, S., Bhavanandan, V., Joshi, L. Non-carbohydrate-mediated interaction of lectins with plant proteins. Adv Exp Med Biol. 705, 257-269 (2011).
  15. Cummings, R. D., Pierce, J. M. The challenge and promise of glycomics. Chem Biol. 21 (1), 1-15 (2014).
  16. Robichaud, G., Barry, J. A., Muddiman, D. C. IR-MALDESI mass spectrometry imaging of biological tissue sections using ice as a matrix. J Am Soc Mass Spectrom. 25 (3), 319-328 (2014).
  17. Barry, J. A., Groseclose, M. R., Robichaud, G., Castellino, S., Muddiman, D. C. Assessing drug and metabolite detection in liver tissue by uv-maldi and ir-maldesi mass spectrometry imaging coupled to ft-icr ms. Int J Mass Spectrom. 377, 448-155 (2015).
  18. Pace, C. L., Muddiman, D. C. Direct analysis of native N-linked glycans by IR-MALDESI. J Am Soc Mass Spectrom. 31 (8), 1759-1762 (2020).
  19. Palomino, T. V., Muddiman, D. C. Predicting sialic acid content of N-linked glycans using the isotopic pattern of chlorine. J Am Soc Mass Spectrom. 34 (7), 1392-1399 (2023).
  20. Mariethoz, J., et al. Glycomics@expasy: Bridging the gap. Mol Cell Proteomics. 17 (11), 2164-2176 (2018).
  21. Varki, A., et al. Symbol nomenclature for graphical representations of glycans. Glycobiology. 25 (12), 1323-1324 (2015).
  22. Yu, H., et al. Comparison of the glycopattern alterations of mitochondrial proteins in cerebral cortex between rat alzheimer's disease and the cerebral ischemia model. Sci Rep. 7 (1), 39948(2017).
  23. Dixit, B., Vanhoozer, S., Anti, N. A., O'Connor, M. S., Boominathan, A. Rapid enrichment of mitochondria from mammalian cell cultures using digitonin. MethodsX. 8, 101197(2021).
  24. Kalathil, A. A., et al. New pathway for cisplatin prodrug to utilize metabolic substrate to overcome cancer intrinsic resistance. central science. 9, 1297-1312 (2023).
  25. Hecht, E. S., McCord, J. P., Muddiman, D. C. Definitive screening design optimization of mass spectrometry parameters for sensitive comparison of filter and solid phase extraction purified, inlight plasma N-glycans. Anal Chem. 87 (14), 7305-7312 (2015).
  26. Hecht, E. S., McCord, J. P., Muddiman, D. C. A quantitative glycomics and proteomics combined purification strategy. J Vis Exp. (109), e53735(2016).
  27. Fischler, D. A., Orlando, R. N-linked glycan release efficiency: A quantitative comparison between NaOCl and PNGase F release protocols. J Biomol Tech. 30 (4), 58-63 (2019).
  28. Tu, A., Muddiman, D. C. Internal energy deposition in infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization with and without the use of ice as a matrix. J Am Soc Mass Spectrom. 30 (11), 2380-2391 (2019).
  29. Barry, J. A., et al. Mapping antiretroviral drugs in tissue by IR-MALDESI MSI coupled to the Q exactive and comparison with LC-MS/MS SRM assay. J Am Soc Mass Spectrom. 25 (12), 2038-2047 (2014).
  30. Samal, J., Palomino, T. V., Chen, J., Muddiman, D. C., Segura, T. Enhanced detection of charged N-glycans in the brain by infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization mass spectrometric imaging. Anal Chem. 95 (29), 10913-10920 (2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

NMALDESI

Похожие статьи