Method Article

Мультимодальный анализ микропластика в питьевой воде с использованием трубопровода для анализа силиконовых наномембран

DOI:

10.3791/68200

⸱

June 13th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1SiMPore Inc., 2Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 3URnano, University of Rochester

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье мы представляем протокол, демонстрирующий оптически прозрачную и плоскую подложку для оптимизированного улавливания и анализа загрязняющих частиц в питьевой воде. Здесь представлен конвейер анализа кремниевых наномембран (SNAP): гибкий конвейер для захвата, количественной оценки и идентификации частиц в жидких средах.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Биологическое воздействие загрязнения микропластиком пищевых продуктов и водных источников человека в значительной степени неизвестно, и источники питьевой воды не являются исключением из этого микропластикового загрязнения. В этой статье мы демонстрируем оптимизированный подход к улавливанию, количественной оценке и идентификации микропластика в питьевой воде. Мы представляем аналитический рабочий процесс под названием Silicon Nanomembrane Analysis Pipeline (SNAP), в котором используются преимущества новых наномембран из нитрида кремния, обеспечивающие значительный «коэффициент концентрации», который консолидирует взвешенные частицы в плоскую область наблюдения для индивидуализированного, количественного и мультимодального анализа частиц на одной и той же подложке. Основные преимущества SNAP заключаются в использовании ультратонких мембран на основе нитрида кремния, размещенных в фильтрующих дисках обычного размера, что позволяет напрямую захватывать и анализировать полимерные МР на неполимерном фоне. Пробы питьевой воды, полученные в Рочестере, штат Нью-Йорк, были собраны из бытовых водопроводных источников и проанализированы с помощью SNAP. Частицы в каждом образце были охарактеризованы с помощью оптической и сканирующей электронной микроскопии (СЭМ), рамановской спектроскопии и энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии (ЭДХ), а различные идентифицированные составляющие были количественно определены пропорционально общему количеству захваченных частиц.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микропластик определяется как синтетические полимеры размеромменее пяти миллиметров 1,2. Загрязнение микропластиком (МП) является растущей проблемой для здоровья человека, окружающей среды и экологии. Загрязнение МП обнаружено в водных источниках всех типов; пресная вода, океаны и даже источники питьевой воды3. МП образуются в результате распада первичных пластиковых источников4, а также синтетического текстиля 5,6,7. МП распространены повсеместно и были обнаружены в тканях человека, таких как плацента человека, фекалии и кровь 8,9,10. В 2023 и 2024 годах было опубликовано более 4 100 и 4 600 публикаций соответственно (данные PubMed; ключевое слово «микропластик»), а также растущая обеспокоенность общественности по поводу контакта с членами парламента на человека. В ответ на растущую обеспокоенность общественности несколько государственных регулирующих органов, таких как штат Калифорния11 и несколько стран ЕС12, осуществляли (или будут) нормативные акты по уровням МП в питьевой воде. Учитывая все вышесказанное, Агентство по охране окружающей среды США недавно объявило депутатов новым загрязнителем, вызывающим обеспокоенность. Тем не менее, оценка риска для человека серьезно затруднена из-за отсутствия методов надежного и воспроизводимого выявления МП.

Определение характеристик МП основано на аналитических методах, таких как оптическая и электронная микроскопия13, а также спектроскопические и спектрометрические методы 1,14,15 для понимания визуальных характеристикМП7 и их состава, соответственно. Образцы, содержащие МП, должны быть подвергнуты многократному анализу для характеристики, идентификации и количественного определения МП и, по крайней мере, требуют спектроскопии/спектрометрии (т.е. рамановской спектроскопии, инфракрасной спектроскопии или пиролизной газовой хроматографии-масс-спектрометрии и т.д.) в соответствии с некоторыми журнальными минимальными требованиями к измерению пластмасс в образцах окружающей среды, такими как Science of the Total Environment16. Рамановская спектроскопия более универсальна, чем инфракрасная (ИК) спектроскопия, особенно в отношении идентификации материала в биологических образцах. Рамановская спектроскопия – это метод рассеяния света, позволяющий анализировать более мелкие частицы легче, чем ИК-спектроскопия, метод поглощения света, который требует более крупных частиц и имеет больше ограничений на размещение образцов17. Ранее было высказано предположение, что подложки для рамановской спектроскопии, содержащие кремний или оксид кремния, могут давать надежные результаты с минимальным фоновымшумом18.

Подложки для некоторых аналитических методов, которые обычно совместимы с одним типом анализа (например, подложки с золотым покрытием, необходимые для ИК-спектроскопии), часто не совместимы с микроскопией пропускающего и/или отражательного света. Следовательно, повторная субвыборка популярна среди исследователей для получения проб, подходящих для каждого отдельного анализа, но субвыборка занимает много времени и может исключить частицы с низкой концентрацией 1,2,6. Как правило, ручной перенос частиц с одного субстрата на другой необходим для анализа одной и той же частицы для определения характеристик и идентификации с помощью различных аналитических методов, но этот медленный ручной перенос увеличивает вероятность смещения, загрязнения и потерь, а также ограничивает анализ МП только частицами самого большого размера, с которыми можно манипулировать вручную13. Эти неоптимальные рабочие процессы создают многочисленные проблемы и проблемы с надежностью, способствуя значительной вариативности количественной оценки МП, о которой сообщается в литературе 3,7.

В этой статье мы представляем аналитический рабочий процесс, который мы называем Silicon Nanomembrane Analysis Pipeline (SNAP) для захвата, характеристики, идентификации и количественной оценки MP, а также демонстрируем полезность SNAP путем анализа образцов питьевой воды, полученных из региона Рочестера, штат Нью-Йорк. SNAP обеспечивается фильтрующими дисками обычного размера диаметром 25 мм со встроенными кремниевыми наномембранами (свойства мембраны см. в Дополнительной таблице S1), которые обеспечивают однородную подложку для концентрирования и анализа МП из питьевой воды с использованием нескольких методов15,19. После последовательного концентрирования и захвата МР на наномембранах с уменьшающимися размерами отсечения (20 мкм микропористый нитрид кремния (MPSN) с цилиндрическими порами и 8,0 мкм микрощельный нитрид кремния (MSSN) с прямоугольными призматическими порами), SNAP обеспечивает три последовательных аналитических этапа: 1) окрашивание образца, оптическую микроскопию и количественное определение МП, 2) идентификацию частиц с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния света, за которой следует 3) определение характеристик частиц с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM), Это позволяет проводить многократный анализ одних и тех же частиц, захваченных на одной наномембранной подложке.

Мы демонстрируем несколько конвейеров SNAP с использованием как фильтрующих дисков на основе кремниевой наномембраны (SiN) без покрытия, так и фильтрующих дисков на основе кремниевой наномембраны с золотым покрытием (Au-SiN): Pipeline A) SNAP выполнен на SiN и последовательно характеризует одни и те же MP с помощью нескольких аналитических методов; Трубопровод B) SNAP, выполненный на Au-SiN с помощью рамановской спектроскопии; и трубопровод C) SNAP, выполненный на Au-SiN с помощью SEM, оснащенного энергодисперсионной рентгеновской спектроскопией (EDX) (рис. 1). Таким образом, варианты SNAP представляют собой гибкие, оптимизированные аналитические рабочие процессы, которые можно использовать для различных типов образцов и аналитических методов. В отличие от ранее опубликованныхметодов, основанных на полимерных мембранах, преимущества SNAP обусловлены использованием кремниевых наномембран, в которых синтетические полимерные МП захватываются на неполимерной мембране на основе кремния, что позволяет идентифицировать состав МП на неполимерном фоне. Кроме того, кремниевые наномембраны обеспечивают однородные фокальные плоскости, в отличие от полимерных мембран, которые имеют тенденцию к сморщиванию, что позволяет использовать несколько автоматизированных методов микроскопии и спектроскопии.

Ранее мы охарактеризовали использование кремниевых наномембран для анализа МП с помощью аналитического моделирования, моделирования испытаний частиц и образцов питьевой воды и воздуха19,20, а также путем сравнения их фильтрующих и оптических микроскопических свойств с использованием модельных частиц с четырьмя широко используемыми мембранами15. В этом протоколе мы эвристически демонстрируем полезность SNAP для анализа МП в четырех пробах питьевой воды. Образцы были собраны из четырех различных источников воды в районе Большого Рочестера, штат Нью-Йорк. Каждый образец, включенный в это исследование, был взят из определенного источника поверхностных вод, такого как озеро Онтарио, озеро Хемлок, смесь Хемлока и Онтарио, а также озеро Канандаигуа (Рисунок 2). Улавливаемые частицы из этих источников питьевой воды включали широко распространенные пластмассы, такие как полистирол (ПС) и полиэтилен (ПЭ), тяжелые металлы, такие как железо, диоксид кремния, и несинтетические частицы.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Процедуры контроля качества и препараты раствора Ultrapure 

  1. Чистка капюшона и перчаток с ламинарным потоком
    1. Донские СИЗ (средства индивидуальной защиты): лабораторный халат из 100% хлопка и нитриловые перчатки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: СИЗ непрерывны на протяжении всего протокола.
    2. Распылите нитриловые перчатки с 99% изопропиловым спиртом (IPA). Потрите руки друг о друга, а затем промойте ~18 МОм, 0,22 мкм фильтрованной воды. Сделайте это 3 раза, чтобы удалить разделительный агент из перчаток.
    3. Сложите натуральное волокно, деликатно протрите на четвертинки, затем распылите 70% IPA. Протрите поверхность капота сзади вперед длинными движениями, складывая деликатную салфетку на неиспользуемую поверхность каждые два штриха. Продолжайте чистить вытяжку до тех пор, пока не будут очищены все поверхности, заменив салфетку на новую после загрязнения.
    4. Раскройте силиконовый роликовый коврик и прокатитесь по поверхности капюшона, чтобы собрать оставшиеся частицы. Чтобы очистить силиконовый валик, распылите 99% IPA и потрите рукой в перчатке, затем промойте 18 МОм, фильтрованной 0,22 мкм водой. Повторите 3 раза, затем дайте высохнуть на воздухе в капюшоне.
    5. Повторно прополощите перчатки, как в пункте 1.1.2.
  2. Производство сверхчистой воды и IPA.
    1. Наполните стакан объемом 1 л водой 18 МОм и поместите его в колпак.
    2. Подготовьте шприц объемом 60 мл и присоединенный к нему фильтр отрезного шприца длиной 0,22 мкм, отфильтровав не менее 200 мл воды с концентрацией 18 МОм через шприц и подключенный фильтр.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шприцевой насос сэкономит время, но не является обязательным требованием для выполнения описанного протокола.
    3. Ополосните стеклянный контейнер с завинчивающейся крышкой 3 раза 18 МОм, 0,22 мкм - фильтрованной водой. Наполните 0,22 мкм отфильтрованной шприцем 18 МОм отфильтрованной воды.
    4. Повторите шаги 1.2.1-1.2.3 с желаемой процентной концентрацией IPA вместо 18 МОм, 0,22 мкм отфильтрованной воды для получения сверхчистого IPA.

2. Улавливание частиц из жидких образцов с помощью фильтрации

ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенный ниже протокол может быть использован с образцами жидкости, отличными от воды. Валидированные методы сбора образцов должны быть оставлены на усмотрение исследователя в зависимости от потребностей его исследования и выборки.

  1. Наденьте СИЗ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что перчатки и поверхности капюшона очищены в соответствии с пунктами 1.1.2-1.1.5.
  2. Сбрызните силиконовую прокладку Ultrapure 99% IPA, потрите пальцами в перчатках, затем промойте водой Ultrapure. Повторите это 3 раза для каждой прокладки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество прокладок, используемых для фильтрации, равно количеству используемых фильтровальных дисков плюс 1. Изображение визуальной сборки приведено на рисунке 1B .
  3. Используя шприц, подготовленный на шаге 1.1.2, промойте внутреннюю часть шприца объемом 60 мл ультрачистой водой, набрав в шприц 30 мл сверхчистой воды и 30 мл воздуха. Накрутите шприцевой фильтр, затем энергично встряхните и выдавите. Повторите это 3 раза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости можно использовать шприц любого размера в зависимости от объема образца.
  4. Соберите фильтрационное устройство, как показано на рисунке визуальной сборки на рисунке 1B.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте чистый пинцет для работы с фильтрующими дисками и прокладками во время сборки и разборки.
    1. Для последовательной фильтрации убедитесь, что между диском и опорной фриттой есть прокладка, между каждым диском — прокладка, а между диском и фильтрационной воронкой — прокладка.
    2. Убедитесь, что диски упорядочены так, чтобы самый большой отсечной фильтр находился в верхней части стопки, а самый маленький отсечной фильтр — в нижней.
  5. Включите вакуум на аппарат так, чтобы через стек дисков фильтра был отрицательный поток.
  6. Измерение фонового загрязнения
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий процесс позволяет оценить очистку шприца и образование ультрачистой среды, а также определить фоновые частицы, вносимые компонентами системы.
    1. С помощью промытого шприца медленно нанесите 50 мл ультрачистой воды на наномембрану в центре верхнего диска, чтобы убедиться, что вся дозируемая жидкость отфильтрована.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При фильтрации больших объемов образцов (например, >50 мл) рекомендуется использовать стеклянную фильтрационную воронку. Очистите стеклянную фильтрационную воронку, как в шаге 2.3. Дополнительная лабораторная посуда может подвергаться дополнительному риску загрязнения частицами. Внимательно относитесь к процедурам очистки и всегда проверяйте чистоту с помощью пустых фильтров перед использованием интересующих образцов.
    2. Дайте сверхчистой воде отфильтроваться. Держите вакуум включенным еще одну минуту после фильтрации. Когда образец полностью высохнет, выключите пылесос.
    3. Осторожно снимите фильтрующие диски с прокладок с помощью чистого пинцета и поместите диски в соответствующую чистую и маркированную емкость для хранения, например, в стеклянную чашку Петри или затемненный ящик.
    4. Визуализация фильтровальных дисков под микроскопией для оптического анализа, подсчета частиц и т.д.
  7. Для жидких образцов очистите дополнительную прокладку, как описано в шаге 2.2. Приобретите новый шприц для каждого уникального образца жидкой среды и повторите шаг 2.3.
  8. Наберите желаемое количество образца и медленно распределите образец по наномембране в центре верхнего диска.
  9. После завершения фильтрации образца проведите 3 промывки 1 мл ультрачистой воды, чтобы убедиться, что все частицы в образце были достаточно смыты со всех поверхностей на мембрану в центре фильтрующего диска.
  10. Оставьте пылесос включенным еще на одну минуту, чтобы полностью высушить 3-кратно промытый образец, затем выключите пылесос.
    1. Повторите шаги 2.7-2.10. для каждой репликации интересующего образца.

3. Приготовление флуоресцентного красителя и окрашивание

ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентное окрашивание нильским красным и/или трипановым синим может создавать помехи для спектроскопии комбинационного рассеяния света.

  1. Окрашивание нильским красным (NR)
    1. Наденьте СИЗ.
    2. Очистите перчатки и капюшон, как указано в пунктах 1.1.2-1.1.5.
    3. Завершите фильтрацию проб, как описано в шагах 2.7-2.10.
    4. Промойте две стеклянные емкости с завинчивающейся крышкой ультрачистой водой 3x.
    5. Приготовьте 0,1 мг/мл раствора NR в Ultrapure 99% IPA в чистой стеклянной таре.
    6. Аккуратно переверните в 10 раз, чтобы перемешать.
    7. Отфильтруйте раствор NR с помощью шприцевого фильтра 0,22 мкм во второй стеклянный контейнер с завинчивающейся крышкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтр, используемый для предварительной фильтрации NR, должен иметь меньшую отсечку, чем фильтр, используемый для фильтрации образцов.
    8. Поместите фильтрующий диск, который нужно окрашивать, на опорную фритту вакуумной колбы.
    9. Пипетка 20 мкл раствора NR 0,1 мг/мл на наномембрану в центре диска фильтра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Морилка должна полностью покрывать пористую поверхность наномембраны. Если 20 мкл недостаточно, добавьте дополнительное окрашивание до тех пор, пока все пористые участки наномембраны не будут соответствующим образом покрыты морилкой.
    10. Выдержите пятно в течение 5 минут.
    11. Вакуумируйте пятно после завершения инкубации.
    12. Промойте 3 раза 1 мл ультрачистого 99% IPA, чтобы удалить излишки NR пятна.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перейдите к разделу окрашивания Trypan Blue ниже после этого шага, если необходимо выполнить противоокрашивание.
    13. Дайте фильтрующему диску посидеть на опорной фритте с включенным вакуумом в течение 2 минут, чтобы отфильтровать и высушить остатки жидкости. Если через 2 минуты диск не высохнет, перенесите фильтрующий диск с помощью чистой стеклянной чашки Петри в духовку при температуре 70 °C на 2-5 минут.
    14. После высыхания проведите флуоресцентную микроскопию, как описано в шаге 2.6.4, и перейдите к разделу 4.
  2. Окрашивание трипановым синим (TB)
    1. Наденьте СИЗ.
    2. Очистите перчатки и капюшон, как указано в пунктах 1.1.2-1.1.5.
    3. Завершите фильтрацию проб с шагов 2.7-2.10 или начните с шага 3.2.4.
    4. Промойте две стеклянные емкости с завинчивающейся крышкой ультрачистой водой 3x.
    5. Приготовьте 0,4% морилку от туберкулеза в одной емкости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтр, используемый для предварительной фильтрации TB, должен иметь меньшую границу, чем фильтр, используемый для фильтрации образцов.
    6. Аккуратно переверните в 10 раз, чтобы перемешать.
    7. Отфильтруйте раствор для пятен TB с помощью шприцевого фильтра 0,22 мкм во второй стеклянный контейнер с завинчивающейся крышкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтр, используемый для предварительной фильтрации TB, должен иметь меньшую границу, чем фильтр, используемый для фильтрации образцов.
    8. Поместите фильтрующий диск, который нужно окрашивать, на опорную фритту вакуумной колбы.
    9. Нанесите пипеткой 20 мкл 0,4% TB-красителя на наномембрану в центре фильтрующего диска.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Морилка должна полностью покрывать пористую поверхность наномембраны. Если 20 мкл недостаточно, добавьте дополнительное окрашивание по каплям, пока все пористые участки наномембраны не будут соответствующим образом покрыты морилкой.
    10. Выдержите пятно в течение 5 минут.
    11. Вакуумируйте пятно после инкубации в течение 5 минут.
    12. Промойте 1 мл ультрачистой воды 3x.
    13. Дайте фильтрующему диску посидеть на опорной фритте с включенным вакуумом в течение 2 минут, чтобы отфильтровать и высушить остатки жидкости. Если через 2 минуты диск не высохнет, перенесите фильтрующий диск с помощью чистой стеклянной чашки Петри в духовку при температуре 70 °C на 2-5 минут.
    14. После высыхания проведите флуоресцентную микроскопию, как описано в шаге 2.6.4, и перейдите к разделу 4.

4. Количественное определение частиц с помощью флуоресцентной микроскопии

  1. Захват изображений с помощью оптической микроскопии
    1. Иммобилизуйте фильтрующий диск на предметном стекле микроскопа с помощью силиконовой прокладки или используйте юстировочное стекло, предназначенное для использования фильтрующего диска с предметным столиком для микроскопа. Переместите диск фильтра, который нужно изобразить, на предметный столик микроскопа.
    2. Визуализируйте наномембрану с помощью светлопольного освещения так, чтобы максимальное количество обнаруженных значений составляло ~ 90% от максимального диапазона камеры детектора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это значение 90% равно ~59,000 для 16-битного детектора с уровнем белого на 65,535.
    3. Визуализируйте наномембрану с помощью флуоресцентного освещения, чтобы максимальная интенсивность пикселей составляла около ~25% от максимального диапазона камеры детектора.
    4. Сохраните изображение в 16-битном композитном формате TIFF.
  2. Количественное определение частиц с помощью флуоресцентной микроскопии
    1. Используя платформу для анализа изображений, отделите флуоресцентные каналы композитного файла TIFF, созданного в соответствии с разделом 4.1.4, от светлопольного канала с помощью функции Split-Channels .
    2. Установите пороговое значение интенсивности пикселей с помощью функции Порог до значения 10 000.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если на частицах присутствует налет, порог слишком низок и его следует поднять.
    3. Сохраните отдельное изображение в формате PNG.
    4. Удалите пятнышки на изображении, чтобы удалить шумовые пиксели с помощью функции «Удалить пятна ».
    5. Сделайте водораздел изображения с помощью функции Водораздел .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта функция отделяет соседние частицы одинакового размера, за счет разбиения крупных смежных частиц на более мелкие кусочки. Поскольку мелких частиц часто гораздо больше, чем крупных, это может быть хорошим компромиссом, но может привести к непредвиденным последствиям, таким как разрушение длинных волокон на нити мелких частиц. Проверьте результаты изображения перед приемом данных.
    6. Установите масштаб пороговых флуоресцентных изображений, измерив ширину пор в светлопольном изображении. Используйте измеренную ширину пор для установки масштаба в пикселях/мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для прямоугольных пор наименьшая ширина будет соответствовать этикетке продукта. Для круглых пор диаметр будет соответствовать этикетке продукта, указывающей размер пор (т.е. отсечку) наномембраны.
    7. Примените функцию Count Particles платформы анализа изображений к пороговому флуоресцентному изображению, оценив Площадь, минимум и максимум.
    8. Обрабатывайте флуоресцентные и светлопольные изображения для создания композитов, визуализирующих флуоресцентные области.
    9. Установите порог для флуоресцентного изображения, используя то же значение, что и в шаге 4.2.2.
    10. Объединяйте каналы с помощью платформы анализа изображений. Назначьте флуоресцентный канал на красный канал, а светлопольное изображение на канал серого .
    11. Сохраните композит в формате PNG.

5. Рамановская спектроскопия

  1. Включите рамановский прибор и связанный с ним компьютер, позволив каждому из них запуститься.
  2. Откройте программное обеспечение на компьютере, подключенном к рамановскому прибору.
  3. Когда программное обеспечение будет инициализировано, убедитесь, что поля «Текущая активность системы » и «Состояние детектора » на нижней ленте экрана программы имеют статус «Готово » и выделены зеленым цветом соответственно.
  4. Если кнопка автокалибровки (AC) в нижней части экрана красная, запустите нужную автокалибровку и дождитесь ее завершения, прежде чем продолжить.
  5. Если использовать только один лазер и одну решетку:
    1. Нажмите «Выход» на экране «Автокалибровка», затем выберите нужный лазер и решетку из соответствующих выпадающих списков в разделе «Настройка прибора» на вкладке «Сбор».
    2. Вернитесь к красной кнопке переменного тока в нижней части экрана, нажмите «Текущий лазер/решетка» и дождитесь выполнения процедуры калибровки.
  6. Если вы используете все лазеры и решетки, просто выберите «Все лазеры и решетки » и позвольте системе работать.
  7. Если вы используете более одного лазера и/или решетки, выберите «Пользовательские лазеры/решетки» и выберите все желаемые настройки. Затем дождитесь выполнения калибровки.
  8. Выберите цель «20-кратное большое рабочее расстояние» (LWD) на револьверной головке приборов и в программном обеспечении в разделе «Настройки прибора » на вкладке «Съемка ».
  9. Если этот объектив недоступен, используйте альтернативный объектив с малым увеличением (например, 5x или 10x) с рабочим расстоянием, которое соответствует высоте диска фильтра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Начните с объектива с меньшим увеличением, чтобы облегчить первоначальную навигацию по наномембране фильтрующего диска.
  10. Поместите диск фильтра на предметный столик микроскопа так, чтобы он находился в пределах оптического пути.
  11. Нажмите Сбор видео на верхней ленте, чтобы включить оптику визуализации.
  12. Используйте колеса грубой и тонкой фокусировки на приборе, чтобы сфокусировать наномембрану фильтрующего диска.
  13. Примерно выровняйте поры линиями курсора на экране компьютера.
  14. Либо осторожно поверните фильтрующий диск на предметном столике, чтобы добиться этого квадратного выравнивания, либо используйте предметное стекло, предназначенное для использования фильтрующего диска в предметном столике микроскопа.
  15. На вкладке «Получение» в правом верхнем углу убедитесь, что выбран режим подсветки «Темное поле» для достижения наилучших результатов.
  16. Чтобы получить сшитое изображение, перейдите на вкладку « Видео » на ленте «Вкладки данных».
  17. Перейдите к первому нужному полю зрения, затем нажмите кнопку «Мозаика » в правом верхнем углу видеоокна и добавьте на карту. Перейдите во внешний противоположный угол нужной области с помощью джойстика прибора и добавьте на карту.
  18. Запустите сканирование мозаики с помощью ViewSharp , чтобы убедиться, что все области на конечном изображении правильно сфокусированы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объективы с меньшим увеличением потребуют меньше времени для создания мозаики изображения, в то время как объективы с большим увеличением потребуют больше времени.
  19. После того, как мозаика изображения будет создана, щелкните правой кнопкой мыши по изображению и нажмите «Отправить в ParticleFinder».
  20. Перейдите на вкладку ParticleFinder в правом верхнем углу ленты, чтобы взаимодействовать с настройками пороговых значений.
  21. Чтобы убедиться, что выбраны нужные частицы, щелкните левой кнопкой мыши «Изображение » на вкладке данных ParticleFinder и установите флажки « Центр», « Частица » и «Прозрачность ». Установите ползунок прозрачности на 50%, а размер пикселя Центра на 2 пикселя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При выделении центра будет размещена точка в центре каждой частицы, а при выборе Частицы будет наложено наложение на каждую область, определенную как частица, с прозрачностью 50%. Эти настройки будут определять местоположение каждой частицы и определять края каждой частицы.
  22. При необходимости отредактируйте пороговые значения частиц и параметры выбора морфологии/размера на вкладке ParticleFinder в правой части программы, чтобы убедиться, что все частицы и их параметры размера/формы правильно идентифицированы. В Дополнительной таблице S2 приведен пример того, как могут быть применены морфологические параметры.
    1. Если автоматического обнаружения частиц недостаточно, переключитесь на ручной режим и постепенно корректируйте пороговые значения до тех пор, пока большинство правильных объектов не будут идентифицированы как частицы.
    2. Если морфология обнаруженных частиц нуждается в доработке, поставьте галочку напротив пункта Применить морфологические фильтры. Выберите подходящие параметры и их интенсивность в появившихся выпадающих меню.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Порядок выбора параметров может повлиять на вывод.
  23. Если размер, форма или другие морфологические свойства частиц являются критическими факторами, установите флажок рядом с пунктом «Применить предварительную фильтрацию частиц», затем выберите и отредактируйте параметры по мере необходимости.
  24. После того как частицы будут идентифицированы и их выбранные формы/края станут приемлемыми, перейдите к прокручиваемому списку изображений частиц в разделе «Результаты ». Выберите интересующую частицу, щелкнув по изображению соответствующей частицы.
  25. Включите просмотр в реальном времени с помощью кнопки видеокамеры в верхней части экрана.
  26. Переключитесь на объектив 50x LWD , щелкнув по числу увеличения и выбрав соответствующий объектив в раскрывающемся меню в приложении на нижней ленте.
  27. При необходимости верните частицу (частицы) в фокус с помощью ручки точной регулировки.
  28. Захватывайте изображения отдельных частиц, анализируемых с помощью рамановской спектроскопии, и сохраняйте изображения в виде отдельных файлов с соответствующими именами.
  29. Убедитесь, что желаемая область частицы, подлежащей анализу с помощью рамановской спектроскопии, расположена правильно под местом расположения лазерного луча.
  30. После того, как соответствующая область частицы выбрана для анализа, нажмите кнопку STOP ALL в верхней части окна, чтобы выключить оптику визуализации.
  31. Установите лазер на 532 нм, на 1% мощности для неокрашенных частиц и на 785 нм или 830 нм для флуоресцентно окрашенных частиц.
  32. Установите время сбора данных на 10 с , а накопление на 5.
  33. Выберите вкладку «Спектры» в меню вкладок данных, затем нажмите кнопку воспроизведения, чтобы запустить отображение в реальном времени (RTD).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте информацию, полученную во время RTD, для оптимизации настроек.
  34. После того, как вы будете удовлетворены настройками и результатами, нажмите STOP ALL, чтобы остановить RTD.
  35. Последнее приобретение теперь можно получить, нажав круглую кнопку «Приобретение спектра » рядом с кнопкой RTD.
  36. Сохраните собранные спектры в виде отдельных файлов с соответствующими именами.
  37. Повторите шаги 5.28-5.36. для каждой интересующей частицы.
  38. Когда вы закончите с образцом, извлеките диск с фильтром и верните объектив на 20X LWD вручную как на осциллографе, так и в программном обеспечении.
  39. Повторите шаги 5.10-5.37 для новых образцов.

6. Спектральная идентификация

  1. Если приобретенная или самостоятельно созданная база спектральных данных комбинационного рассеяния света недоступна, перейдите к библиотеке спектроскопии с открытым исходным кодом по адресу: https://www.openanalysis.org/openspecy/
    ПРИМЕЧАНИЕ: OpenSpecy - это база данных рамановской и инфракрасной спектроскопии с открытым исходным кодом, которая включает 636 спектров из трех различных библиотек 276 полимеров и материалов, применимых для идентификации МП и волокон окружающей среды. Предварительно и постобработанные спектральные данные одинаково пригодны для использования с этим ресурсом.
  2. Сохраняйте спектры комбинационного рассеяния света в виде отдельных файлов .csv.
    1. Обозначьте столбец A как волновое число, за которым следуют волновые номера спектров, а столбец B должен быть помечен как Intensity, за которым следуют значения пиковой интенсивности для каждого волнового числа.
  3. Откройте спектры , перетащив файл .csv на панель обзора в левом верхнем углу.
  4. Включите функцию «Предварительная обработка и идентификация».
  5. В разделе Предварительная обработка включите параметры Пороговый шум сигнала, Нормализация минимально-максимального значения, Сглаживание/производная, Согласование волновых чисел и Коррекция базовой линии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конкретные настройки в нем могут быть скорректированы в зависимости от индивидуальных характеристик анализируемых спектров.
  6. В разделе Идентификация выберите Рамановское искажение в качестве типа спектра и Производное в качестве Библиотечного преобразования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта библиотека также может быть использована для ИК-спектроскопии. В окне анализа будет отображаться белый спектр, загруженный спектр для анализа, и красный спектр, предполагаемое совпадение идентификации.
  7. С любыми спектрами, которые не возвращают соответствие r > 0,70 или разумные корреляции формы пика, используйте 5 лучших предложенных результатов в качестве отправной точки для начала исследования потенциальных совпадений как предпочтительных.
  8. Убедитесь, что измеренные пиковые значения находятся в пределах ±10 волновых чисел от соответствующего пика в выбранных опорных спектрах, прежде чем подтверждать совпадение для этого пика.
  9. Записывайте спектральные корреляции, их значения корреляции и базу данных, из которой происходит предполагаемое совпадение.
  10. Загружайте файлы в соответствии с индивидуальными потребностями.

7. Сканирующая электронная микроскопия

ПРИМЕЧАНИЕ: Если перед анализом СЭМ диск фильтра не покрыт металлическим покрытием, перейдите к разделу 7.2.

  1. Нанесение металлических покрытий образцов для СЭМ
    1. Установите фильтрующий диск на стальную заглушку SEM с помощью углеродной ленты.
    2. Вставьте в распылитель и откачайте камеру до 50 мТорр.
    3. Откройте запорный клапан с напылением Ar (аргона).
    4. Продуйте систему путем введения Ar в камеру через игольчатый клапан до давления 300 мТорр, затем откачайте из камеры до 50 мТорр. Повторите 3 раза.
    5. Отрегулируйте конечное давление до 100 мТорр с помощью игольчатого клапана.
    6. Используя мишень Au, нанесите Au на диск фильтра с помощью распыления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Другие целевые источники (например, Pt, Ir, Si и т.д.) могут быть использованы вместо Au; Ток 20 мА дает 0,1 ангстрема/с осаждения при 100 мТорр.
    7. Проветрите систему и снимите диск фильтра. Следите за тем, чтобы диск фильтра был приклеен к заглушке из нержавеющей стали.
  2. Захват изображения SEM
    1. Закрепите заглушку на многоступенчатом держателе Zeiss Auriga с помощью установочного винта.
    2. Включите SEM и компьютеры, на которых он работает, и дайте каждому из них запуститься.
    3. Откройте программное обеспечение, подключенное к SEM.
    4. Убедитесь, что система находится под вакуумом (5e-6 Torr).
    5. Отключите загрузочный замок, нажав кнопку Vent на основном корпусе камеры загрузочного замка, и откройте загрузочный замок.
    6. Установите многоступенчатый держатель на вставной приспособление с тефлоновым покрытием и закрепите рычаг переноса с помощью прилагаемой винтовой пластины.
    7. Закройте загрузочный замок и откачайте загрузочный замок, нажав кнопку «Магазин » на главном корпусе камеры загрузочного замка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Завершение происходит, когда зеленые индикаторы перестают мигать на кнопке «Магазин ».
    8. Загрузите многоступенчатый держатель на сцену в главной камере наблюдения, открыв передаточный затвор.
    9. Нажмите кнопку Transfer на основном корпусе грузового замка. Ворота опустятся и обнажат внутреннюю камеру.
    10. Вставьте рычаг загрузочного замка (ввинчен в многоступенчатый держатель) и закрепите многоступенчатый держатель на столике.
    11. Отвинтите рычаг переноса грузового замка и полностью втяните рычаг так, чтобы он находился в грузовом замке.
    12. Закройте передаточные ворота, нажав кнопку Передать.
    13. Откройте запорный клапан, нажав кнопку EHT в правом нижнем углу программного обеспечения.
    14. Отрегулируйте рабочее расстояние на 5 мм в зоне данных программного обеспечения, а ускоряющее напряжение на 20 кВ.
    15. Локализуйте мембрану фильтрующего диска с помощью джойстиков XY и Z.
    16. Поднимайте рабочую область с помощью Z-джойстика , пока изображение не станет сфокусированным.
    17. Исправьте астигматизм , отрегулировав ручки стигматора XY и колесо фокусировки на центральной консоли.
    18. Изображение образцов частиц с желаемым увеличением регулируется колесиком увеличения на центральной консоли, захватывая изображения с разрешением 2 048 x 1 536 в формате tiff 8 или 16 бит.
  3. Анализ частиц EDX
    1. Выключите ПЗС-матрицу ChamberScope на рабочем столе компьютера SEM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если этот шаг не будет завершен, детектор EDX будет перегружен сигналом, и данные не будут записываться.
    2. Охладите детектор EDX, открыв программное обеспечение APEX EDX на компьютере EDX и включив детектор в меню в правом верхнем углу.
    3. Захватите изображение SEM с низким разрешением, которое можно использовать для сопоставления, нажав кнопку Захватить изображение.
    4. Откройте меню «Вкладка сопоставления » в верхней части экрана программного обеспечения.
    5. В разделе «Настройки» отрегулируйте разрешение (256 x 256) и время задержки пикселей (0,16 μс), а также количество кадров (32-64), чтобы обеспечить расчетное время съемки, которое должно составлять ~5 минут.
    6. Нажмите «Создать карту» в левом верхнем углу меню.
    7. Выберите "Подтвердить предварительный просмотр элемента ", чтобы вручную настроить поиск элементов, или положитесь на автоматически определяемые пики из программного обеспечения.
    8. По завершении сгенерируйте отчет с помощью функции «Автоотчет» в правом верхнем углу картографического программного обеспечения.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Технологические заготовки и фоновое загрязнение
Приемлемым бланком является результат, который либо не содержит частиц, либо содержит так мало частиц, что фоновое загрязнение (т.е. технологическое) загрязнение (если таковое имеется) не создает высокой вероятности сбить с толку или нарушить результаты эксперимента. Неоптимальным бланком является результат, содержащий много частиц, которые будет трудно отличить от фонового загрязнения.

Допустимый уровень загрязнения технологического процесса должен быть на уровне нуля или как можно ближе к нему, но если ноль не может быть достигнут, то ключевым фактором является постоянство в количестве наблюдаемых фоновых частиц. Запустите несколько пустых образцов, чтобы определить согласованность результатов. Тщательное соблюдение протоколов контроля качества (см. раздел 1), снижение уровня загрязнения и надлежащие условия окружающей среды во время обработки имеют первостепенное значение для поддержания низкого уровня фонового загрязнения. Результаты фонового загрязнения и приемлемость также могут в значительной степени зависеть от отсечения используемых наномембран и общей чистоты лабораторных условий. Примите во внимание, что при анализе более мелких частиц с более низкими отсечными мембранами (например, < 8 мкм) относительная распространенность представляющих интерес частиц и фоновых загрязнителей аналогичного размера будет увеличиваться экспоненциально, что потребует применения более строгих уровней контроля качества22. Несмотря на то, что любой уровень загрязнения недопустим, при условии строгого контроля условий и достижения высокой степени согласованности все же можно проводить тщательный анализ микропластика в окружающей среде или аналитику, представляющую интерес.

Фильтрация проб
Идеальная фильтрация проб необходима для получения достоверного мультимодального анализа, как показано на примере каскада данных на рисунке 3. Такая фильтрация образцов приведет к образованию хорошо диспергированных частиц по поверхности наномембраны (например, с примерно одной третью площади поверхности мембраны). Плохо диспергированные частицы, такие как в случае агрегации частиц (большие сгустки перекрывающихся частиц), могут запутать как ручные, так и автоматические методы подсчета частиц, поскольку перекрывающиеся частицы не так легко дифференцировать с уверенностью. Такие данные обычно исключаются из анализа, что может привести к потере ценной информации, представляющей интерес. Хорошо диспергированные частицы, как показано на рисунках 4A, B, гарантируют, что любой спектроскопический или количественный анализ не будет осложнен уложенными или перекрывающимися частицами различного состава, которые могут дать результаты, которые сложнее точно интерпретировать, идентифицировать и количественно оценить.

Окрашивание нильским красным и трипановым синим
Репрезентативные изображения оптимальных случаев окрашивания флуоресцентных частиц показаны на рисунке 3B на диске фильтра SiN с длиной 20 мкм. Недостаточное смывание пятна NR или TB с поверхности наномембраны может привести к ложноположительным результатам. Остаточные частицы, состоящие из любого из пятен, остающихся на поверхности мембраны из-за недостаточного промывания, могут быть ошибочно интерпретированы как окрашенные частицы. Признаком недостаточной промывки является флуоресцирование участков наномембраны без частиц или обнаруживаемых остаточных пленок/остатков отфильтрованного образца во время наблюдения, как показано на рисунке 5A. После визуализации, при условии, что фильтрующий диск поддерживался в чистых условиях, можно провести повторную промывку путем помещения отдельного наномембранного фильтрующего диска обратно в вакуумный фильтрационный аппарат (за вычетом прокладок), включения вакуума и фильтрации еще одного объема сверхчистого 99% IPA (для NR) или сверхчистой воды (для TB) на наномембране фильтрующего диска. Запишите общий объем использованного дополнительного промывочного материала. Для достижения наилучших результатов перед повторной промывкой сделайте микроскопические изображения всей поверхности наномембраны, чтобы учесть любое загрязнение, которое может возникнуть на этапе повторного промывки.

Рамановская спектроскопия
Спектроскопия комбинационного рассеяния света, выполненная на SiN без покрытия, может дать заметный пик в зависимости от длины волны лазера, и этот пик может маскировать сигналы с низкой распространенностью примерно в пределах области волн23 520 см-1. Если интересующие нас спектры комбинационного рассеяния света достаточно отделены от фонового пика кремния или нитрида кремния, использование фильтровальных дисков без покрытия SiN должно дать адекватные результаты рамановской спектроскопии. В этом отчете трубопроводы B и C использовали фильтрующие диски Au-SiN. Золотое покрытие Au-SiN маскирует присущий ему пик Si, позволяя более надежно собирать спектры с низкой распространенностью вблизи или на волнах 520 см-1. Кроме того, Au-SiN можно использовать с ИК-спектроскопией, если рамановская спектроскопия недоступна. Всегда начинайте с самых низких настроек мощности (т. е. интенсивности лазера) на приборе, а затем постепенно увеличивайте, так как некоторые интересующие частицы могут быть хрупкими, например, окисленные частицы, и могут быть повреждены или разрушены лазером.

При анализе выбранных частиц с помощью рамановской спектроскопии определение надежности возвращаемого спектра имеет решающее значение. Некоторые частицы могут самофлуоресцировать, и эта флуоресценция добавит шум в спектральные измерения, который может замаскировать или затруднить интерпретацию сигнала частиц. Этот шум будет иметь форму полосы высокой интенсивности, которая охватывает широкий диапазон волновых чисел, объединяя лежащие в основе данные. Собственные спектры, показанные на рисунках 3C и 4C,D, даже до коррекции базовой линии, будут иметь четко определенные пики на более коротких отрезках волновых чисел. Если не возникает пиков, которые по крайней мере в три раза превышают любой из окружающих сигналов, то вполне вероятно, что собранные спектры являются либо фоновым шумом, либо что для анализа рассматриваемой частицы требуются другие настройки прибора. Убедитесь, что для каждого образца выбрана правильная длина волны лазера. Лазеры с более низкой длиной волны, такие как лазер с длиной волны 532 нм, не могут в достаточной степени обрабатывать сигнал, генерируемый флуоресценцией. Лазер с более высокой длиной волны, такой как лазер с длиной волны 782 нм или 830 нм, может в достаточной степени игнорировать флуоресценцию, чтобы вернуть спектр. В зависимости от типа образца, разные лазеры будут подходить для разных типов частиц и, по возможности, могут меняться местами во время сбора данных на одном фильтрующем диске.

Для определения состава частиц их собранные спектры сравниваются с спектрами в базе данных референсных спектров. Надежная идентификация заданного спектра частиц даст коэффициент Пирсона (r) больше 70% (r > 0,70). Субоптимальные рамановские данные показаны на рисунке 5B, где < 0,70. Результаты идентификации МП полезны для определения потенциальных источников загрязнения МП. Для отображения результатов идентификации частиц можно отобразить изображение и спектры анализируемой частицы, как показано на рисунках 3C и 4C.

Сканирующая электронная микроскопия
Фильтрующие диски SiN и Au-SiN совместимы с SEM сразу после улавливания частиц путем фильтрации. Если фильтрующие диски SiN не покрыты Au или Pt до и после захвата частиц, некоторые частицы могут быть более легко «заряжены» ионизационным пучком SEM, что может привести к тому, что частица будет либо светиться, либо казаться очень яркой на изображениях. Эта яркость/свечение может вызвать проблемы с визуализацией из-за плохой контрастности, например, маскировки морфологии частицы. Чтобы смягчить ситуацию, проведите оптическое/флуоресцентное микроскопирование и рамановскую спектроскопию перед СЭМ, чтобы пометить все трудноанализируемые или мелкие частицы, представляющие интерес для последующего анализа СЭМ/ЭДХ, затем покройте наномембрану Au или Pt, как описано в разделе 7 протокола, и выполните СЭМ/ЭДХ.

Покрытие SiN или Au-SiN Au или Pt после захвата частиц и до анализа SEM помогает предотвратить этот эффект заряда во время визуализации, поскольку частицы теперь больше не подвержены ионизации под утилизированным металлическим слоем. Это покрытие улучшает контраст и разрешение, что позволяет получить более глубокое морфологическое понимание данной частицы, как показано на рисунке 3D (волокно против фрагмента) или морфологии поверхности, такой как ямки и трещины на окисленных частицах. Частицы металлического покрытия до анализа SEM навсегда предотвратят их дальнейший анализ с помощью спектроскопии или флуоресцентной визуализации, что делает возможным только анализ SEM/EDX. Таким образом, нанесение покрытия на частицы и выполнение SEM/EDX должны быть заключительными этапами в любом процессе, если это задумано.

Измерения EDX могут быть выполнены на захваченных частицах как до, так и после нанесения металлического покрытия. EDX может выявить специфический элементный состав данной частицы или области, который хорошо сочетается с любыми частицами, размер которых меньше предела обнаружения для рамановского анализа, или элементными составами, которые могут быть трудно проанализировать с определенными длинами волн рамановского лазера, такими как металлы, сплавы, насыщенные водой частицы и частицы, которые сильно флуоресцируют при воздействии доступных для использования лучей рамановского лазера. В этом исследовании частицы были покрыты слоем Au толщиной 6 нм. Визуализация SEM была выполнена в диапазоне от 200x до 3000x с мощностью луча 20 кВ и фокусным расстоянием 5 мм. Соответствующие СЭМ-изображения выбранных частиц показаны на рисунке 3D.

Репрезентативные результаты EDX показаны на рисунке 3F. Обнаруженные элементы с массой в процентах менее 1% могут считаться следовыми или ненадежными в зависимости от чувствительности прибора; Поэтому мы устанавливаем порог на уровне 1%. Если выбранные для анализа EDX частицы были покрыты, то обнаруживаемое количество покрытия будет присутствовать в отчете об элементах. При использовании фильтрующих дисков SiN без покрытия будут наблюдаться сигналы Si и N, как показано на рисунке 3F. К сожалению, большинство синтетических полимерных частиц также содержат элементы C, H и O, поскольку большинство несинтетических частиц из биологических источников также состоят из тех же элементов, но несинтетические частицы также могут включать такие элементы, как S, как в случае белков. Это сходство в составе является причиной того, что метод противоокрашивания с помощью Нильского красного и Трипанового синего полезен для дифференциации между синтетическими и несинтетическими частицами, но не является исчерпывающим инструментом идентификации, поскольку Нильский красный также способен окрашивать несинтетические частицы в некоторых случаях. Дополнительные параметры анализа, подобные предложенным выше, следует использовать в сочетании с любыми процедурами окрашивания для подтверждения результатов. Кроме того, EDX может быть полезным инструментом для потенциальной идентификации частиц, которые находятся за пределами предела размера обнаружения для спектроскопии комбинационного рассеяния света (т.е. нанопластика размером < 1 мкм).

figure-results-1
Рисунок 1: Трубопроводы SNAP. (A) Схемы трубопроводов SNAP, характеризующие одни и те же частицы на одной и той же наномембране с помощью ряда различных аналитических методов. Трубопровод А) демонстрирует: 1) Интересные частицы, захваченные из образцов питьевой воды с помощью вакуумной фильтрации, 2) окрашиваются нильским красным и трипановым синим для дифференциации синтетических и несинтетических полимерных частиц соответственно, с последующей 3) идентификацией частиц с помощью рамановской спектроскопии и 4) SEM/EDX для характеристики морфологии частиц и идентификации элементов. Трубопровод В) демонстрирует 1) Захват частиц на Au-SiN с последующим 2) Рамановскую спектроскопию. Трубопровод В) демонстрирует 1) Захват частиц на Au-SiN с последующим SEM/EDX. (B) Схема фильтрующего диска и силиконовой прокладки в фильтрационной установке в вакуумном аппарате, изображающая последовательную фильтрацию через наномембрану MPSN размером 20 мкм, затем наномембрану MSSN длиной 8,0 мкм, разделенную силиконовыми прокладками. Сокращения: SNAP = Silicon Nanomembrane Analysis Pipeline; SEM = сканирующая электронная микроскопия; EDX = энергодисперсионная рентгеновская спектроскопия; MPSN = микропористый нитрид кремния. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Источники сбора проб питьевой воды. Региональная карта, опубликованная Управлением водных ресурсов округа Монро, с указанием мест, где была собрана каждая из четырех проб питьевой воды в регионе Большого Рочестера, штат Нью-Йорк. Образцы были взяты из разных поверхностных источников: озера Онтарио (синий), озера Хемлок (зеленый), озера Хемлок и озера Онтарио (желтый) и озера Канандайгуа (фиолетовый). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Резюме анализов, проведенных с помощью SNAP Pipeline A на частицах, захваченных из проб питьевой воды. (A) Изображение в оттенках серого для частиц, захваченных из одной репрезентативной пробы питьевой воды на 20 мкм отсечке SiN. (B) Наложение наложения частиц в ложном цвете для представления красных частиц Нила (частицы красного цвета ложного цвета) и синего трипана (частицы синего цвета ложного цвета). (C) Эталонный (красный) и собранный (белый) спектры комбинационного рассеяния света, идентифицирующие частицу, окрашенную в красный цвет Нила, как полиэтилен со значением r Пирсона 0,97, с репрезентативным изображением анализируемой частицы. (D) Электронная микрофотография двух различных типов частиц, демонстрирующая анализ морфологии частиц волокна (верхняя панель) и фрагмента (нижняя панель), оба из которых имеют окраску Trypan Blue. (E) Количественное определение частиц, окрашенных в красный цвет Нила, последовательно захватываемых на отсечных наномембранах размером 20 мкм и 8 мкм. (F) Обобщенный элементный анализ случайно выбранного фрагмента с помощью EDX и аналитические детали результатов с репрезентативным СЭМ-изображением анализируемой частицы. Сокращения: SNAP = Silicon Nanomembrane Analysis Pipeline; SEM = сканирующая электронная микроскопия; EDX = энергодисперсионная рентгеновская спектроскопия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Резюме анализов, проведенных с помощью SNAP Pipeline B на частицах, захваченных из проб питьевой воды. Спектральный анализ комбинационного рассеяния света трех рандомизированных частиц из четырех проб питьевой воды в домашних условиях, полученных на фильтрующих дисках Au-SiN с матрицей 20 мкм и 8,0 мкм MSSN. Репрезентативные темнопольные изображения общей активной площади мембраны для Au-SiN размером 20 мкм и 8 мкм показаны соответственно в A и B. В этом режиме изображения частицы отображаются желтым цветом, в то время как фон остается темным, что упрощает автоматический подсчет частиц. Репрезентативные спектры комбинационного рассеяния света синтетических и несинтетических частиц на (C) 20 мкм и (D) 8,0 мкм Au-SiN. Общее количество частиц для (E) 20 μm и (F) 8,0 μm Au-SiN разбито на диапазоны размеров, определенные программным обеспечением для автоматического поиска частиц. Сокращения: SNAP = Silicon Nanomembrane Analysis Pipeline; SEM = сканирующая электронная микроскопия; EDX = энергодисперсионная рентгеновская спектроскопия; MPSN = микропористый нитрид кремния; MSSN = микрощелевый нитрид кремния. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Неоптимальные результаты флуоресцентной визуализации и рамановской спектроскопии. (A) Неоптимальное флуоресцентное изображение окрашенных частиц (левая панель), где мембрана сохранила пятно нильского красного, вероятно, из-за недостаточной полоскания. Для спектроскопии комбинационного рассеяния света были выбраны две частицы: волокно, окрашенное трипановым синим, и фрагмент, окрашенный красным Нилом (правая панель). (B) Результаты неоптимальной рамановской спектроскопии, при которых коэффициент Пирсона (r) составляет менее 70 % (r < 0,70). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительная таблица S1: Свойства кремниевых наномембран в фильтрующих дисках. В этой таблице представлены свойства мембран в фильтрующих дисках SiN, включая минимальный размер пор, процент пористости, толщину мембран с покрытием Au и без него, активную площадь мембраны и газопроницаемость через мембрану с положительным давлением, приложенным при заданном постоянном давлении. Отсечка (т.е. размер пор), пористость, толщина и площадь мембраны определяются путем измерения особенностей на изображениях SEM. Данные о газопроницаемости представлены в виде среднего ± стандартного отклонения (n = 10) для положительного давления N 2 при давлении 103,42 кПа. Сокращения: Au = золото; Six Ny = нестехиометрический нитрид кремния. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица S2: Количество частиц и параметры ParticleFinder. Для каждого образца была сделана мозаика изображений всей мембранной области, и каждая мозаика изображения была проанализирована для сбора общего количества частиц. В этой таблице показаны используемые параметры и порядок определения общего количества частиц для каждого образца изображения, а также количества частиц при заданных размерах долей. Параметры варьируются от образца к образцу в зависимости от типа, количества и формы частиц, а также удельной отражательной способности каждой мембраны во время визуализации. Данные из этой таблицы визуализированы на рисунке 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Смягчение последствий загрязнения микропластиком вызывает растущую обеспокоенность; И первым шагом по смягчению последствий является выявление наличия загрязнения. Оптимизированный метод захвата и немедленного анализа имеет решающее значение для экономии времени следователей и сохранения чувствительных показателей пробы. В этом отчете описываются гибкие рабочие процессы, основанные на вариациях разработанных нами методов SNAP для анализа таких МП в жидких образцах, с использованием одной подложки для всех проводимых анализов. Образец должен быть подвергнут вакуумной фильтрации таким образом, чтобы частицы были захвачены и изолированы на кремниевой наномембране, размещенной внутри фильтрующего диска. Достаточное смягчение фонового загрязнения имеет решающее значение для достижения значимых результатов. Любые загрязняющие частицы на дозирующем шприце или стеклянной вакуумной воронке во время фильтрации могут загрязнить образец и одновременно быть захвачены, поэтому тщательное следование протоколам контроля качества Раздела 1 имеет решающее значение для получения точных результатов. Для информирования исследователей о фоновых загрязнениях, характерных для отдельных процессов и лабораторных условий, рекомендуется использовать только средства контроля со средой. Описанный здесь протокол основан на вакуумной фильтрации жидкого образца, а также на улавливании и выделении частиц из образца на двух различных дисках фильтра SiN с отсечкой. Для всех трубопроводов захват и выделение частиц должны предшествовать другим методам, но все другие методы идентификации могут быть выполнены в порядке, наиболее подходящем для исследователя.

В этом исследовании были использованы два флуоресцентных микроскопа, чтобы продемонстрировать воспроизводимость результатов с помощью разных приборов. В инструкциях подробно описывается использование Olympus BX61 для флуоресцентной микроскопии в связи с преобладанием его использования, и он работал в соответствии с инструкциями прибора с использованием светлого поля для получения изображений в оттенках серого, канал TRITC (Ex. ~543 нм; Эм. ~593 нм) для визуализации NR-окрашенных частиц, и канал Cy5 (Ex. ~649 нм; Эм. ~667 нм) для визуализации частиц, окрашенных туберкулезом, если применимо. Для отображения результатов окрашивания мы рекомендуем построить наложение изображений канала (для обработки изображений мы используем FIJI/ImageJ, далее именуемую платформой анализа изображений) с разрешением 2 048 x 2 040 пикселей и глубиной 16 бит. Изображения целой наномембраны могут быть отображены, как показано на рисунке 4A, B или в виде выбранных областей, представляющих интерес, как показано на рисунке 3A, B.

Nile Red обычно используется для окрашивания синтетических полимеров MP, но может окрашивать несинтетические полимеры из биологических источников из-за своей липофильной и гидрофобной природы, потенциально внося ложноположительные результаты, которые искажают результаты количественной оценки MP 24,25,26. Этап контрокрашивания Trypan Blue, как описано в разделе 3 протокола, рекомендуется для помощи в дифференциации ложноположительных событий, но не является исчерпывающим решением и должен сочетаться с дополнительными показателями анализа для подтверждения результатов. Флуоресценция частиц нильского красного цвета вызывает беспокойство при спектроскопии комбинационного рассеяния света, поскольку она может значительно увеличить фоновый сигнал. В этом исследовании, однако, мы окрашивали полимеры нильским красным и трипановым синим перед спектроскопии комбинационного рассеяния света с помощью лазера с длиной волны 830 нм, и наблюдался небольшой шум, как показано на рисунке 3.

Некоторые длины волн лазеров, пригодных для рамановской спектроскопии, не способны игнорировать флуоресценцию окрашенных частиц, таких как лазер с длиной волны 532 нм, и поэтому могут создавать значительные трудности в правильной оценке состава интересующей частицы. Металлическое покрытие частиц после захвата полезно для повышения контраста во время СЭМ-визуализации, но несовместимо с любым последующим спектроскопическим или флуоресцентным анализом. Запишите все необходимые измерения до начала эксперимента, чтобы убедиться, что технологический процесс и типы покрытий учтены должным образом. Фильтрующие диски Au-SiN могут использоваться для всех упомянутых анализов, когда просвечивающая микроскопия не имеет решающего значения для рабочего процесса, или когда используется рамановская или инфракрасная спектроскопия.

Показанные здесь методы, а также наномембраны, используемые для захвата и изоляции интересующих частиц, могут быть модифицированы в соответствии с индивидуальными потребностями исследователей. Наномембраны пригодны для ряда спектроскопических анализов, и исследователь может заменить фильтруемую среду на другую среду для образцов, представляющую интерес, включая, но не ограничиваясь переваренными тканями животных27, инъекционными фармацевтическими препаратами и образцами масла. Для этого исследования были использованы два прибора для спектроскопии комбинационного рассеяния света, а в инструкциях подробно описано использование прибора Horiba XploRA Plus Ramana, который собрал и обработал все данные, показанные на рисунке 4. Также важно учитывать предельный размер обнаружения для каждого рамановского микроскопа, чтобы гарантировать, что интересующие частицы могут быть соответствующим образом проанализированы с помощью размера пятна лазеров прибора. Для отображения результатов идентификации частиц с помощью Рамана можно отобразить эталонный и образцовый спектры, а также изображение анализируемой частицы, как показано на рисунках 3C и 4C.

В разделе 6 протокола подробно описаны инструкции по идентификации частиц с использованием спектральной библиотеки с открытым исходным кодом. Планаризованный захват частиц на равномерно плоской мембране, а также регулярный массив пор мембраны обеспечивают предсказуемую автоматическую визуализацию. Толщина SiN в 400 нм или 1000 нм и их состав из нитрида кремния наделяют их превосходной оптической прозрачностью, но также могут возвращать интенсивный кремниевый пик в некоторых спектроскопических параметрах инструмента. Следует соблюдать осторожность при использовании голого кремниевого кремния с неметаллическим покрытием и рамановским анализом. Пик Si может функционировать как калибровочный сигнал, но интенсивность пика может также маскировать сигналы спектров более низкой интенсивности в той же области волновых чисел, что и сигнал Si. Такие пики Si не наблюдались при использовании лазера с длиной волны 830 нм в данном исследовании.

Использованные здесь ультратонкие SiN (толщина 400 нм или 1000 нм) и Au-SiN (толщина 520 нм или 1120 нм) наделили их превосходными фильтрующими, оптическими и спектроскопическими свойствами. Тем не менее, эти мембраны должны быть защищены от физических повреждений, таких как чрезмерный перепад давления (например, ≥-206 кПа), прямое прикосновение пинцетом или пальцами или неправильное размещение прокладки. Фильтрующий диск, в котором расположены мембраны, защищает их и обеспечивает простоту использования при нормальной эксплуатации. При манипуляциях с дисками фильтра прикасайтесь только к черному наружному кольцу, а не к активной области мембраны. Хотя количественные данные здесь не приведены, сбор захваченных частиц на небольшой площади поверхности мембраны (3 x 3 мм для 20 мкм и 3 x 0,7 x 3 мм для отсечных мембран 8,0 мкм, соответственно) потенциально снижает общее время анализа образца за счет сокращения времени, необходимого для поиска и анализа интересующих частиц. Этот «коэффициент концентрации» достоин будущих исследований и может предложить уникальное преимущество фильтровальных дисков SiN для исследователей. В сочетании с более высокими нормализованными скоростями потока по площади поверхности по сравнению с другими широко используемыми мембранами для определения характеристик MP15, автоматизированные процедуры визуализации частиц, которым требуется только изображение относительно меньшей площади равномерно плоского и сфокусированного SiN, могут еще больше сократить общее время анализа. Тем не менее, любые преимущества, связанные с гипотетическим коэффициентом концентрации, все еще должны быть эмпирически продемонстрированы путем сравнения общего времени обработки (от фильтрации до анализа изображения) на обычных и кремниевых фильтрующих дисках.

Мы эвристически продемонстрировали полезность вариаций SNAP на местных пробах водопроводной воды. Описанный здесь протокол сосредоточен на улавливании МП из источников питьевой воды в окрестностях Рочестера, штат Нью-Йорк. Отбор проб проходил следующим образом: для каждого сбора проб не менее одного литра воды пропускалось через кран перед началом сбора. Новые, запечатанные полипропиленовые бутылки подносились к текущему крану и открывались непосредственно перед сбором. Бутылки не ополаскивались питьевой водой перед началом сбора. Каждый образец состоял из двух собранных флаконов объемом 500 мл, следующих друг за другом. Каждая проба воды поступала из отдельной системы бытовых труб, и материал труб не был одинаковым на протяжении всего отбора проб. Такие переменные, как количество использованной воды в последнее время, время сбора, возраст труб и возраст дома, из которого была взята проба, не могли контролироваться в этом исследовании. Это не был валидированный протокол сбора образцов. Каждый исследователь должен разработать и обосновать свои собственные процедуры сбора данных. Однако, ради полного раскрытия методов, приведенное выше описание включено. Фильтрующие диски позволяют проводить повторный анализ на одной и той же подложке для ряда аналитических методов. Не требуется подвыборки или нескольких проб, кроме стандартных пробных повторов. Устранение необходимости в субвыборке и множественных пробах повышает достоверность сбора информации о целевых показателях с низкой численностью популяции. В дополнение к возможности использования мультимодальных методов анализа, фильтрующие диски SiN имеют явное преимущество по сравнению с другими аналогичными фильтрующими материалами благодаря экономии времени и более высокой скорости фильтрации на единицу площади15.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JR и JM являются основателями и акционерами SiMPore Inc. JR является соавтором патентной заявки, позволяющей использовать фильтры из нитрида кремния, подобные тем, которые описаны в этом исследовании.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пэн Мяо из Horiba Scientific любезно поддержал эту публикацию, используя и обладая опытом своей рамановской спектроскопии XploRA Plus. Электронная микроскопия была выполнена в Интегрированном центре наносистем (URnano) Рочестерского университета. Микропроизводство проводилось в Лаборатории изготовления полупроводников и микросистем (SMFL) в Рочестерском технологическом институте.

Исследования, представленные в этой публикации, были частично поддержаны Национальным институтом наук о гигиене окружающей среды в рамках премии No. R44ES031036 в SiMPore и Центром микропластика озера Онтарио (LOMP) в рамках премии Национального института наук о гигиене окружающей среды No. P01 ES035526 и Премия Национального научного фонда No. OCE-2418255 в Рочестерский университет. Ответственность за содержание лежит исключительно на авторах и не обязательно отражает официальную точку зрения какого-либо финансирующего агентства.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 л Стеклянный стаканPyrex1000-1 л
1 л Стеклянная вакуумная колба для сбораMillipore SigmaZ290459-1EA
100% хлопок лабораторный халатLandauLA-3172
100 мл стеклянная фильтрационная воронка Advantec311000https://www.sterlitech.com/glass-filter-holder-311000.html
99% изопропиловым спиртомПрограммное обеспечение Fisher ScientificA416-20
APEX EDSEDAXEDX используется для выполнения EDX анализа захваченных частиц.
Denton Prep Sprayting SystemDenton VacuumDESK II : 293618089система нанесения золотых покрытий
FIJI, платформа анализа изображенийImageJV 1.54FFIJI (ФИДЖИ это просто ImageJ) - дистрибутив ImageJ 
Стеклянная бутылка с завинчивающейся крышкойCorning 1395-250
KimwipesKimtech06-666-11C
LabSpec6Horiba ScientificHoriba Raman программное обеспечение, содержащее ParticleFinder и ViewSharp
Ламинарный проточный колпакAirScience VLF-72A
Микроскоп Olympus  / NikonBX61 / Ti2eЛюбой микроскоп с подходящей флуоресценцией может быть использован для оптической микроскопии.
MPSN SiN фильтрыSiMPore Inc.FD25-8.0-Au; FD25-8.0-NC
FD25-20.0-Au, FD25-20.0-NC
Шприцы Monoject 60 млCoviden8881560265
порошок нильского красногоцвета TCIN0659
Нитриловые перчаткиAnsell Microflex19-167-17
OpenSpecyopenanalysis.orgОткрытый исходный код, спектральная библиотека
OvenVWR1310Gravity Конвекционная утилитарная печь
P20 ПипеткаBrandtech705872
Наконечник для пипеткиПремиальные флаконыGS 151140R
Масляная поддержка фриттыAdvantec311000Входит в комплект
Рамановский инструментHoribaXplora PLUS
Резиновая пробкаAdvantec311000Входит в комплект
SEM инструментZiessAurigaСерия Аурига, Модульная рабочая станция с поперечной балкой
Силиконовые прокладкиSiMPoreGASKET-25-RПрозрачные прокладки PDMS, толщина 0,8 мм
Силиконовый роликSanyue ( ASIN: B07XDTNPS3)Силиконовый ролик -  8 x 5 x 2 дюйма
Программное обеспечение SmartSEMZeissV8SEM, используемое для работы
с фильтрами для шприцев ZeissUlineS-7273
 Thermo ScientificCH2225-PES0.22 &микро; Шприцевые фильтры M Luer Lock, 25 мм 
Шприцевой насосNew Era Pump Systems, Inc.NE-1000Опционально, но рекомендуется
Trypan Blue - 0,4%Millipore SigmaT8154-20ML
ПинцетSiMPoreK6TWZR
Вакуумный насосWelch847-676-8800
Вакуумный трубкаГрейнджерZUSA-HT-4037
Auriga Spray Bottle

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Simon, M., Van Alst, N., Vollertsen, J. Quantification of microplastic mass and removal rates at wastewater treatment plants applying focal plane array (fpa)-based fourier transform infrared (ft-ir) imaging. Water Res. 142, 1-9 (2018).
  2. Da Costa Filho, P. A., et al. Detection and characterization of small-sized microplastics (≥ 5 µm) in milk products. Sci Rep. 11 (1), 24046(2021).
  3. Koelmans, A. A., et al. Microplastics in freshwaters and drinking water: Critical review and assessment of data quality. Water Res. 155, 410-422 (2019).
  4. Fendall, L. S., Sewell, M. A. Contributing to marine pollution by washing your face: Microplastics in facial cleansers. Mar Pollut Bull. 58 (8), 1225-1228 (2009).
  5. Kwon, J. -H., et al. Microplastics in food: A review on analytical methods and challenges. Int J Env Res Public Health. 17 (18), 6710(2020).
  6. Mahon, A. M., et al. Microplastics in sewage sludge: Effects of treatment. Environ Sci Technol. 51 (2), 810-818 (2017).
  7. Hidalgo-Ruz, V., Gutow, L., Thompson, R. C., Thiel, M. Microplastics in the marine environment: A review of the methods used for identification and quantification. Environ Sci Technol. 46 (6), 3060-3075 (2012).
  8. Ragusa, A., et al. Plasticenta: First evidence of microplastics in human placenta. Environ Int. 146, 106274(2021).
  9. Schwabl, P., et al. Detection of various microplastics in human stool. Ann Intern Med. 171 (7), 453-457 (2019).
  10. Leslie, H. A., et al. Discovery and quantification of plastic particle pollution in human blood. Environ Int. 163, 107199(2022).
  11. De Frond, H., et al. Monitoring microplastics in drinking water: An interlaboratory study to inform effective methods for quantifying and characterizing microplastics. Chemosphere. 298, 134282(2022).
  12. Nutrition and Food Safety (NFS), Standards & Scientific Advice on Food Nutrition (SSA). Dietary and inhalation exposure to nano-and microplastic particles and potential implications for human health. , https://www.who.int/publications/i/item/9789240054608 (2022).
  13. Fries, E., et al. Identification of polymer types and additives in marine microplastic particles using pyrolysis-GC/MC and scanning electron microscopy. Environ Sci: Processes Impacts. 15 (10), 1949-1956 (2013).
  14. Primpke, S., et al. Critical assessment of analytical methods for the harmonized and cost-efficient analysis of microplastics. Appl Spectrosc. 74 (9), 1012-1047 (2020).
  15. Carter, J., et al. Comparative evaluation of filtration and imaging properties of analytical filters for microplastic capture and analysis. Chemosphere. 332, 138811(2023).
  16. Van Mourik, L., et al. STOTEN's minimum requirements for measurement of plastics in environmental samples. Sci Total Environ. 912, 168465(2024).
  17. Käppler, A., et al. Analysis of environmental microplastics by vibrational microspectroscopy: FTIR, Raman or both. Anal Bioanal Chem. 408, 8377-8391 (2016).
  18. Mikoliunaite, L., et al. The substrate matters in the Raman spectroscopy analysis of cells. Sci Rep. 5 (1), 13150(2015).
  19. Madejski, G. R., et al. Silicon nanomembrane filtration and imaging for the evaluation of microplastic entrainment along a municipal water delivery route. Sustainability. 12 (24), 10655(2020).
  20. Romanick, S. S., et al. Assessment of household settled dust via silicon nanomembrane analysis pipeline (SNAP). Environ Technol Innov. 38, 104106(2024).
  21. Cowger, W., et al. Microplastic spectral classification needs an open source community: Open specy to the rescue. Anal Chem. 93 (21), 7543-7548 (2021).
  22. Kooi, M., Koelmans, A. A. Simplifying microplastic via continuous probability distributions for size, shape, and density. Env Sci Technol Lett. 6 (9), 511-564 (2019).
  23. SpectraBase. , John Wiley & Sons, Inc. SpectraBase. https://spectrabase.com/spectrum/1uoQJ4M5hxj (2025).
  24. Erni-Cassola, G., Gibson, M. I., Thompson, R. C., Christie-Oleza, J. A. Lost but found with nile red: A novel method for detecting and quantifying small microplastics (1 mm to 20 µm) in environmental samples. Environ Sci Technol. 51 (23), 13641-13648 (2017).
  25. Shim, W. J., Song, Y. K., Hong, S. H., Jang, M. Identification and quantification of microplastics using Nile Red staining. Mar Pollut Bull. 113 (1-2), 469-476 (2016).
  26. Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: A selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).
  27. Cai, B., Andino, F. D. J., Mcgrath, J. L., Romanick, S. S., Robert, J. Ingestion of polyethylene terephthalate microplastic water contaminants by Xenopus laevis tadpoles negatively affects their resistance to ranavirus infection and antiviral immunity. Environ Pollut. 356, 124340(2024).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microplastics AnalysisDrinking Water MicroplasticsSilicon NanomembraneMultimodal Particle AnalysisRaman SpectroscopyScanning Electron MicroscopyEnergy Dispersive X RayNile Red StainingParticle QuantificationSample Preparation

Related Articles