Методическая статья

Новая модель островков для 3D-исследования взаимодействия эндотелиальных и β клеток: значение для скрининга цитопротекторных агентов

DOI:

10.3791/68220

⸱

17 апреля 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Regenerative Nanomedicine (RNM), UMR 1260, INSERM (French National Institute of Health and Medical Research), University of Strasbourg, 2Department of Emergency, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, 3Research Center, CHU de Québec -Laval University, 4Department of Microbiology-Infectiology and Immunology, Faculty of Medicine, Laval University, 5Department of Diabetes and Nutrition Endocrinology, University Hospital of Strasbourg, 6Faculty of Medicine, University of Strasbourg, 7Faculty of Pharmacy, University of Strasbourg

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол предусматривает подробную процедуру создания стабильных сфероидов островков поджелудочной железы мышей, а также подробные методы 3D-окрашивания, очистки и монтажа, адаптированные к их небольшому размеру.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает оптимизированный метод получения малых стабильных сфероидов, их культуры и 3D-визуализации для изучения взаимодействия эндотелиальных и инсулинообразующих β клеток в 3D-модели островков поджелудочной железы. Сфероиды размером 150–200 мкм, отражающие минимальный диапазон размеров островков, были получены из выбранного соотношения, объединяющего 1 внутриостровочные эндотелиальные клетки (клетки MS-1) и 20 клеток, выделяющих инсулин (β-TC-6). Детализированы задачи окрашивания, очистки и установки малых сфероидов и их борьбы с использованием агарозы с низкой температурой плавления и техники CUBIC очистки, а также ключевые моменты для эффективного анализа 3D-структуры с использованием различных зондов. Данные показывают, что NTPDASE-эктонуклеотидаза 3 не колокализируется с инсулином в сфероидной модели, что указывает на разные уровни зрелости и функциональные уровни β-TC6, а также что полную процедуру можно применить к изолированным островкам поджелудочной железы с чётким исследованием внутриостровочных сосудов. Эти результаты подчёркивают эффективность протокола 3D-визуализации в выявлении сложной организации клеток поджелудочной железы и взаимодействия внутри модели островков.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Трансплантация островков поджелудочной железы часто осложняется мгновенной воспалительной реакцией, опосредованной кровью (IBMIR), которая значительно повреждает внутриостровочные эндотелиальные клетки (IEC) и влияет на перфузию и функцию трансплантата. В долгосрочной перспективе у пациентов через 4 года после трансплантации описывается уменьшение массы функциональных островков и потеря независимости инсулина. Хотя были разработаны модели трансплантации островков у мышей или крыс, стандартизированные модели для изучения фармакологических мишеней для предварительной подготовки островков, особенно актуальные в контексте повреждения трансплантата, вызванных цитокином, вызванного IBMIR,отсутствуют 2. Действительно, сфероидная конструкция особенно подходит для выявления новых фармакологических мишеней и оценки цитопротекторных молекул против дисфункции клеток, вызванной цитокином. Кроме того, он предлагает альтернативный подход к ограничению использования животных моделей сахарного диабета 1 типа и трансплантации островков.

Поиск подходящих условий для окрашивания, оптической очистки и монтажа для небольших сфероидов размером с островок остаётся сложным. В литературе очень немногие исследования описывают обращение с малыми сфероидами и их ключевые структурные характеристики. Сложность также связана с необходимостью балансировать проникновение тканей, сохранение сигнала и структурную целостность при сохранении хрупкости этих миниатюрных 3D-клеточных структур. Кроме того, традиционные методы окрашивания часто испытывают трудности с единообразной маркировкой сфероидов. Эта проблема усугубляется плотной организацией клеток, которая может затруднять диффузию реагентов из-за ограниченного проникновения антител икрасителей 3,4. Наконец, процесс оптической очистки, ключевой для уменьшения фона рассеяния света и улучшения глубины изображения, должен быть тщательно оптимизирован, чтобы избежать нарушения структуры сфероида или изменения биологических свойств5.

Установка небольших сфероидов для 3D-микроскопии представляет собой ещё одну задачу. Традиционные монтажные носители могут не обеспечивать достаточной поддержки этих хрупких конструкций, что может привести к их деформации или разрушению во время визуализации. Кроме того, необходимо точно контролировать сопоставление показателей преломления для оптимального качества изображения для обеспечения точной визуализации на всей глубинесфероида 6,7. Разработка протоколов, адаптированных к малым сфероидам, дополнительно осложняется разнообразием типов клеток и экспериментальных условий, используемых в сфероидныхкультурах 3. Наконец, необходимость специализированных подходов для поддержания целостности нескольких популяций клеток на протяжении процессов окрашивания и очистки критически важна для оценки реакции клеток.

Для решения конкретных задач изучения стресса островков, опосредованного IBMIR, была разработана сфера-модель из 2000 клеток, сочетающая мышиный IEC и инсулин, выделяющие β клетки, с соотношением IEC к β клеток 1:20, аналогичным наблюдаемому на островке поджелудочной железы. Кроме того, предыдущие эксперименты показали, что структура сохраняет жизнеспособность в течение 96 часов, обеспечивая физиологически значимую 3D-модель для наблюдения коротких (часовых интервалов) или более длинных стресс-индуцированных ответов (дней) и их фармакологической модуляции. Сфероидная модель состоит из мышиных эндотелиальных клеток MS-1 внутриостровковых, характеристик микроваскулярной системы островка и конститутивного инсулина, секретирующего β клеток, β-TC-68. Он был разработан так, чтобы точно имитировать минимальный диапазон размеров островков поджелудочной железы (диаметр 50–200 мкм) и их средний номерячеек 9.

Сообщается о новой методологии сбора и окрашивания, специально оптимизированной для работы с малыми сфероидами (диаметром 150–200 мкм), обеспечивающей оптимальное проникновение флуоресцентных красителей и антител по всей структуре сфероидов и минимальному фону. Протокол включает монтажную процедуру с использованием агарозы с низкой температурой плавления (LMPA) для обеспечения мягкой структурной поддержки хрупких сфероидов при оптимальном сопоставлении показателей преломления. LMPA — это модифицированная форма агарозы с пониженным гелированием (около 27 °C) и температурой плавления (около 65 °C), которая сохраняет целостность образца при вложении и создаёт оптически чистую матрицу с минимальной автофлуоресценцией 4,6. Наконец, для оптического очищения применяется метод прозрачного непрепятственного изображения мозга/тела и вычислительного анализа (CUBIC)10, чтобы обеспечить максимальную визуализацию внутренних структур и сохранение целостности деликатных взаимодействий междуклетками и клетками 5,6,10.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Использование человеческой поджелудочной ткани и всех экспериментальных протоколов было одобрено Министерством высшего образования и исследований правительства Франции (Генеральное управление по исследованиям и инновациям, Биоэтическое подразделение) и зарегистрировано под номером DC-2019-3439. Информированное согласие было получено от законных опекунов всех субъектов.

1. Подготовка сфероидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Мышиная линия IEC MS-1 и мышиная β-поджелудочная β-TC6 были культивированы одновременно для получения достаточного количества клеток для сфероидной культуры. MS-1 был культивирован в колбах с клеточными адгезентами T75 в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы, содержащей 4,5 г/л глюкозы, с 5% плодовой сывороткой крупного рогатого рогатого скота и 1% пенициллина/стрептомицина во влажной атмосфере при 37 °C. Пассажи проводились на конфлюэнции (2 дня культуры) после удаления с использованием трипсина EDTA 1x и трёх промывок в растворе Hank Balanced (HBSS). β-TC6 были культивированы в T75 для сложных клеток в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы, содержащей 4,5 г/л глюкозы, с 15% плодовой сыворотки крупного рогатого скота и 1% пенициллина/стрептомицина во влажной атмосфере при 37 °C. Пассажи проводились на β-TC6 (10-дневная культура) после отслоения трипсином EDTA 1 раз и 3 промывания в растворе Hank Balanced (HBSS).

  1. Приготовьте тарелку для сфероидной культуры
  2. Промыйте пластину 500 мкл раствора против прилипки, предоставленного производителем, чтобы предотвратить адгезию клеток и способствовать формированию сфероидов.
  3. Центрифугуйте пластину при 1300 x g в течение 5 минут в подвижном роторе с держателями для пластин при комнатной температуре.
  4. Осмотрите пластину под световым микроскопом, чтобы убедиться, что в микроколодцах не осталось пузырей. Если да, центрифугуйте второй раз при 1 300 x g в течение 5 минут.
  5. Отбросьте анти-адхеренционное промывание и помойте колодец 3 раза 1 мл тёплого HBSS.
  6. Отбросьте HBSS и замените на 500 мкл тёплой сфероидной среды: ДМЭМ с высоким содержанием глюкозы 4,5 г/л, 10% плодовой сыворотки крупного рогатого скота и 1% пенициллина/стрептомицина.
  7. Держите пластину при температуре 37 °C во влажной атмосфере, готовя сфероидную подвеску.
  8. Инкубировать MS-1 и β-TC6 одновременно с раствором трипсина и считать живые клетки каждой линии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При посеве сфероиды формируются с использованием соотношения 1 IEC к 20 β клеток, характерного для островков поджелудочной железы. Используйте пластину для сфероидной культуры на 24 ямы, каждая из которых содержит 300 микроскважин, которые могут содержать один сфероид, состоящий из 2000 клеток, всего 600 000 клеток на скважину. В настоящем исследовании измерения выявили идентичные сфероидные объёмы, занятые выбранными линиями клеток β-TC6 и MS1 после 48-часовой сфероидной культуры.
  9. Смешайте две клеточные линии так, чтобы соотношение соответствовало 1 к 20 для 24 скважин, а затем подвесьте их в 24 мл сфероидной среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте пипетку объёмом 10 мл или 25 мл в движении всасывание-поток для гомогенизации подвески.
  10. Пипетка 1 мл для каждой скважины и продолжайте всасывание-поток для равномерного распределения суспензии ячейки в скважине.
  11. Центрифугуйте пластину при 130 x g в течение 5 минут в подвижном роторе с держателями для пластин при комнатной температуре.
  12. Осмотрите пластину под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки равномерно распределены между микроколодцами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этого этапа центрифугирования используйте высокие скорости ускорения и замедления (70%–90% масштабов ускорения и замедления), иначе сгустки клеток сместятся в сторону микроямы.
  13. Инкубировать тарелку при 37 °C, 5%CO2.
  14. Отслеживайте формирование и рост сфероидов с помощью светового микроскопа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: сфероиды β-TC6 / MS-1 должны начать формироваться через 24 часа культуры, приобретая форму сферы через 48 часов. Жизнеспособность можно контролировать с помощью трипан-синего после нарушения сфероидов трипсином в дублированных образцах, и поддерживалась в течение 96 часов (80%–90%).

2. Сбор и окрашивание сфероидов

  1. Аккуратно подвесьте сфероиды пипеткой P1000 в их среде.
  2. Выбросить сфероиды в небольшие объёмы в 15 мл Falcon и центрифугировать при 130 x g в течение 5 минут при комнатной температуре
  3. Аккуратно аспирируйте среду, избегая гранулы с сфероидами.
  4. Промыйте гранулу дважды 2 мл HBSS, аккуратно, чтобы избежать диссоциации сфероидов, и центрифугуйте при 130 х г в течение 5 минут.
  5. Под химическим капюшоном сбросьте HBSS и подвесьте сфероиды в 1 мл раствора 4% PFA на ночь при 4 °C для фиксации.
  6. Центрифугуйте трубку при 130 x g в течение 5 минут, сбросьте 4% раствор PFA и промойте три раза 2 мл 1x PBS (приготовленной в лабораторной ультрачистой воде).
  7. Повторная подвеска в 2,5 мл HBSS.
  8. Введите сфероидную суспензию в пластину с 6 ячелинами.
  9. Под бинокулярной лупой вручную выберите 20–30 сфероидов с пипеткой P200 и поместите их в трубку объёмом 1,5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая трубка объёмом 1,5 мл — это состояние окрашивания, содержащее от 20 до 30 сфероидов. Менее 20 собранных сфероидов их становится трудно увидеть, когда их потом снова подвесят.
  10. Уравновесьте объёмы трубок по 1,5 мл и центрифугуйте при 800 х г в течение 5 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента все этапы аспирации раствора выполняются с помощью увеличительного стекла. При искусственном свете очень трудно видеть сфероиды. Всегда выполняйте следующие шаги днём, держа трубки против дневного света. Все растворы аспирированы с наконечником P1000 сверху с наконечником P10 на конце.
  11. Удалите как можно больше HBSS, не подвешивая сфероиды повторно.
  12. Суспензировать сфероиды в 400 мкл раствора закалки (0,5 М глицина в 1x PBS (pH 7-7,4)), чтобы избежать будущих фоновых шумов, вызванных оставшимися альдегидами после фиксации PFA. Инкубировать при 37 °C в течение 2 часов.
  13. Центрифугите при 800 г на 5 минут и пипеткой отключите раствор для закалки.
  14. Ресуспендировать в 400 мкл буфера проникновения (0,2% тритон X-100, 0,3 млн глицин, 20% DMSO в 1x PBS). Это поможет улучшить проникновение антител и ядерных зондов. Инкубировать при 37 °C в течение 2 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С этого этапа сфероиды оседают сами по себе и больше не цепляются за стенку трубы. Центрифугирование больше не требуется, если объёмы аккуратно аспирированы без нарушения сфероидной гранулы. При необходимости центрифугуйте при 800 x g в течение 5 минут.
  15. Сбросьте буфер проникновения и инкубуйте в 400 мкл блокирующего буфера (0,2% Triton X-100, 1% BSA, 10% DMSO, 5% сыворотки Goat в 1x PBS) на ночь при 37 °C.
  16. Сбросьте блокирующий буфер и инкубируем на ночь при 37 °C в 300 мкл первичного раствора антител (0,2% Tween 20, 1% BSA, 5% DMSO, 5% козьей сыворотки в 1x PBS).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используемые первичные антитела: анти-CD31 (конечная концентрация 2,2 мкг/мл), антиинтегрин β1 (1,43 мкг/мл), антиинсулин (0,66 мкг/мл) и противомышиная NTPDase311 (разбавление 1:1000) (см. таблицу материалов). Контрольные IgG соответствующих идентичных изотипов должны быть валидированы на той же структуре для определения положительной маркировки с помощью флуоресцентной микроскопии.
  17. Сбросьте первичный раствор антител и помойте 3 раза с помощью 400 мкл буфера для стирки (0,2% Tween 20, 1% BSA в 1x PBS). Встряхивайте 5 минут между стирками.
  18. Инкубировать 300 мкл вторичного раствора антител (DAPI (2 мкг/мл), 0,2% Tween 20, 1% BSA, 5% DMSO, 5% козьей сыворотки в 1x PBS) при 37 °C. Защитите трубки алюминиевой фольгой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: DAPI всегда следует добавлять к условиям окрашивания, так как это облегчает поиск сфероидов при микроскопии и помогает не отбеливать разные флуорофоры и красители. Все вторичные антитела имеют конечную концентрацию 2 мкг/мл (см. Таблицу материалов).
  19. Сбросьте вторичный раствор антител и промывайте 3 раза с помощью 400 мкл второго буфера для стирки: 0,2% от 20, 1% BSA в 1x PBS. Оставьте последнюю стирку и храните трубки при 37 °C до установки в тот же день.

3. Подготовка раствора

  1. Подготовка раствора для оптического клиринга
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптическое очищающее решение выполнено по процедуре CUBIC10 и было подготовлено в соответствии с предложением Гунасингха идр. 4. Пропорции компонентов указываются в процентах от веса конечного раствора (w/w), поскольку этилендиамин Quadrol/N,N,N′,N′-Tetrakis(2-гидроксипропил) слишком вязкий для пипетки и требует взвешивания.
    1. В стеклянной бутылке весит 9% (ч/ч) этилендиамина N,N,N′,N′-tetrakis(2-гидроксипропил) этилендиамина, 22% (ч/б) мочевины, 44% сахарозы, 0,1% (ч/ш) Triton X-100 и 24,9% лабораторной ультрачистой воды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для очистки пластины с 24 лунками требуется около 60 г раствора.
    2. Добавьте магнитную планку, адаптированную под диаметр бутылки.
    3. Нагрейте и перемешайте раствор до 56 °C. Держите стеклянную бутылку с водой на той же тарелке, чтобы отслеживать повышение температуры.
    4. Контролируйте скорость перемешивания, чтобы поддерживать ровный жидкий вихрь, и перемешивайте раствор, пока все соединения полностью не растворятся. Раствор должен быть полностью жидким и прозрачным. Это может занять до 1 часа.
    5. Держите при комнатной температуре, защищайте от света.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очищающий раствор должен быть приготовлен не менее чем за 24 часа до оптической очистки, чтобы раствор мог дегазироваться и устранить возможные пузырьки. Чтобы избежать появления пузырей, больше никогда не встряхивайте раствор. Никогда не храните в холодильнике.
  2. 2% подготовка раствора LMPA
    1. Взвесьте 0,5 г LMPA на прецизионном весах и поместите её в колбу Erlenmeyer на 100 мл.
      ВНИМАНИЕ: Не принимайте меньший объём Erlenmeyer, так как есть риск ожогов при переполнении.
    2. Растворить в 25 мл 1x PBS при комнатной температуре.
    3. Тщательно добавьте порошок в 1x PBS, аккуратно перемешав термос Эрленмайера.
      ВНИМАНИЕ: На следующем этапе важно использовать защитные средства: перчатки и маску для глаз и лица, чтобы защититься от брызг и ожогов.
    4. Нагрейте колбу Эрленмайера в микроволновке.
    5. Наблюдайте, когда раствор начинает кипеть (в жидкости есть пузырьки), и снимите его сразу до того, как он закипит.
    6. Аккуратно перемешайте Эрленмайер, чтобы вмешать порошок.
      ВНИМАНИЕ: Не перемешивайте слишком сильно, иначе жидкость может переполниться/перекипеть и разбрызгиваться.
    7. Вернуть Erlenmeyer в микроволновку, повторить до полного растворения LMPA.
    8. Удалите Erlenmeyer и, до того как LMPA затвердеет, быстро аликвотируйте 1 мл раствора 2% LMPA в трубки объемом 1,5 мл. Храните при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс занимает много времени. Заранее подготовьте раствор и храните его для последующего использования.

4. Монтаж и оптическая очистка

  1. Предварительно разогрейте центрифугу до 40 °C, запустите длинный цикл для подготовки пластины образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гели LMPA принимаются при 30 °C. Не пускайте центрифугу ниже 40 °C. Если центрифуга позволяет, увеличьте до 50 °C.
  2. Сжиженные аликвоты 2% LMPA в водяной бане или трубчатом обогревателе при 70 °C в течение 5–10 минут.
  3. Снизить и поддерживать температуру 2% LMPA на уровне 55 °C.
  4. Аккуратно положите фотопластину на нагреватель пластины, предварительно нагретый до 50 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не сломать и не поцарапать хрупкий полимер, используемый в качестве основы для скважин.
  5. Будьте осторожны, чтобы пластина была горячей перед добавлением 2% LMPA. На этом этапе всё не должно сложиться.
  6. Pipette 200 мкл 2% LMPA в каждую скважину. Покройте всю днище опоры, чтобы получить первую жидкую основу, которая позволит более плавное распределение сфероидов.
  7. Сбросьте промывочный буфер из трубок, снова подвесьте сфероиды в 300 мкл 2% LMPA и пипетить их прямо в колодцу. Всегда делайте мягкую подвеску, чтобы избежать пузырей.
  8. Накройте пластину алюминиевой фольгой для защиты флуорофоров.
  9. Быстро взвесьте пластину без алюминиевой фольги и верните её в подогреватель.
  10. Приготовьте тарелку на 24 колодца, добавьте воду для уравновешения.
  11. Быстро снимите пластину с алюминиевой фольгой из нагревателя, чтобы защитить флуорофоры, связанные с вторичными антителами. Держите в руках, не ставьте на холодную поверхность.
  12. Снимите алюминиевую фольгу и поместите её в центрифугу пластины.
  13. Центрифуга при 1000 x g в течение 15 минут при 40 °C. Проверьте температуру ротора, он должен быть комнатной.
  14. Во время центрифугирования подготовьте поддон для льда: сплющите лёд, чтобы тарелка могла быть размещена на ровной поверхности.
  15. Снимите тарелку и положите её на лёд, накрыв противень или тарелку алюминиевой фольгой. Оставьте тарелку на льду на 10 минут.
  16. Снимите пластину из льда и оставьте её в алюминии, чтобы она стабилизировалась при комнатной температуре на 20 минут.
  17. Нанесите 1–1,5 мл очистительного раствора на каждую скважину, накройте алюминиевой фольгой и оставьте на оптическую очистку при комнатной температуре, защищённую от света, не менее 48 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Никогда не храните тарелку при 4 °C. LMPA может сжаться, отсоединиться от дна скважины и всплыть в растворе очистки. Изображение сделано в течение недели после очистки.

5. Визуализация

  1. Используйте конфокальный вращающийся дисковый микроскоп, выберите (минимум) объектив 30x.
  2. Оставьте растворы для очищения, так как они унификируют показатели преломления и облегчают 3D-съёмку.
  3. Найдите сфероиды, выбрав канал DAPI, чтобы избежать обесцвечивания других флуорофоров.
  4. Получайте изображения с помощью функции Z-стека. Выберите верхнюю и нижнюю части сфероида и разместите оптические срезы на расстоянии 10 мкм друг от друга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Получение изображений и анализ изображений проводились на платформе визуализации CRBS, PIC-STRA UMS 38, Inserm, Unistra.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для оценки эффективности маркировки и оптической очистки несколько моделей подвергались тому же протоколу и впоследствии фиксировались (см. рисунок 1). Сфероиды с соотношением 1 IEC к 20 β-клеткам и 1 IEC к 50 β-клеткам культивировались по описанному выше методу. Стоит отметить, что соотношение 1 IEC к 20 β-клеток приблизительно соответствует соотношению человеческого островка поджелудочной железы. Использование трипанового синего цвета для окрашивания наруш...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Была разработана сфероидная модель, включающая мышиный МС-1 IEC и мышиные β клетки β-TC6, имитирующая трёхмерную структуру островков поджелудочной железы. Эта модель подходит для анализа стресс-индуцированной дисфункции IEC в течение 72 часов и её влияния на жизнеспособность и функцию β клеток, что имеет отношение к исследованиям трансплантации островков. Важно, что сфероид, состоящий из мышиных клеток, был однородным по своей природе и имел соответствующую внутриостровковую эндотелиальн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарны Паскалю Кесслеру из платформы визуализации PICSTRA за экспертную помощь в области вращающейся дисковой микроскопии и извлечении исходных данных маркировки из стека Z. Авторы хотят отметить добрый дар — очищенные человеческие островки доктора В. Битигера, доктора А. Ланглуа и доктора К. Бузакри из Европейского центра изучения диабета (CEED, Страсбург, Франция)

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
µ-пластина 24 колодца, Black ID 14 mm ИБИДИ82426
AggreWell 800 (24 скважины)StemCell34815
Раствор для промывания против прилизания StemCell7010
Анти-CD31 антитела [P2B1]Abcamab24590Итоговая концентрация 2.2µ g/mL
Анти-Интегрин и бета; 1 Антитело, клон MB1.2MerckMAB1997 Итоговая концентрация 1.43µ g/mL
Колба для клеточной культуры, T-75, поверхностная, поверхностная  : Cell+, фильтрьная крышкаСарштедт83.3911.302β-культура TC6
Термос для клеточной культуры, T-75, поверхность: стандартная, двухпозиционная винтовая крышкаСарштедт83.3911.02Культура MS-1
DAPI дигидрохлоридТермофишер,D1306Итоговая концентрация 2& микро; g/mL
Диметилсульфоксид  SigmaD8418-250ML
DMEM, высокий уровень глюкозы, GlutaMAX и trade; Добавка — пируватThermofischer scientific31966047
Дулаглутид
ДулаглутидЛиллиTrulicity ручка 1,5 мг
Сыворотка плода для быкаBiowestS1810-500
ГлицинSigmaG7126-1KG
Козий анти-подопытный IgG (H+L) высокоадсорбированный вторичный антител, Alexa Fluor&Trade; 555ТермофишерA21435Итоговая концентрация 2& микро; g/mL
козий антимышиный антител IgG (H+L) с сильной перекрестной адсорбцией, Alexa Fluor&Trade; 488Термофишер  A-11029Итоговая концентрация 2& микро; g/mL
Козий антикроличий антител IgG (H+L) — высокоадсорбируемое вторичное антитело, Alexa Fluor&Trade; 633ТермофишерA-21071Итоговая концентрация 2& микро; g/mL
Козье противокрысиное IgG (H+L) перекрёстно адсорбированное вторичное антитело, Alexa Fluor&Trade; 555ТермофишерA21434Итоговая концентрация 2& микро; g/mL
Козья сывороткаSigmaS26-100ML
HBSS без кальция и магний и bbsp; & Фенол РедКорнинг21-022-CV
Инсулин (C27C9) Rabbit mAbКлеточная сигнализация3014SИтоговая концентрация 0,66& микро; g/mL
Изолированный человеческий поджелудочный островок Центр Европы и Острого Центра; en d'Etude du Diabete (CeeD)Добрый подарок от доктора Карима Бузакри. Клиническая степень, изолированная согласно рекомендациям.
Агароза при низкой температуре гелированияMerckA9414-10G
Ячейки MS-1ATCCCRL-2279
Параформальдегидный раствор, 4% в PBS 1xFischer scientific15670799
PBS 10xEuromedexET330-AРазбавлены 1 раз в лабораторной ультрачистой воде
Пенициллин-стрептомицинPAN BiotechP06-07100
Антитела NTPDase3 у поликлональных морских кроликов против мышиных NTPDase3  mN3-1CI4; mN3-2C(I4,I5); mN3-3C(I4,I5) https://ectonucleotidases-ab.com/Antibodies.phpРазбавление 1:1000
Квадрол/N,N,N′,N′-Тетракис(2-гидроксипропил), этилендиамин Sigma122262-1L
Вращающийся диск Olympus IXplore SPIN Olympus Scientific Solutions
Сахароза для молекулярной биологииSigmaS0389-1KG 
Triton X-100 Bioquality Laboratory GradeEuromedex2000-A
Трипсин/ЭДТА (10 раз)PAN BiotechP10-025100
Tween-20Euromedex//
МочевинаSigmaU-5128
β-TC6-клеткиATCCCRL-11506

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Langlois, A., Pinget, M., Kessler, L., Bouzakri, K. Islet transplantation: Current limitations and challenges for successful outcomes. Cells. 13 (21), 1783(2024).
  2. Li, X., Meng, Q., Zhang, L. The fate of allogeneic pancreatic islets following intraportal transplantation: Challenges and solutions. J Immunol Res. 2018, 1-13 (2018).
  3. Nürnberg, E., et al. Routine optical clearing of 3D-cell cultures: Simplicity forward. Front Mol Biosci. 7, 20(2020).
  4. Gunasingh, G., Browning, A. P., Haass, N. K. Rapid optical clearing for semi-high-throughput analysis of tumor spheroids. J Vis Exp. 2022 (186), e64103(2022).
  5. Paysan, J. The art of tissue clearing. , John Wiley & Sons Ltd. West Sussex. (2021).
  6. Costa, E. C., Silva, D. N., Moreira, A. F., Correia, I. J. Optical clearing methods: An overview of the techniques used for the imaging of 3D spheroids. Biotechnol Bioeng. 116 (10), 2742-2763 (2019).
  7. Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), dev199369(2021).
  8. Poitout, V., et al. Morphological and functional characterization of βTC-6 cells: An insulin-secreting cell line derived from transgenic mice. Diabetes. 44 (3), 306-313 (1995).
  9. Ionescu-Tirgoviste, C., et al. A 3D map of the islet routes throughout the healthy human pancreas. Sci Rep. 5 (1), 14634(2015).
  10. Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).
  11. Munkonda, M. N., et al. Characterization of a monoclonal antibody as the first specific inhibitor of human NTP diphosphohydrolase-3: partial characterization of the inhibitory epitope and potential applications. FEBS J. 276 (2), 479-496 (2009).
  12. Sbat, N. Study of the endothelial-to-mesenchymal transition of intra-islet endothelial cells in mice and its pharmacological modulation: Relevance for pancreatic islet transplantation. , Université Paris Cité. https://theses.hal.science/tel-03873595 (2021).
  13. Barillaro, M., Schuurman, M., Wang, R. β1-integrin: A key player in controlling pancreatic beta-cell insulin secretion via interplay with SNARE proteins. Endocrinology. 164 (1), bqac179(2023).
  14. Lavoie, E. G., et al. Identification of the ectonucleotidases expressed in mouse, rat, and human Langerhans islets: potential role of NTPDase3 in insulin secretion. Am J Physiol Endocrinol Metab. 299 (4), E647-E656 (2010).
  15. Giuliani, A. L., Sarti, A. C., Di Virgilio, F. Ectonucleotidases in acute and chronic inflammation. Front Pharmacol. 11, 619458(2021).
  16. Saunders, D. C., et al. Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase-3 antibody targets adult human pancreatic β cells for in vitro and in vivo analysis. Cell Metab. 29 (3), 745-754.e4 (2019).
  17. Syed, S. K., et al. Ectonucleotidase NTPDase3 is abundant in pancreatic β-cells and regulates glucose-induced insulin secretion. Am J Physiol Endocrinol Metab. 305 (10), E1319-E1326 (2013).
  18. Cheng, K., et al. High passage MIN6 cells have impaired insulin secretion with impaired glucose and lipid oxidation. PLoS One. 7 (7), e40868(2012).
  19. Rane, T. D., Armani, A. M. Two-photon microscopy analysis of gold nanoparticle uptake in 3D cell spheroids. PLoS One. 11 (12), e0167548(2016).
  20. Alzeeb, G., et al. Gastric cancer multicellular spheroid analysis by two-photon microscopy. Biomed Opt Express. 13 (5), 3120(2022).
  21. Diosdi, A., et al. Single-cell light-sheet fluorescence 3D images of tumour-stroma spheroid multicultures. Sci Data. 12 (1), 492(2025).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

3DCUBIC

Похожие статьи