Методическая статья

Идентификация видов микобактерий методом ДНК-микрочипов

DOI:

10.3791/68234

⸱

24 июня 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1Quanzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной работе мы представляем метод чипа ДНК-микрочипа для идентификации видов Mycobacterium , который повысит точность диагностики и эффективность связанных заболеваний для клинического использования.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании представлен метод чипа ДНК-микрочипа, предназначенный для точной идентификации видов Mycobacterium . Используя принципы асимметричной ПЦР-амплификации и гибридизации, этот метод нацелен на 17 распространенных микобактерий, в том числе входящих в комплекс Mycobacterium tuberculosis и различные нетуберкулезные микобактерии. Он применим к широкому спектру клинических образцов, таких как мокрота, гной, жидкость бронхоальвеолярного лаважа, спинномозговая жидкость и пункционная жидкость от пациентов с подозрением на микобактериальные заболевания. Анализ включает в себя амплификацию целевых последовательностей в геноме Mycobacterium с помощью асимметричной ПЦР с последующей гибридизацией с зондами на микрочипе. Уникальная компоновка зондов (повторяется 5 раз в микрочипе с 12 строками x 10 колонками) и использование контрольных щупов повышают его надежность. Клинические испытания с 1724 образцами показали высокую производительность. Метод достиг 100% клинической специфичности, чувствительности и общего соответствия по сравнению с результатами секвенирования, за исключением двух редких образцов нетуберкулезных микобактерий, выходящих за рамки его обнаружения. Этот метод чипа ДНК-микрочипа предлагает значительное улучшение по сравнению с традиционными методами диагностики, сокращая время диагностики и обеспечивая более полное обнаружение, тем самым имея большой потенциал в диагностике и лечении микобактериальных заболеваний.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микобактерии, род бактерий, включает в себя разнообразную группу организмов, имеющих значительные последствия для здоровья человека и животных. Микобактерии туберкулеза, возбудители туберкулеза (ТБ), уже давно являются глобальным бедствием. Несмотря на десятилетия усилий по профилактике и лечению, туберкулез остается серьезной угрозой общественному здравоохранению, являясь причиной ошеломляющего числа ежегодных смертей и новыхинфекций во всем мире1,2. Нетуберкулезные микобактерии (НТМ) также все чаще признаются важными патогенами, особенно в определенных группах пациентов и условиях окружающей среды.

Точная идентификация видов Mycobacterium является краеугольным камнем эффективного лечения болезни 3,4. Традиционные методы диагностики имеют присущие им ограничения. Методы, основанные на культуре, на которые исторически полагались, печально известны своей трудоемкостью. Процесс выделения и культивирования микобактерий может занять от нескольких недель до нескольких месяцев, в течение которых у пациентов может наблюдаться прогрессирование заболевания и потенциальная передача другим людям. Кроме того, некоторые виды микобактерий чрезвычайно трудно культивировать, что приводит к ложноотрицательным результатам и запоздалому или неправильному лечению 5,6.

Кислотоустойчивое окрашивание, еще один часто используемый метод, может идентифицировать микобактерии на основе их уникальных свойств клеточной стенки, устойчивых к обесцвечиванию. Тем не менее, ему не хватает специфичности для различения различных видов Mycobacterium, что дает лишь общее указание на присутствие микобактерий7. Молекулярные методы, такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР), появились в качестве альтернативы для преодоления некоторых из этих недостатков. ПЦР может обнаруживать ДНК микобактерий быстрее, чем методы культивирования, что позволяет быстрее поставить диагноз. Тем не менее, обычные ПЦР-анализы обычно нацелены на ограниченное число генов и могут не обеспечивать всестороннюю идентификацию видов, особенно когда речь идет о близкородственных видах Mycobacterium5.

Технология ДНК-микрочипов произвела революцию в области микробиологии и диагностики. Он предлагает возможность одновременного анализа нескольких генетических мишеней, обеспечивая более полное и подробное представление о микробной популяции8,9. Недавние исследования в этой области еще больше пролили свет на потенциал и важность передовых молекулярных методов для идентификации Mycobacterium. Например, исследование Wang et al.10 продемонстрировало повышенную чувствительность и специфичность модифицированного чипа ДНК-микрочипа в обнаружении редких видов Mycobacterium в клинических условиях. Их выводы подчеркнули ценность непрерывной оптимизации технологии микрочипов. Другое исследование Ванга и его коллегбылопосвящено интеграции данных ДНК-микрочипов с клиническими исходами у пациентов с туберкулезом. Полученные результаты позволили получить представление о прогностической ценности точной идентификации видов Mycobacterium и потенциале персонализированной медицины.

Принцип тестирования
В этом наборе используется технология чипа ДНК-микрочипа в сочетании с принципами амплификации и гибридизации асимметричной полимеразной цепной реакции (ПЦР) для идентификации видов Mycobacterium . В набор входит чип для идентификации видов Mycobacterium и асимметричные реагенты для амплификации ПЦР. Чип фиксируется видоспецифичными зондами для обнаружения и идентификации видов Mycobacterium . Мишени для обнаружения включают 17 клинически распространенных видов или групп, таких как комплекс Mycobacterium tuberculosis , Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium avium, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium flavescens, Mycobacterium terrae, Mycobacterium chelonae и Mycobacterium abscessus, Mycobacterium phlei, Mycobacterium nonchromogenicum, Mycobacterium marinum и Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium aurum, Mycobacterium szulgai и Mycobacterium malmoense, Mycobacterium xenopi и Mycobacterium smegmatis.

Обнаружение этих 17 видов Mycobacterium имеет решающее значение для точной клинической диагностики и индивидуального ведения пациентов. Комплекс микобактерий туберкулеза (MTBC) является приоритетным из-за его роли в борьбе с туберкулезом, что требует немедленной изоляции и полилекарственной терапии для сдерживания передачи инфекции и борьбы с лекарственной устойчивостью. Виды в составе комплекса Mycobacterium avium-intracellulare (MAC), такие как M. avium и M. intracellulare, преимущественно поражают лиц с ослабленным иммунитетом (например, ВИЧ/СПИД) или людей с хроническим заболеванием легких, требующим длительных схем на основе макролидов. Быстро растущие микобактерии (РГМ), такие как M. abscessus и M. fortuitum , печально известны своей устойчивостью к антибиотикам и часто вызывают тяжелые инфекции кожи, мягких тканей или легких, требуя агрессивных комбинаций хирургического вмешательства и таргетных антибиотиков (например, амикацина, макролидов). Виды окружающей среды, такие как M. gordonae или M. smegmatis , являются частыми загрязнителями, но могут вызывать оппортунистические инфекции в определенных условиях, что требует тщательной клинической корреляции, чтобы избежать ненужного лечения. Патогены, такие как M. marinum (связанный с воздействием в воде) и M. ulcerans (вызывающий язву Бурули), имеют четко выраженные эпидемиологические ниши, определяющие оценку истории воздействия. Редкие, но клинически значимые виды (например, M. szulgai, M. malmoense) имитируют туберкулез и требуют видоспецифичных схем. Точная идентификация имеет первостепенное значение, так как продолжительность лечения, выбор препарата (например, чувствительность к рифампицину у M. kansasii по сравнению с внутренней резистентностью у НТМ) и прогноз сильно варьируются. Молекулярная диагностика и тестирование чувствительности к противомикробным препаратам имеют важное значение для оптимизации результатов, особенно в популяциях с ослабленным иммунитетом или сложных инфекциях.

Во-первых, целевые последовательности в геноме Mycobacterium амплифицируются с помощью асимметричной ПЦР. Затем амплифицированные продукты гибридизуются с пробниками на чипе. Если микобактерия-мишень присутствует в образце, амплифицированные продукты будут специфически связываться с соответствующими зондами на чипе. Наконец, сканируя сигналы гибридизации на чипе, можно определить вид Mycobacterium в образце.

С помощью технологии микрочипирования генных чипов на подложке закрепляются специальные зонды для обнаружения вышеупомянутых генов и различные контрольные зонды. Каждый датчик обнаружения и контрольный зонд повторяются 5 раз, образуя микрочип размером 12 строк x 10 столбцов. Расположение щупа показано на рисунке 1. Каждый чип содержит четыре идентичных микрочипа, и каждый микрочип может обнаруживать один образец.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было одобрено Комитетом по этике Первой больницы Цюаньчжоу при Фуцзяньском медицинском университете (одобрение No 2024-K035). Информированное согласие было получено от всех пациентов до сбора клинических образцов. Пациенты были проинформированы о цели исследования, необходимых процедурах и их праве отказаться от исследования в любое время без ущерба для их медицинского обслуживания.

1. Требования к образцам

ПРИМЕЧАНИЕ: При сборе образцов у пациентов с клинически подозреваемым туберкулезом и нетуберкулезными микобактериями (НТМ) для тестирования с помощью этого набора, выполните следующие действия:

  1. Соберите образцы, такие как мокрота, гной или секрет, жидкость бронхоальвеолярного лаважа, пункционная жидкость (включая спинномозговую жидкость, плевральную и перитонеальную жидкость, перикардиальную жидкость, суставную жидкость и желчь) и мочу пациентов.
    1. Для образцов мокроты:
      1. Проинструктируйте пациента прополоскать рот чистой водой утром, а затем откашлять глубокую мокроту в стерильный контейнер для хранения образцов, запечатать его и отправить на анализ.
      2. Добавьте в 1-2 раза больше 4% NaOH, встряхните и равномерно перемешайте.
      3. Через 15-20 минут добавьте равный объем фосфатного буфера pH 6,8 и равномерно перемешайте.
      4. При комнатной температуре центрифугируйте при 2000 × г в течение 15 минут и выбросьте надосадочную жидкость. Добавьте 1 мл 0,9% NaCl через пипетку и тщательно перемешайте; Используйте для обнаружения.
    2. Для образцов гноя или секрета:
      1. Промойте поверхность стерильным физиологическим раствором. Соберите гной или секрет с помощью стерильного тампона, запечатайте его и отправьте на анализ.
      2. Добавьте в 3 раза больше 4% NaOH и тщательно встряхните, чтобы хорошо перемешать.
      3. Дайте ему постоять при комнатной температуре в течение 20 минут (встряхните вручную 2 раза в течение этого периода), центрифугируйте при 2000 × г при комнатной температуре в течение 15 минут, а затем выбросьте надосадочную жидкость. Добавьте 1 мл 0,9% NaCl через пипетку и равномерно перемешайте; Используйте для обнаружения.
    3. Для жидкости бронхоальвеолярного лаважа:
      1. Введите 10-20 мл нормального физиологического раствора через защищенную трубку бронхоальвеолярного лаважа (PBAL).
      2. Соберите образец в стерильную бутылку с помощью отсасывания под отрицательным давлением и отправьте его на исследование.
    4. Для спинномозговой жидкости:
      1. Соберите не менее 2 мл образца с помощью асептического метода.
      2. Центрифуга при 2 000 × г в течение 15 мин при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость. Добавьте 1 мл 0,9% раствора хлорида натрия через пипетку, тщательно перемешайте и используйте для тестирования.
    5. Для образцов мочи:
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать первое полное количество мочи утром или в середине и поздно вечером. Моча также может быть собрана с помощью катетеризации.
      1. Соберите образец в стерильный контейнер и дайте собранному образцу мочи постоять 4-5 часов.
      2. Центрифугируйте при 2 000 × г в течение 15 мин при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость. Добавьте 1 мл 0,9% раствора хлорида натрия через пипетку, тщательно перемешайте и используйте для тестирования.
  2. Хранение образцов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы на твердой среде не следует хранить в замороженном виде, так как замораживание может повлиять на последующие операции.
    1. Хранить имеющиеся в жидкой среде образцы при температуре -70 °С не более 5 лет.
    2. Хранить все образцы при температуре 2-8 °C не более 2 месяцев.
  3. Транспортировка образцов
    1. При транспортировке образцов испытуемого изолята обязательно используйте закрытую тару, отвечающую требованиям биобезопасности в условиях, разрешенных нормативными актами.

2. Подготовка к эксперименту

  1. Приготовление растворов для промывки стружки
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте раствор для промывки стружки I и раствор для промывки стружки II в зависимости от количества стружки. Объем должен быть таким, чтобы стружка могла быть полностью погружена во время промывки. Равномерно перемешайте их и уравновесьте до комнатной температуры (10-30 °C). Конечная концентрация SSC составляет 2x, а конечная концентрация SDS — 0,2%.
    1. Чтобы приготовить раствор для промывки стружки I, смешайте 20x SSC, дистиллированную воду (или очищенную воду) и 10% SDS в соотношении 10:88:2 в последовательности для приготовления раствора для промывки стружки I. Например, при приготовлении общего объема 600 мл сначала отмерьте 60 мл 20x SSC и 528 мл дистиллированной воды (или очищенной воды), поместите их в стакан объемом 1 л и равномерно перемешайте стержнем. Затем добавьте 12 мл 10% SDS и снова равномерно перемешайте.
    2. Для приготовления раствора для промывки стружки II: Конечная концентрация SSC составляет 0,2x. Смешайте 20x SSC и дистиллированную воду (или очищенную воду) в соотношении 1:99, чтобы получить раствор для промывки стружки II. Взяв в качестве примера препарат общего объема 600 мл, отмерьте 6 мл 20x SSC и 594 мл дистиллированной воды (или очищенной воды), поместите их в стакан объемом 1 л и равномерно перемешайте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если в 10% растворе SDS образуются белые флокулянты, нагрейте его до 50 °C, тщательно перемешайте, а затем приготовьте буфер для промывки микрочипов. Если в Wash Buffer I образуются белые выпадающие в осадок флокулянты, нагрейте его до 50°C, тщательно перемешайте, перед использованием уравновесьте до комнатной температуры.
  2. Приготовьте 350 мл водной смеси льда.
  3. Подготовьте дистиллированную воду (или очищенную воду).

3. Подготовка приборов и материалов

  1. Выбор и настройка инструментов
    1. Определите и подготовьте сканер микрочипов, чтобы убедиться, что он откалиброван и готов к использованию.
    2. Настройте прибор для экстракции нуклеиновых кислот, проверив его функции и загрузив необходимые реагенты.
    3. Поместите коробку для гибридизации микрочипа гена в соответствующее место и убедитесь в ее исправном рабочем состоянии.
  2. Подготовка инструментов для пипетирования
    1. Соберите микропипетки объемом 0,1–10 μл, 2–20 μл и 20–200 μл, а также соответствующие чистые и стерильные наконечники для пипеток. Убедитесь, что микропипетки точно откалиброваны, а наконечники правильно установлены.
  3. Расстановка вспомогательного оборудования
    1. Приготовьте водяную баню постоянной температуры и установите ее на необходимую температуру (50 °C).
    2. Установите микроцентрифугу, способную центрифугировать пробирки центрифуги объемом 1,5 мл, и проверьте ее балансировку и настройки скорости.
    3. Разложите чистые и стерильные центрифужные пробирки (200 мкл и 1,5 мл) и дополнительные чистые и стерильные восьмилуночные стрипы (200 мкл) на штативы для центрифужных пробирок.
  4. Готовность оборудования для обработки проб
    1. Разместите шейкер с постоянной температурой в удобном месте и установите соответствующие параметры встряхивания.
    2. Отложите две емкости для мытья чипсов и убедитесь, что они чистые и сухие.
    3. Расставьте решетки для выдвижных тележек и центрифугу, а также имейте под рукой емкость для центрифугирования и сушки чипов.
  5. Подготовка ПЦР-амплификатора
    1. Включите ПЦР-амплификатор и запрограммируйте его в соответствии с протоколом эксперимента, убедившись, что он готов к выполнению реакций амплификации.

4. Экстракция нуклеиновых кислот

ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите операцию в зоне подготовки образцов и выполните следующие действия:

  1. Подготовка
    1. Добавьте 80 мкл раствора для экстракции нуклеиновых кислот в пробирку для экстракции нуклеиновых кислот и добавьте 1 мл 0,9% NaCl.
  2. Забор образцов изолята
    1. Чтобы начать сбор проб, изучите источник проб, будь то твердая или жидкая среда.
    2. Чтобы собрать образцы твердой среды, используйте стерильную петлю для посева, чтобы выбрать видимую колонию из подходящей твердой среды. Если бактерии разрослись, чтобы покрыть всю среду, то подберите соответствующее количество бактериального газона. Осторожно поместите его в пробирку для экстракции нуклеиновых кислот, содержащую раствор для экстракции нуклеиновых кислот, стараясь по возможности не собирать твердую среду.
    3. Для образцов жидких сред необходимо аспирировать 10-20 мкл бактериальной суспензии с мутностью, равной или превышающей 1 стандарт Макфарланда. Введите его в пробирку для экстракции нуклеиновых кислот, содержащую раствор для экстракции нуклеиновых кислот.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После сбора образцов, будь то из твердой или жидкой среды, образцы готовы к последующей операции экстракции нуклеиновых кислот.
  3. Экстракция нуклеиновых кислот
    1. После добавления предварительно обработанных образцов или образцов изолята из Шага 1.1, упомянутого выше, используйте прибор для быстрой экстракции нуклеиновых кислот для извлечения нуклеиновых кислот. Извлеченные нуклеиновые кислоты поместить при температуре -20 °C для временного хранения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве показателя эффективности экстракции автоматический экстрактор может извлекать образцы с вирусной нагрузкой нуклеиновых кислот более 100 копий/мл. Срок временного хранения не должен превышать 2 месяцев.

5. ПЦР-амплификация

  1. Подготовка реакционной системы ПЦР
    1. В зоне хранения и подготовки реагентов подготовьте центрифужные пробирки объемом 200 мкл или восьмилуночные полоски в зависимости от количества исследуемых образцов и заранее отметьте номера образцов. Достаньте реактивы для амплификации ПЦР из набора, дайте им оттаять и растаять естественным образом, аккуратно встряхните и равномерно перемешайте, а затем быстро центрифугируйте, чтобы реактивы собрались на дне пробирок.
    2. В зависимости от количества образцов реагенты для амплификации ПЦР распределяют в центрифужные пробирки объемом 200 мкл или восьмилуночные стрипы по объему 18 мкл на пробирку. Плотно закройте крышки пробирок, а затем перенесите их в зону приготовления реакционной смеси амплификации и амплификации.
    3. Добавьте 2 мкл матричной ДНК (ДНК исследуемого образца (т.е. надосадочную жидкость в пробирке для экстракции нуклеиновых кислот), положительные контрольные продукты или отрицательные контрольные продукты) в зону подготовки образца. Следите за тем, чтобы общий объем каждой реакционной системы ПЦР достигал 20 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте продукты положительного контроля и продукты отрицательного контроля каждый раз во время усиления. Продукт положительного контроля может быть использован для контроля качества в процессах амплификации ПЦР и гибридизации, а продукт отрицательного контроля может быть использован для мониторинга окружающей среды и рабочего процесса.
  2. Усиление
    1. Поместите центрифужные пробирки или восьмилуночные полоски, содержащие реагенты, в прибор для амплификации ПЦР. Убедитесь, что прибор предварительно нагрет до необходимой температуры. Провести реакцию амплификации ПЦР по следующей программе термоциклирования: начальная денатурация при 94 °С в течение 600 с (1 цикл); 35 циклов денатурации при 94°С в течение 30 с, отжига при 60°С в течение 30 с и удлинения при 72°С в течение 40 с; окончательное удлинение при 72°С в течение 420 с (1 цикл); держать при температуре 4 °C неограниченное время (1 цикл).

6. Гибридизация чипов

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед окончанием реакции амплификации ПЦР выполните следующие операции:

  1. Установите температуру водяной бани постоянной температуры на 50 °C и разогрейте ее.
  2. Приготовление чипсов
    1. Добавьте 200 мкл дистиллированной воды (или очищенной воды, как показано на рисунке 2A) на дно коробки для гибридизации чипов с помощью микрочипа гена. Поместите кронштейн между двумя позиционирующими столбцами внутри коробки.
    2. Осторожно поместите стружку лицевой стороной вверх на скобу и накройте стружку защитным стеклом четырьмя бобышками вниз (как показано на рисунке 2B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в правильном направлении установки защитного стекла так, чтобы его конец совпадал с этикеткой на конце чипа.
  3. Приготовление, денатурация и охлаждение реакционной смеси для гибридизации
    1. Подготовьте центрифужные пробирки объемом 200 мкл или восьмилуночные полоски в зависимости от количества образцов и правильно промаркируйте их.
    2. Достаньте буфер для гибридизации из комплекта и нагрейте его при 50 °C до полного расплавления. После тщательного перемешивания быстро центрифугируйте его в микроцентрифуге. Добавьте 9 мкл буфера для гибридизации в каждую подготовленную центрифужную пробирку объемом 200 мкл или восьмилуночную полоску. Затем добавьте 6 μL соответствующего продукта ПЦР в каждую пробирку, в результате чего общий объем составит 15 μL на смесь реакции гибридизации.
    3. Смесь для реакции гибридизации (включая буфер для гибридизации и продукт ПЦР) нагреть до 95 °C (в приборе для ПЦР или на водяной бане) и денатурировать в течение 5 минут. Извлеките реакционную смесь для гибридизации, которая прошла денатурационную обработку на предыдущем этапе, и немедленно погрузите ее в смесь ледяной воды на 3 минуты.
  4. Реакция гибридизации
    1. Достаньте смесь для реакции гибридизации из ледяной бани, пипеткой вверх и вниз 2 раза с помощью микропипетки, чтобы равномерно перемешать. После того, как осадок белого флокулянта (если он есть) исчезнет, добавьте 13,5 мкл реакционной смеси гибридизации через загрузочное отверстие покровного стекла (как показано на рисунке 2C), быстро накройте коробку для гибридизации и запечатайте ее (как показано на рисунке 2D). Запишите номер чипа, положение микрочипа и соответствующий номер образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: К каждому микрочипу можно добавить только один образец.
    2. Немедленно поместите герметичные гибридизационные боксы горизонтально в водяную баню постоянной температуры, предварительно нагретую до 50 °C. Запустите таймер на 120 минут после того, как все коробки для гибридизации будут установлены.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте попадания пузырьков воздуха в процессе загрузки. На всех этапах от начала загрузки до высыхания чипов избегайте прямого контакта жидкости на микрочипах чипов с воздухом в течение длительного времени, чтобы предотвратить слишком высокий фон чипа из-за высыхания и вмешательства в интерпретацию результата.
  5. Промывка и сушка чипсов
    1. После того как реакция гибридизации будет завершена, выньте коробки для гибридизации горизонтально, разберите их, а стружку выньте для промывки. Немедленно поместите чипсы на решетку для слайдов в контейнере (например, в стакане), заполненном раствором для промывки чипсов I, который был отрегулирован до комнатной температуры (10-30 °C). Стирайте их со скоростью 80-100 об/мин в шейкере постоянной температуры в течение 3 минут при комнатной температуре.
    2. Промойте щепу Chip Wash Solution II, сбалансированным до комнатной температуры, со скоростью 80-100 об/мин на встряхивателе постоянной температуры в течение 3 минут при комнатной температуре.
    3. Поместите чипсы в центрифугу и центрифугируйте при температуре 100 × г при комнатной температуре на 5 минут. Отсканируйте их после высыхания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не допускайте столкновения стружки или трения друг о друга.

7. Сканирование чипа и интерпретация результатов

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте сканер микрочипов и соответствующее программное обеспечение для считывания сигналов и интерпретации результатов. Также в таблице 1 приведены аномальные результаты и способы устранения неполадок. Выполните следующие действия для работы (см. руководства пользователя сканера и программного обеспечения).

  1. Включите сканер и соответствующее программное обеспечение, а затем нажмите кнопку «Управление лазером », чтобы дать ему предварительно нагреться в течение 10 минут.
  2. Вводите различные типы информации, связанные с образцами, такие как номер образца.
  3. После того как сканер завершит предварительный нагрев, нажмите кнопку «Извлечь » и неподвижно поместите чип на небольшую часть кронштейна. Аккуратно и горизонтально протолкните чип в отверстие отсека сканера и нажмите на кнопку «Загрузить ».
  4. Введите номер микросхемы, щелкните, чтобы выбрать область обнаружения (микрочип 1-4), а затем нажмите кнопку «Выбрать образец », чтобы выбрать соответствующие образцы для каждого микрочипа. Затем нажмите кнопку «Начать обнаружение », чтобы провести сканирование чипов. Результаты сканирования будут отображены на экране и автоматически сохранены.
  5. После сканирования одного чипа повторите шаги 7.3 и 7.4 для сканирования следующего чипа. Выполняйте эту процедуру до тех пор, пока не будут отсканированы все чипы.
  6. Используйте страницу «Запрос данных » для выполнения операций запроса данных и печати.
  7. Выполнив все операции, сначала выключите лазер, затем выйдите из программного обеспечения, и наконец выключите сканер.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Положительные результаты
Для зондов рода Mycobacterium (внутренний контроль, ИЦ) и Mycobacterium tuberculosis их положительные значения результатов определяют методом Receiver Operating Characteristics (ROC). Для зондов, используемых для детектирования остальных 16 NTM, их положительные значения результата определяются процентильным методом.

Экспериментальный контроль качества
Результатом обнаружения положительного контрольного продукта...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метод чипирования ДНК-микрочипов, представленный в этой статье, позволяет непосредственно обнаруживать нуклеиновые кислоты в клинических образцах (включая мокроту, гной, жидкость бронхоальвеолярного лаважа, спинномозговую жидкость и пункционную жидкость) у пациентов с подозрением на туберкулез и нетуберкулезный микобактериоз и может значительно сократить время подтверждения диагноза. Метод чипирования ДНК-микрочипов, представленный в этом исследовании, представляет собой значительный про...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана проектом Фонда естественных наук провинции Фуцзянь (2024J011521) и проектом Цюаньчжоуского плана науки и техники (2024NY006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,9% хлорида натрия для инъекций (NaCl)Фучжоу ХАЙВАНФУЯОH35020289
Аппаратура для амплификации прикладных биосистемThermo Fisher Scientific96-луночный термоамплификатор Veriti
CapitalBio LuxScan10K/BКапиталБиоLuxScan10K/B
CapitalBio SlideWasher 24 КапиталБиоSlideWasher 24 
  Центрифуга Эппендорф5424РMaX.скорость 15000 мин-1
Буфер для гибридизации
Чип и крышка генного микрочипа HybSet
Набор для идентификации видов микобактерийКапиталБио301030
Негативный контроль, положительный контроль
Экстрактор нуклеиновых кислотТЯНЬЛУНГенРотекс 96
Реагент для амплификации ПЦР
pH 6,8 фосфатный буферШанхай юанье биотехнологияР20029-10
Пипетки и наконечникиТермо Сайентиал0,1 - 10 мкм; L, 2 - 20 μ L, и 20 - 200 μ L, 100-1000 μ L
qEx-ДНК/РНК Набор для экстракции или очистки нуклеиновых кислотТЯНЬЛУНqEx-ДНК/РНК
Паспорт безопасностиКапиталБио441060
Гидроксид натрия (NaOH)XILONGS  НаучныйХК13-011-00027
СЦОКапиталБио441050
термостатическая водяная баняСУРУИHH-W600

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Primm, T. P., Lucero, C. A., Falkinham, J. O. III Health impacts of environmental mycobacteria. Trends Genet. 38 (8), 821-830 (2004).
  2. Sawyer, J., et al. Mycobacterium bovis and its impact on human and animal tuberculosis. Trends Genet. 39 (8), 587-592 (2023).
  3. Zhao, Q., et al. The impact of DNA microarray chip technology on the diagnosis and management of non-tuberculous mycobacterial infections in immunocompromised patients. Antimicrob Agents Chemother. 65 (12), e01500-e01500 (2021).
  4. Liu, S., et al. DNA microarray-based detection of drug-resistant Mycobacterium strains: a single-center experience. Clin Microbiol Infect. 26 (10), 1400-1407 (2020).
  5. Li, J., et al. Comparative evaluation of DNA microarray and next-generation sequencing for Mycobacterium identification. Int J Infect Dis. 118, 250-258 (2022).
  6. Chen, K., et al. Optimizing probe design for DNA microarray-based Mycobacterium identification: a computational biology approach. BMC Microbiol. 19 (2), 120-129 (2019).
  7. Michelet, L., Boschiroli, M. L. Mycobacterium uberis. Microorganisms. 8 (11), 1701(2020).
  8. Imran, M., et al. DNA microarray technology for the detection and identification of Mycobacterium species: a review. J Microbiol Biotechnol Res. 6 (2), 275-285 (2020).
  9. Garcia-Sanchez, L., et al. Advances in DNA microarray technology for Mycobacterium detection and characterization. J Mol Diagn. 24 (5), 650-662 (2022).
  10. Wang, L., et al. Machine learning analysis of SERS fingerprinting for the rapid determination of Mycobacterium tuberculosis infection and drug resistance. Comput Struct Biotechnol J. 26 (20), 5364-5377 (2022).
  11. Wang, X., et al. Integration of DNA microarray data with clinical outcomes in tuberculosis patients: implications for personalized medicine. Mol Diagn. 16 (3), 150-160 (2024).
  12. Wang, X., et al. Rapid identification of Mycobacterium tuberculosis complex and common non-tuberculous Mycobacteria by DNA microarray chip. BMC Microbiol. 21 (1), 242(2021).
  13. Smith, J. D., et al. DNA microarray insights into Mycobacterium epidemiology and control strategies. J Clin Microbiol. 60, e02033-e02121 (2022).
  14. Garcia, L. M., et al. Tracking Mycobacterial spread via DNA microarray: a community-based study. PLoS One. 18 (3), e0282123(2023).
  15. Li, H., et al. Economic evaluation of DNA microarray chip technology in Mycobacterium diagnosis. Diagnostics. 11 (12), 2235(2021).
  16. Wang, Z., et al. Cost-benefit analysis of implementing DNA microarray chip for Mycobacterium detection in clinical settings. J Med Econ. 25 (1), 113-122 (2022).
  17. Liu, Y., et al. False positives and false negatives in DNA microarray chip detection of Mycobacteria: a comprehensive analysis. Microb Pathog. 149, 104671(2020).
  18. Chen, L., et al. Validation and improvement of DNA microarray chip for Mycobacterium identification: coping with genetic variants. Front Cell Infect Microbiol. 11, 627923(2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Mycobacterium tuberculosis

Похожие статьи