Высокопроизводительная серийная томография с использованием автоматизированного робота для смены образцов

Summary

Здесь представлены и обсуждаются детали реализации и процедура сбора данных для синхротронной рентгеновской томографии с использованием автоматизированного робота для смены образцов в Diamond Light Source (DLS) I13-2 Imaging Beamline. Это значительно повышает пропускную способность и эффективность сбора данных пучевой линии.

Abstract

В этой рукописи описывается рабочий процесс автоматизированного сбора данных, который использует роботизированную руку для обмена образцами, что значительно повышает эффективность сбора данных. Эта система, реализованная для синхротронной рентгеновской съёмки на Diamond Light Source (DLS) I13-2, Imaging Beamline, использует робота для достижения высокопроизводительной серийной томографии (3D) или визуализации (2D). В настоящее время для многих экспериментов время, необходимое для ручного обмена образцов и выравнивания, сопоставимо или даже превышает длительность самого томографического сканирования. Для максимального эффективного использования доступного времени пучка и увеличения пропускной способности экспериментов крайне важно автоматизировать обмен образцов и выравнивание. Использование робота в качестве смены выборок может увеличить пропускную способность как минимум в 4–10 раз по сравнению с ручными процедурами, в зависимости от выбранного размера пикселя. С машиной Diamond II и лучевыми линиямиI13L Operando C с TO-мографиейи модернизацией P tychographic Imaging (OCTOPI) увеличенный поток рентгеновских лучей ещё больше сократит время экспериментального сканирования, делая систему ещё более эффективной. Кроме того, автоматизация позволяет удалённый сбор данных, включая опциональную почтовую службу для пользователей. Автоматизированное центрирование образцов позволяет полностью самостоятельно сканировать, которое можно выполнять удалённо. Это уникальная и инновационная особенность системы. В этой рукописи описывается полный процесс, включая подготовку образцов, монтаж на специализированные держатели, транспортировку на лучевую линию, а также размещение на специализированных лотках для роботизированного обмена образцами. Представлена процедура автоматизированного центрирования образца и последующего процесса реконструкции томографии.

Introduction

Автоматизация широко используется в тяжёлой промышленности на протяжении десятилетий^{1, 2 и 3}. Однако разработка аппаратного и программного обеспечения роботов достаточно зрелая, чтобы выполнять очень деликатные задачи, такие как секвенирование генома, проведение медицинских операций в больницах или помощь в проведении химических^{экспериментов 4, 5, 6 и 7}. Автоматизация не только устраняет человеческие ошибки, но и повышает пропускную способность и^{эффективность 4}.

Источник синхротронного рентгеновского излучения генерирует чрезвычайно яркое и высококогерентное электромагнитное излучение в широком спектре — от инфракрасного до жёсткого рентгеновского излучения. Эти источники позволяют проводить эксперименты с высокой пропускной способностью и высоким разрешением при минимальном времени сканирования и высокой статистике. Частичная когерентность может быть использована для достижения лучшего контраста слабо поглощающих мягких материалов, таких как полимеры или образцы^{тканей 8,9,10} по сравнению с лабораторными рентгеновскими источниками. Полный набор данных рентгеновской томографии — позволяющий визуализировать объект в реальном 3D — требует получения проекций образца под разными углами. Достижения в яркости источника, экспериментальном оборудовании и органах управления позволяют собрать данные в диапазоне от десятков секунд до^восьми минут. В результате загрузка и выравнивание образцов стали более трудоёмкими, чем само томографическое^{сканирование 11,12}. Важно отметить, что ручная замена образцов в эксперименте с синхротронной томографией может занять значительное количество времени (по сравнению с временем сканирования), поскольку при входе и закрытии экспериментальной камеры необходимо соблюдать процедуру радиационной безопасности. Обычно эта процедура занимает несколько минут. Кроме того, выравнивание образца может занять несколько минут.

Если автоматизировать этот процесс изменения образцов и выравнивание образцов, значительно сэкономится время. Поэтому на линии I13-2 Imaging синхротронного комплекса DLS был реализован робот-сменщик образцов. В этой рукописи описывается полный протокол проведения эксперимента синхротронной рентгеновской микротомографии с несколькими образцами с использованием робота-сменщика образцов на линии I13-2 Imaging^11,12. Эта реализация не только повышает эффективность экспериментального времени, но и позволяет проводить эксперименты удалённо. Альтернативой является ручное или полуавтоматическое управление, оба значительно медленнее. Здесь полуавтоматическое использование робота для обмена образцами только без их выравнивания.

Значимость автоматизации подчёркивается проектами автоматизации на других линиях синхротронного визуализации, наиболее похожие проекты — на 2BM линии пучка^{APS 13}, SLS TOMCAT¹⁴, EMBL P14 на PETRA^{III 15} и IMAGE в Карлсруэ Институте Технологии (KIT) Light^{Source 16}. В 2-BM APS образцы, требующие сканирования с помощью робота, крепятся на стандартном кинематическом креплении, которое размещается в лотоке для смены образцов максимальной вместимостью 60 образцов одновременно. Затем рука захвата выбирает образец и устанавливает его на стадию вращения. Однако выравнивание сэмпла выполняется офлайн с помощью стереоскопа. Похожая система была установлена в лучевой линии TOMCAT в SLS, но здесь процесс полностью автоматизирован, что позволяет выполнять нагрузку-разгрузку образцов, выравнивание, сканирование нужной области интереса и реконструкцию. Общее количество образцов, которые можно отсканировать одновременно, составляет 60. Недавно линия пучка P14 на PETRA III¹⁵ установила систему замены образцов, способную работать с мягкими биологическими образцами размером порядка 1 мм. Позиционирование и центрирование осуществляются методом трёхкликового центрирования. На линии пучка IMAGE в KIT высокопроизводительная конечная станция для визуализации и томографии позволяет измерять до 1500 образцов за два^{дня 16}. В отличие от упомянутых выше роботизированных систем, система I13-2 Imaging Beamline в настоящее время может обрабатывать образцы диаметром до 8 мм и измерять до 112 образцов за восемь часов без участия человека, включая автоматическое центрирование образцов.

Текущая томографическая установка на I13-2, Diamond-Manchester Imaging beamline, была описана в публикации,^{упомянутой 17}. Для полноты здесь изложены ключевые аспекты томографических экспериментов; пожалуйста, также см. рисунок 1. Стек стадии томографии состоит из шестиногого (PI miCos) для манипуляции образцами, а также для выравнивания наклона оси вращения. На верхней части шестиапода установлена воздушноподпорная ступень вращения. Ступень вращения обладает отличными колебаниями (<2,4 мкрад) и осевыми ошибками (<100 нм). Система томографического детектора оснащена четырьмя различными увеличениями (или полем обзора). Для текущего исследования использовались объективы с эффективным размером пикселей 1,25× (2,6 мкм с полем обзора 6,7 мм x 5,6 мм) и 4× (эффективный размер пикселей 0,81 мкм с полем обзора 2,1 мм x 1,8 мм). Объектив 1,25× имел сцинтиллятор LuAg:Ce с объёмом 500 мкм, тогда как 4x — сцинтиллятор LuAg:Ce с размером 100 мкм (Crytur). Детектор sCMOS (pco.edge 5.5) фиксирует изображение увеличенного сцинтилляционного экрана через дополнительный двухкратный фотоокуляр (вся оптика микроскопа — от Olympus). Эффективные пиксели варьируются от 2,6 мкм до 0,33 мкм, при максимальном увеличении разрешается около 1 мкм. Чип детектора состоит из размеров 2560 x 2160 с размером пикселей 6,5 мкм, а максимальная частота чтения массива пикселей составляет 100 Гц.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании используются образцы насекомых из Музея естественной истории (NHM), Лондон, для сравнительного фенотипического анализа. Образцы были приобретены Музеем естественной истории в соответствии со стандартными процедурами приобретения для обеспечения законного собрания и передачи образцов.

1. Планирование эксперимента

1. Проверьте возможность проведения томографических или визуализационных экспериментов с образцом на линии луча I13-2, связавшись с лучевой линией по следующей ссылке: https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Imaging-and-Microscopy/I13-2/Staff.html .
2. Подайте заявку на получение времени для проведения запланированного эксперимента по следующей ссылке: https://www.diamond.ac.uk/Users.html.
3. Обсудите подготовку образца и процесс измерения образцов с сотрудниками Beamline после принятия предложения и запланирования эксперимента. Эксперименты, проводимые с использованием робота, имеют определённые требования, которые приведены в следующем разделе (раздел 2).
4. Обсудите размеры и состав образца с сотрудником линии пучка, чтобы убедиться, что эксперимент может быть успешно проведен на линии пучка.
5. Начните готовиться к экспериментальному визиту заранее, следуя инструкциям на сайте (https://www.diamond.ac.uk/Users.html).
6. Пройдите обучение по безопасности перед экспериментальной сессией.

2. Подготовка образцов (для экспериментов с роботами)

1. Подготовьте совместимые с SPINE Sample^{Bases 18} для монтажа образцов. Размещайте каждый образец на стандартной базе образцов в стиле SPINE с штрихкодом Data Matrix для автоматизированного отслеживания образцов.
2. Прикрепите образец к основанию, используя одну из двух конфигураций. Крепление контактов: закрепите образец на штифте в стиле SPINE (см. рисунок 1C, вставка). Контейнер или прямое крепление: Поместите образец в совместимый контейнер, например, в микроцентрифугную трубку/полиимидную трубку, или непосредственно на основание образца.
3. Проверьте совместимость размеров с роботизированным захватом, убедившись, что установленный образец попадает в допустимые размерные границы для обеспечения безопасного роботизированного обращения (см . рисунок 2):
   Вариант A: Помещается в цилиндр диаметром 8 мм и высотой 20 мм.
   Вариант B: Помещается в цилиндр диаметром 3,5 мм и высотой 33 мм.
4. Убедитесь, что обе конфигурации сосредоточены на базе выборки. Убедитесь, что общая высота (образец + крепление + основание) не превышает 27 мм или 40 мм, в зависимости от выбранной конфигурации.
5. При монтаже образцов на штифты для образца SPINE убедитесь, что образец расположен сверху штифта, и ни одна его часть не закрывается валом штифта. Образец должен быть установлен вертикально и по центру на основании штифта, чтобы избежать контакта с роботизированным захватом. Это особенно важно для крепления варианта B, описанного в разделе протокола 2.3, а также для удлинённых образцов, установленных поверх контактов образца.
6. При установке внутри контейнеров или пробирок плотно закрепляйте образец внутри контейнера, чтобы он не смещался при транспортировке или роботизированной обработке. Убедитесь, что сам контейнер остаётся вертикально выровненным на основе образца.
7. Закрепите выбранный монтажный элемент (штифт или контейнер) надёжно и вертикально на основании образца, чтобы обеспечить стабильность позиционирования на протяжении всего эксперимента.
8. Используйте надёжный клей или способ закрепления для предотвращения отслоения во время транспортировки и автоматизированные манипуляции, так как оба процесса могут создавать механические нагрузки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Распространённые клеи включают цианоакрилат (суперклей), парафиновый воск и горячий клей. Если сомневаетесь в совместимости материалов, проконсультируйтесь с персоналом Beamline.
9. Проверьте, чтобы все образцы располагались на одинаковой высоте от верхнего края контейнера или на штифте образца. Для образцов, установленных внутри контейнеров, убедитесь, что боковое расстояние от стенки контейнера одинаковое для всех образцов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стабильное позиционирование крайне важно для надёжного автоматического выравнивания. Меньшие выборки относительно поля зрения обеспечивают большую толерантность.
10. Документируйте код матрицы данных, связанный с каждым образцом, чтобы обеспечить правильную идентификацию образца при анализе данных.
11. Сгенерируйте samples.csv-файл для связи каждого имени образца с его матрицой базы образцов и передачи параметров, важных для проведения томографических сканировок.

3. Упаковка образцов и доставка

1. Не позднее чем за 15 рабочих дней до экспериментальной сессии подайте оценку экспериментального риска (ERA) и заявите все образцы, представленные там. Эта ERA должна быть одобрена группой DLS по охране труда (HSE) перед отправкой и доставкой образцов на объект.
2. Используйте универсальную базу образцов с комбинированным хранилищем и/или контейнером для отбора, также называемым Uni-puck. Это довольно важно, если отправлять по почте.
3. Если образцы не помещаются в прорези контейнера для хранения, указанные в шаге 3.2, пожалуйста, сделайте альтернативные способы крепления, например, используя магнитные защитные колпачки, соответствующие основанию образца, и напрямую доставляйте образцы для измерений.

4. Экспериментальная установка

1. Отрегулируйте параметры источника рентгеновского излучения для максимизации контраста образца. Для этого сместите полный спектр и/или отфильтруйте рентгеновский спектр.
2. Оптимизируйте камеру под расстояние выборки на основе спектра рентгеновского излучения и желаемой степени фазового контраста для данного образца.
3. Выберите увеличение микроскопа в зависимости от размера образца и требуемого поля обзора, а также выберите соответствующий объектив микроскопа.
4. Выровняйте горизонтальное положение камеры (ось рентгена в лаборатории) относительно рентгеновского луча.

5. Загрузка и выравнивание образцов

1. Тщательно проверяйте образцы и монтаж образцов в начале каждой экспериментальной сессии на предмет повреждений или небрежно смонтированных образцов. Информируйте пользователей о любых таких образцах.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящее время лучовая линия оснащена креплениями для до 7 puck, и каждая таблетка может вместить до 16 образцов. Всего за один запуск робота можно измерить 112 образцов. Пожалуйста, обратитесь к дополнительной рисунок 2, где показано, как определить положения слотов (штифтов) шайбы.
2. Монтировать образцы на соответствующие паки и слоты (штифты), указанные в samples.csv файле. Проведите пробный запуск процедуры обмена образцами робота на нескольких образцах, чтобы проверить работу робота, а также убедиться, что образцы соответствуют необходимым спецификациям.
3. Используйте базу образца с контактом (без образца) для выравнивания оси вращения ступени вращения с центром детектора в горизонтальном направлении.
4. Переместите верхнюю часть штифта к центру рентгеновской камеры (рисунок 3A). Выровняйте камеру телескопа (TC), установленную под углом 90° относительно луча, как показано на изображении (рисунок 3), чтобы она находилась в центре поля зрения (FOV). Определите координаты этой позиции в координатах пикселей TC.
5. Обновите целевой позицию выборки в скрипте, который обрабатывает выравнивание сэмпла.
6. Смонтировать репрезентативную выборку. Запустите скрипт автоматического выравнивания сэмпла, чтобы разместить образец в центре вращения на TC. Ссылка на сценарий приведена в дополнительном файле 1.
7. Проверьте, центрирована ли область образца (ROI) в поле зрения (FOV) рентгеновской камеры.
8. Если ROI не центрирован в поле зрения, повторите шаги с 5.5 по 5.7 и уточните выравнивание образца, изменяя координаты целевого положения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Разделы 4 и 5 выполняются местным контактом, за исключением раздела 4.2.

6. Настройка сбора данных

1. Проверьте, что необходимая структура файлов/папок в файловой системе DLS создана для хранения исходных данных, файлов метаданных и результатов анализа.
2. Скопируйте samples.csv файл в папку, указанную на шаге 6.1.
3. Обновите время экспозиции камеры и количество проекций, чтобы получить в samples.csv, исходя из структуры образца и желаемого контраста.
4. Определите две группы моторных позиций, называемых положением нагрузки (LP) и сканирующей позицией (SP). LP — это набор, где стадии оптимизируются для загрузки образца, а SP — для томографического сканирования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Раздел 6 выполняется локальным контактом или автоматически создаётся системами DLS.

7. Выполнение сбора данных

1. Закрепите все образцы на правильные положения puck и pins, как указано в samples.csv файле.
2. Для сбора данных используйте рабочий стол Generic Data Acquisition (GDA) — программное обеспечение с открытым исходным кодом, разработанное компанией DLS (https://alfred.diamond.ac.uk/documentation/manuals/GDA_User_Guide/master/introduction.html). Это система на базе Java, используемая в DLS для управления экспериментами и сбора данных. Скриншот приведён на дополнительном рисунке 1.
3. Используйте объект tomomatic в GDA для автоматического изменения образцов, выравнивания образца и томографического измерения.
4. Выдайте команду tomomatic.load (/dls/i13/data/year/... samples.csv) в терминале GDA для загрузки файла. Затем выпустите томоматический. Scan () для выполнения команды.
5. Робот сначала берёт образец из лотка для загрузки и относит его к лазерному сканеру штрих-кодов. После считывания штрих-кода образец перемещается на стадию томографии и устанавливает его. Убедитесь, что весь процесс проходит гладко.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь используется робот Yaskawa с собственной разработанной захваткой для изгиба.
6. После загрузки сэмпла ступени переходят в позицию SP. Затем выполняется функция autoCentrePin внутри томматического скрипта, которая помещает образец в центр вращения (COR). Измерение рентгеновской томографии с помощью робот-переменчика образцов теперь готово к проведению.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, ознакомьтесь с Дополнительным файлом 1 на наличие псевдокода томатического письма.
7. Выполните функцию TomoFlyscan для томографического измерения. Функция сначала собирает 40 проекционных изображений без рентгеновского луча, называемых тёмным изображением (DI), и 40 изображений с рентгеновским лучом, но без образца в пучке, называемых изображением с плоским полем (FI). Эти изображения будут использоваться для нормализации изображения при реконструкции данных.
8. Собирайте проекционные изображения (PI) с образцом в пучке с интервалами углов вращения образца, как указано в samples.csv файле. В данном случае у него 3001 PI изображение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы, от 7.5 до 7.8, проходят один за другим без какого-либо вмешательства человека.

8. Доступ к данным и анализ

1. Получите доступ к сохранённым данным, зайдя в соответствующую файловую систему и папку. Отсканированные данные, упомянутые в предыдущем разделе, сохраняются в двух разных файлах: один с *.nxs и *.hdf с * числовым числом, например: 123456.nxs и 123456.hdf. NXS содержит метаданные для сканирования, тогда как HDF содержит все данные проекционного изображения (связанные данные из NXS).
2. Используйте конвейер реконструкции^{Savu 19} для генерации 2D-срезов из проекционных изображений.
3. Получите доступ и визуализацию восстановленных изображений с помощью 3D-рендерингового программного обеспечения, такого как AVIZO/ImageJ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Завершение разделов 7 и 8 требует скоординированных действий как со стороны пользователей, так и от местных контактов, при этом каждый выполняет отдельные подшаги.

Results

На рисунке 1 показан робот для перемены образцов Yaskawa GP7, установленный на лучевой линии Diamond I13-2 Imaging Imageging. На рисунке 1A показаны робот (1) и собственная конструкция захвата изгиба (2). Этот захватчик может удерживать образец диаметром ≤ 8 мм. На рисунке 1B показаны робот (1) и оптические/рентгеновские камеры (4) и (6), используемые для сбора томографических данных. Робот-гриппер берёт образец из лотка для образцов (3), который может вместить 7 уни-паков с 16 образцами в каждой, как показано на рисунке 1C. Образцы устанавливаются на алюминиевом штифте (5), а томографический сбор данных выполняется с помощью детекторной системы (6). Подробности пунктов (5) и (6) приведены в последнем абзаце вводного раздела. Красная прерванная линия на рисунке 1B указывает направление рентгеновского луча.

Детали образцовой схемы крепления и конструкции захвата с изгибом иллюстрированы на рисунке 2. На рисунке 2A показан цилиндрический пластиковый образец, изготовленный с помощью 3D-печати, приклеенный к основанию образца. Граница образца представляет собой оболочку максимальной высоты образца и диаметра. Красные стрелки указывают положение, где захватчик для изгиба удерживает основание образца, чтобы переместить его из лотка на стадию томографии и обратно. 3D-дизайн захвата с изгибом показан на рисунке 2B. Пальцы захвата приводятся в действие пневматически управляемой приводной трубкой (рисунок 1B, пункт 2). Центральное пространство в захвате имеет диаметр 8,9 мм, как показано на рисунке 2C, что позволяет получить максимальный размер образца 8 мм с полем ~1 мм. На рисунке 2D показана верхняя часть стадии томографии. Алюминиевый штифт установлен поверх двух ортогональных ступеней и магнитного диска, диаметр которого точно соответствует углублению внизу основания образца. Поскольку этот диск магнитный, он прочно удерживает закреплённую основу образца во время томографических измерений.

Для этого репрезентативного эксперимента было отобрано 64 образца насекомых, предоставленных Музеем естественной истории (NHM) в Лондоне. Экземпляры были отобраны так, чтобы представлять разнообразные фенотипы членистоногих, соответствуя размерным ограничениям грипера. Поскольку членистоногие, особенно насекомые, составляют подавляющее большинство известных видов — более миллиона названных видов, их особенно сложно отборить для сравнительных исследований фенотипа. Таким образом, данный образец демонстрирует потенциал этого подхода, используя три классовых клады членистоногих: Arachnida, Entognatha и Insecta, а также более тщательно отбирая среди насекомых для выявления вариаций в семи отрядах, включая четыре из самых богатых видами отрядов, существующих сегодня. Образцы прикреплялись к карточке с помощью клея. Затем карты крепились на образцовые штифты. Монтаж образцов (насекомых) непосредственно на контакты образца избегается, так как сильно поглощающая структура в балке с низкой поглощённостью образцов приводит к образованию артефактов с полосами во время реконструкции, помимо сложности их надёжного крепления на контакты образца. Таблица 1 показывает шаблон samples.csv файл, который пользователь заполнит с необходимыми параметрами для томографии (столбцы A, B, C, E, F, G, H, K). Описание каждого из столбцов приведено в таблице. Столбцы D, I, J и L в input_file заполняются после выравнивания и оптимизации параметров томографии на линии луча. Все 64 образца сначала измерялись объективом 1,25x (FOV 6,7 мм x 5,6 мм) на оптимальном расстоянии распространения рентгеновского излучения (от образца к детектору), а позже те же образцы измерялись с помощью 4x объектива с использованием собственных оптимизированных параметров. После загрузки образцов в лоток и закрепления экспериментальной капсулы инициируется сканирование с помощью GDA.

Автоматическое выравнивание сэмпла выполнялось скриптом, написанным на Python (местоположение файла на GitHub: https://gist.github.com/ndg63276/9b3c5cfe7db26b14930dff3ef889e2bc). Сначала выравнивание образца настраивается с использованием базы образца и комбинации контактов без самого образца. На рисунке 3 показан образцовый штифт, как видно камерой бокового телескопа (камера расположена под углом 90° относительно рентгеновского луча — рисунок 1B, пункт 4), который используется как стандартный образец выравнивания. Изображение с камеры телескопа бинаризовано, чтобы образец можно было обнаружить с фона. Края образца определяются и отмечены белой границей, как показано на рисунке 3. Опорная координата образца — верхняя часть штифта, отмеченная белым кругом на вставке рисунка 3A. Смотря на рентгеновское изображение, ROI образца располагается на COR, а на боковой камере определяется необходимая координата цели, отмеченная синим крестом с двойной стрелкой и красной точкой (рисунок 3B). Эта настройка целевого положения позволяет разместить образец не только на COR, но и на несколько мм выше/ниже или немного смещённо по центру, если это необходимо. После загрузки образца на стадии томографии выполняется функция автоматического центрирования. Скрипт сначала перемещает образец в целевую позицию (рисунок 3B) и идёт под углом 0°. Далее он перемещает образец под углом 90° (рисунок 3C) и определяет, сколько образца нужно переместить, чтобы поместить образец в центр вращения (COR). Обычно это занимает около 15-20 секунд. Образец теперь находится на COR (рисунок 2D), и COR уже выровнен с центром камеры. Система готова к томографическому снятию.

В этом исследовании насекомых с NHM было проведено 128 томографических сканирований без участия человека. Измерение заняло в общей сложности 17 часов. Каждое сканирование занимало около 8 минут. Такой эксперимент без использования робота занял бы около 20–25 минут на томографию. Это означает, что томографические сканирования с помощью роботов проходят в 3-4 раза быстрее, чем ручное сканирование в данном случае. Таблица 2 показывает типичный файл журнала, сгенерируемый в конце пакетного сканирования робота, включая параметры, необходимые для связи каждого номера сканирования с соответствующим выборкой. Дополнительные детали приведены в таблице 2 .

На рисунке 4 показаны нормализованные проекционные изображения одного из образцов — насекомого (класс — Insecta, отряд — Coleoptera), снятых во время упомянутого выше томографического эксперимента с увеличением 1,25x и 4x. Верхний ряд, рисунок 4A-C, показывает образец с изображением 1,25x, а затем тот же образец был собран с 4x, то есть рисунок 4D-F. Рисунок 4 A–F показывает проекционные изображения, полученные под углом 0°, 90° и 180°. Жёлтый прямоугольник показывает поле зрения увеличенных проекционных изображений, полученных с помощью 4x объектива. Важно отметить, что после загрузки образцов на лоток, показанный на рисунке 1C, все процессы проходили без участия человека. Обратите внимание, что эти два скана были сделаны с интервалом ~8,5 часа. Это указывает на стабильность и воспроизводимость установки.

На рисунке 5 показаны горизонтальные или поперечные срезы из набора томографических реконструкционных срезов образца, указанного на рисунке 4. Оба среза 1,25x (рисунок 5A) и 4x (рисунок 5B) нанесены без обрезания изображений и имеют размер 2510 x 2510 пикселей. Срезы хорошо центрированы внутри поля зрения, что показывает, что увеличение в область с большим увеличением возможно без необходимости физического вмешательства.

Представленные здесь результаты демонстрируют, что внедрение роботизированной системы обмена образцами в экспериментах синхротронной микротомографии даёт несколько значимых преимуществ. К ним относятся повышенная пропускная способность, повышение операционной эффективности и возможность проведения сканирования с множественным увеличением (увеличение) без необходимости участия человека. Учитывая количество образцов, требующих сканирования, например, в исследовании NHM, представленном здесь, невозможно получить статистически надёжные и последовательные выводы с помощью ручного сканирования.

Рисунок 1: Изображение робота и экспериментальной томографической установки, установленной в лучевой линии I13-2. (A) Робот (1) с собственной конструкцией захвата для изгиба (2). (B) Лоток для загрузки образцов (3) и стадия томографии (5). Оптическая камера (телескопическая камера), обозначенная как (4), используется для выравнивания образцов на COR. Система детектора (6), используемая для измерения, содержит несколько моторизованных объективов для автоматического изменения поля зрения и детектор pco.edge 5.5. Красная пунктирная стрелка обозначает направление рентгеновского луча. (C) Изображение лотка для загрузки образцов с 7 таблетками, и каждая таблетка может вместить до 16 образцов, установленных на комбинации основания и штифтов для образца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Детали схемы крепления образца и конструкции захвата изгиба. (A) Изображение 3D-печатного пластикового имитатора, установленного на основе образца, отражающего максимальную огибающую образца, которую может обрабатывать захватчик изгиба. Красные стрелки указывают положение, где захватчик держит основание для образца. (B) 3D-дизайн захвата изгиба. Пальцы захвата приводятся в действие для удержания или освобождения основания образца. (C) Вертикальный чертеж захвата с размерами. Максимальное отверстие в центре составляет 8,9 мм; поэтому максимальный допустимый размер выборки составляет ≤ 8 мм. (D) Изображение верхней части томографической стадии. Алюминиевый штифт (обозначенный синей стрелкой) установлен в верхней части двух ортогональных ступеней. Магнитный диск закрепляется на верхней части штипа, на котором размещается основание для образца (вместе с образцом) захватом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Снимки с видеографика процедуры выравнивания COR с использованием камеры бокового телескопа. (A) Изображение штифта выравнивания непосредственно перед началом процедуры выравнивания. Синий двуглавый крест с центральной красной точкой — это целевая позиция, которая совпадает с COR стадии вращения томографии. Вставка показывает увеличенное изображение верхней части штифта, показывающее обнаруженный центр выборки как по высоте, так и по ширине. (B) Штифт выровнен по целевой позиции под углом 0°. (C) Штифт повернут на 90°, и он находится вне цели. (D) Штифт выровнен по целевой позиции под углом 90°. Теперь штифт выровнен в обоих ортогональных направлениях; поэтому образец будет вращаться в центре камеры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Нормализованные проекционные изображения насекомого, собранные объективом 1,25x и 4x. Насекомое принадлежало к классу Insecta, отряд Coleoptera. Это два из 128 томографических сканирований. Насекомое было приклеено к бумаге и прикреплено к штифту для образца. Проекционные изображения с объективом 1,25x находятся под углом (A) 0°, (B) 90°, (C) 180°, а также 4x при (D) 0°, (E) 90° и (F) 180°. Набор томографических сканирований 1,25x и 4x был собран за одну сессию без участия человека. Набор изображений с разрешением 1,25x даёт полный обзор образца, а набор 4x изображений показывает возможность масштабирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5. Сравнение идентичного томографического среза, полученного с использованием двух разных полей зрения. Единственный реконструированный срез из томографии проекционных изображений, показанный на рисунке 4 для (A) 1,25x и (B) 4x увеличений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 1: Типичный samples.csv файл, который пользователь предоставляет с параметрами томографии. Этот файл читается томатическим скриптом Python, используемым для сбора данных. Столбцы A (описание образца), B (идентификатор puck), C (слот в шайбе), E (шаг вращения в томографии), F (число FI), G (число DI), H (увеличение для использования) и K (приоритет слота) заполняются пользователем. Столбцы D (время экспозиции), I (расстояние распространения рентгеновского излучения между образцом и камерой), J (движение камеры по лучу для установки COR в центр камеры) и L (штрихкод базы образца) заполняются после выравнивания и предварительной оптимизации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Типичный выходной файл журнала, сохранённый как Output_file.txt после сканирования всех образцов . Файл содержит все входные параметры, а также содержит штрихкод отсканированного образца (столбец M), путь к отсканированным метаданным и файлам изображений (столбец N), а также положение двигателя, используемого для сбора FI (столбец O). По сути, этот выходной файл предоставляет необходимую информацию для реконструкции и анализа данных. Поскольку в столбце A входного файла не было указано введение, этот столбец заполняется текущим количеством сканирования, а также номерами puck и pin-кодов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительный файл 1: Псевдокод, описывающий скрипт, используемый для работы робота в качестве смены образцов. Файл описывает процедуру автоматического монтажа образцов, чтения кода Data Matrix, автоматического выравнивания образца и выполнения томографического сканирования . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 1: Скриншот общего графического интерфейса сбора данных. Этот интерфейс позволяет настраивать базовые параметры камеры, визуализировать образец в реальном времени и инициировать томографические снимки. Сканирование можно запускать с помощью кнопки на экране (только ручное сканирование) или через командную строку, обозначенную жёлтым прямоугольником в нижнем центре скриншота. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Фотография стандартной шайбы SPINE (слева) и шапки (справа). Положения штифтов, показанные красным цветом, на которых установлены основания образцов, нумеруются, начиная с позиции напротив выемки на центральном удерживающем штифе. Номер 7267 (отмеченный белым цветом) — это идентификационный номер шайбы. Puck Cap можно крепить к шайбе для защиты образцов во время транспортировки или хранения. Пожалуйста, убедитесь, что размеры выборок совместимы перед установкой крышки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Discussion

Подготовка и выравнивание образцов — два ключевых шага для правильной и эффективной работы автоматического робота-сменщика^{образцов. 11}. Размер выборки и требования к монтажу приведены в разделе 2 (Протокол). По сути, диаметр образца должен быть 8 мм или меньше и хорошо центрирован на основании^{образца 12}. Это ограничение задаётся размерностями захвата. Кроме того, все образцы в одном измерении должны быть одинаковой высоты, чтобы расположение образцов в центре вращения было одинаковым по всем образцам. Если робот выровнен для эксперимента, то запуск другого эксперимента с роботом-изменяющим образцы полностью автоматизирован, за исключением настройки интересующей области образца. Это объясняется в разделе с репрезентативными результатами, рисунок 3. Также важно отметить, что это часть процесса выравнивания, который выполняет контакт лучевой линии (локальный контакт). После установки этого параметра все измерения образца проводятся без участия человека. С точки зрения пользователя, измерения полностью автоматизированы. На сегодняшний день используются только основы для образцов и контакты образца от Molecular Dimensions Ltd; однако существуют и другие поставщики, такие как MiTeGen и Hampton Research, которые производят образцовые базы и контакты образцов в стиле SPINE.

Более крупные захваты для образцов, предназначенные для хранения образцов диаметром до 12 мм, в настоящее время находятся в стадии разработки и испытаний. Это позволит роботу работать с более крупными образцами, например, помещёнными в микроцентрифугные пробирки и установленными на основе образца. Улучшенная конструкция захвата могла бы включать механизм, который подходит к образцу сбоку, тем самым устраняя существующие ограничения по размеру выборки. Кроме того, модернизация линии пучка увеличит пропускную способность в порядок, что позволит сканировать более 3 000 образцов в день. Это, в свою очередь, позволит собрать статистически значимые наборы данных, включающие примерно 30 000 образцов, в течение 10 дней с момента прохождения пучка. В ближайшем будущем мы реализуем новый конвейер по реконструкции томографии под названием HTTomo.

Следует отметить, что такие параметры, как расстояние распространения луча (от образца до детектора), время экспозиции, количество проекций и т.д., должны быть оптимизированы заранее, как и в любом другом эксперименте по синхротронной рентгеновской томографии. Ещё одно ограничение заключается в том, что этапы, связанные с экспериментом, такие как 6-осевая обработка образца, стадии томографии и манипуляции камерой, должны находиться в определённом положении для загрузки и разгрузки образца. Это означает, что этапы необходимо перемещать туда-сюда во время загрузки и разгрузки образцов.

В заключение, высокопроизводительная томография может выполняться с помощью робота, который меняет образцы, что делает процесс как минимум в 4-10 раз быстрее и сокращает или устраняет мертвое время по сравнению с ручной работой. Экспериментальная автоматизация с роботами также позволяет нам более эффективно направлять персонал, поскольку для проведения измерений требуется меньше людей. Измерение статистически значимых наборов данных важно для многих научных областей, где требуется надёжный и достаточный объём данных для решения научного случая. Использование робота может значительно помочь в таких задачах.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air-bearing rotation stage	Aerotech, Inc.	https://www.aerotech.com/wp-content/ uploads/2021/01/abrt-data-sheet.pdf	Томограпфическая поворотная сцена
AVIZO	ThermoFisher scientific		Коммерческое программное обеспечение для визуализации и анализа данных
Cryocap -MiTeGen	MiTeGen LLC	https://www.mitegen.com/product/ reusable-goniometer-base-styles/	Альтернативный поставщик CryoCap
CryoCap-Hampton research	Hampton research	https://hamptonresearch.com/ product-CrystalCap-SPINE-HT-445.html	Альтернативный поставщик CryoCap
Cryocaps( MD7-401) and Cryopins(MD7-410)	Calibre Scientific	https://www.moleculardimensions.com/ products/magnetic-cryovials-and-cryocaps	Используется для установки образцов
Detector Optics	Olympus/Evident Scientific	https://evidentscientific.com/en/objective-finder? creative=651972731238&keyword =olympus+objectives&matchtype= e&network=g&device=c&campaign id=19865307548&adgroupid=144 087466781&gad_source=1&gad_ campaignid=19865307548&gbraid =0AAAAADMIOOmWDa2WC5VP2 Ngxlqao8dyWe&gclid=Cj0KCQiAhtv MBhDBARIsAL26pjFYUqjLVZ1Miz p2W7eGzD2SEPNTjxiA87Dry6un 1Fx6GplHQjuBR94aAs1xEALw_wcB	Объектив и фото-окуляр
GDA	Diamond Light Source Ltd.	https://www.diamond.ac.uk/Users/Experiment -at-Diamond/IT-User-Guide/Software/Data-Acq/GDA.html	Общее программное обеспечение для сбора данных
Hexapod	PI miCos GmbH	https://www.physikinstrumente.co.uk/en/pro ducts/6-axis-hexapods-parallel-positioners	6-осевая сцена для выравнивания томографии и манипуляции образцами
ImageJ	Разработано в Национальном институте здравоохранения, Университет Висконсина	https://imagej.net/ij/	Программное обеспечение с открытым исходным кодом для обработки и визуализации изображений
pco.edge 5.5 sCMOS camera	PCO (PCO AG / Excelitas Technologies)	https://www.excelitas.com/product-category/ pcoedge-cooled-scmos-cameras	Рентгеновская камера, используемая для томографической визуализации
SAVU	Diamond Light Source Ltd.	https://www.diamond.ac.uk/Home.html ;jsessionid=8977FA8A10694BFA2AA DFD5D0D23B320	Трубопровод реконструкции томографии
Scintillators	CRYTUR, spol. S r.o	https://www.crytur.com/materials/luag-ce/	Оптика искровых светильников
Universal V1-puck( Uni-puck)	Calibre Scientific	https://www.moleculardimensions. com/products/uni-pucks-and-accessories	Образцы устанавливаются на Uni-puck для взятия роботом